丁苯酞對(duì)兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響

張雅馨，蘇杰，黃帥，張新躍，劉穎，王林洪

作者單位：華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000

近年來，由多種缺血性眼病所引發(fā)的視網(wǎng)膜的缺血再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)病例逐年增多，嚴(yán)重危害著病人的健康。視網(wǎng)膜是眼球后部的一層薄膜，可以看作是大腦的一部分，主要是由叢狀層和神經(jīng)纖維層構(gòu)成的白質(zhì)、光感受器和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞構(gòu)成的灰質(zhì)和Müller細(xì)胞及小星型細(xì)胞構(gòu)成的神經(jīng)膠質(zhì)組成，對(duì)缺血缺氧環(huán)境極為敏感，且易受損傷，而且主要供給視網(wǎng)膜血供的終末動(dòng)脈—視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈極易發(fā)生阻塞、缺血，一旦發(fā)生便可極快地?fù)p傷視網(wǎng)膜。RIRI是臨床常見疾病，即缺血性眼病病人視網(wǎng)膜在恢復(fù)供血后，視功能不升反降，主要發(fā)生于糖尿病、視網(wǎng)膜中央靜動(dòng)脈阻塞、缺血性病變、青光眼等疾病中，其視神經(jīng)損害主要表現(xiàn)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)的凋亡[1]，隋源等[2]研究指出，RIRI中神經(jīng)元的丟失也主要集中體現(xiàn)在RGCs。因此，視網(wǎng)膜缺血性疾病的預(yù)防及早期治療極為重要。已有研究表明，丁苯酞對(duì)于腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)功能損傷具有很強(qiáng)的保護(hù)作用[3]，筆者自2016年11月至2017年1月就丁苯酞對(duì)RIRI中細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性新西蘭白兔80只，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，外眼及眼底檢查均正常，飼養(yǎng)環(huán)境相同，均由華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)中充分保證動(dòng)物福利、給予動(dòng)物人道關(guān)懷，動(dòng)物處置也符合倫理學(xué)原則。

1.2 主要試劑丁苯酞(恩必普，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；封閉用正常山羊血清工作液SP-9001(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；抗P53多克隆抗體、抗Bcl-2多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；山羊超敏二步法檢測(cè)試劑盒(二抗)(北京中杉)等。

1.3 模型制備采用前房高眼壓灌注法[4]制備缺血再灌注模型。術(shù)前給予丙美卡因點(diǎn)眼，復(fù)方托吡卡胺點(diǎn)眼至瞳孔完全散大后固定白兔，25%烏拉坦耳緣靜脈麻醉，劑量4 mL/kg。麻醉成功后，白兔取仰臥位，將4.5號(hào)頭皮針(連接250 mL 0.9%鹽水袋)刺入前房，鹽水袋垂直于兔眼，高度150 cm，此時(shí)眼底鏡可見視網(wǎng)膜缺血水腫、蒼白，持續(xù)1 h。對(duì)照組不予任何處理。氯霉素全程間斷點(diǎn)眼保持角膜濕潤，預(yù)防感染。

1.4 分組與給藥采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成對(duì)照組(10只)、RIRI組(35只)、給藥組(35只)三組，其中對(duì)照組再分為6 h、24 h兩個(gè)亞組(排除時(shí)間和環(huán)境因素)，RIRI組和給藥組均再分7個(gè)亞組，分別為再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：未到達(dá)預(yù)定時(shí)間死亡及造模失敗、有嚴(yán)重手術(shù)并發(fā)癥的白兔。將丁苯酞軟膠囊用食用麻油稀釋到10 mg/mL。治療組于造模成功后開始灌胃給藥，給藥劑量為40 mg/kg，每日1次，直至處死。對(duì)照組和RIRI組每日給予相同體積食用麻油灌胃。

1.5 標(biāo)本的制備將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照規(guī)定時(shí)間于耳緣靜脈過量麻醉處死后摘取眼球，快速置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上。將眼球壁自視乳頭處縱行剪開，在平行、垂直于視神經(jīng)平面各取一塊約1 cm×0.5 cm視網(wǎng)膜組織置于包埋盒中，經(jīng)過水洗、脫水、透明、石蠟包埋、切片，分別行HE染色、免疫組化法檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、抑癌基因(P53)表達(dá)量及TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 結(jié)果的判讀封片后，每張切片隨機(jī)取4個(gè)面積為0.2 mm×0.2 mm的高倍鏡視野(400×)觀察組織形態(tài)變化，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析技術(shù)系統(tǒng)分析，計(jì)數(shù)各組陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化對(duì)照組兔視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)與人相似。RIRI組1 h視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層及內(nèi)叢狀層組織出現(xiàn)輕度水腫，厚度增加，染色較淡；6～24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，組織水腫逐漸加劇，其中神經(jīng)纖維層和內(nèi)叢狀層最明顯，可見RGCs排列稀疏；24 h視網(wǎng)膜內(nèi)界膜不平滑,全層均可見高度水腫，神經(jīng)纖維層明顯薄變，內(nèi)核層細(xì)胞雜亂排列，RGCs數(shù)量大幅減少，細(xì)胞變性，邊界不清(圖1)。48 h、72 h各層組織水腫明顯減輕；120 h、7 d，視網(wǎng)膜水腫大幅消退，內(nèi)層明顯萎縮，RGCs數(shù)量減少且稀疏排列。給藥組視網(wǎng)膜缺血再灌注后視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化與RIRI組相比均較后者輕，可見丁苯酞能明顯的減輕缺血再灌注后視網(wǎng)膜組織的損傷。

2.2 Bcl-2和P53蛋白的表達(dá)

2.2.1Bcl-2的表達(dá) Bcl-2具有抑制凋亡的作用，其陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)的棕黃色染色。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組檢測(cè)到極少陽性染色細(xì)胞，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯差異，而RIRI組兩時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示RIRI可以使Bcl-2表達(dá)增加(表1)。RIRI組在缺血再灌注后1 h時(shí)可見極少數(shù)陽性表達(dá)；6 h、12 h神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層陽性表達(dá)逐漸增多；24 h陽性表達(dá)到達(dá)高峰，除神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層外，內(nèi)核層也可見陽性表達(dá)，外核層及色素上皮層未見陽性表達(dá)(圖2)；48 h、72 h可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層陽性表達(dá)逐漸下降，至7 d時(shí)已幾乎無陽性細(xì)胞表達(dá)。給藥組Bcl-2表達(dá)變化趨勢(shì)同RIRI組相似，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)強(qiáng)度較RIRI組明顯增強(qiáng)(7 d除外)，同RIRI組各時(shí)段相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 RIRI組和對(duì)照組Bcl-2在再灌注后6 h、24 h陽性細(xì)胞數(shù)/(n=5，個(gè)/平方毫米，

表2 RIRI組和給藥組Bcl-2再灌注后各時(shí)間段陽性細(xì)胞數(shù)/(n=5，個(gè)/平方毫米，

注：1.a組內(nèi)1 h與6 h比,P<0.01；2.b組內(nèi)12 h與6 h比,P<0.01；3.c組內(nèi)24 h與12 h比,P<0.01；4.d組內(nèi)48 h與24 h比,P<0.01；5.e組內(nèi)72 h與48 h比,P<0.01；6.f組內(nèi)7 d與72 h比,P<0.01

2.2.2P53的表達(dá) p53能通過下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)而產(chǎn)生促節(jié)細(xì)胞凋亡作用，其陽性表達(dá)為細(xì)胞核質(zhì)的棕色或淺棕色染色。對(duì)照組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞檢測(cè)到極少陽性表達(dá)，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯差異，而RIRI組兩時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示RIRI可以使P53表達(dá)增加(表3)。RIRI組在缺血再灌注后1 h時(shí)可見極少數(shù)陽性表達(dá)；6 h、12 h神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見陽性表達(dá)逐漸增多；24 h陽性表達(dá)到達(dá)高峰，除神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層外，內(nèi)核層也可見陽性表達(dá)，外核層及色素上皮層未見陽性表達(dá)(圖3)；48 h、72 h可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層陽性表達(dá)逐漸下降，至7 d時(shí)陽性細(xì)胞表達(dá)較少。給藥組P53表達(dá)變化趨勢(shì)同RIRI組相似,但各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱,同RIRI組各時(shí)段相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡凋亡陽性細(xì)胞表達(dá)于細(xì)胞核，顏色為棕黃色。對(duì)照組可見極少凋亡陽性細(xì)胞，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯差異，而RIRI組兩時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示RIRI可以使凋亡增加(表5)。RIRI組再灌注后1 h神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層已經(jīng)出現(xiàn)少量凋亡陽性表達(dá)；24 h前陽性表達(dá)呈上升趨勢(shì)，24 h陽性表達(dá)出現(xiàn)峰值(除神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層外，內(nèi)核層、外核層也可見陽性細(xì)胞)(圖4)；48 h、72 h凋亡細(xì)胞數(shù)目呈下降趨勢(shì)；7 d時(shí)可見視網(wǎng)膜凋亡陽性細(xì)胞數(shù)極少，細(xì)胞核大量丟失。給藥組凋亡細(xì)胞表達(dá)變化趨勢(shì)同RIRI組，但各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱(7 d除外)，同RIRI組各時(shí)段相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表6)。

表3 RIRI組和對(duì)照組P53在再灌注后6 h/24 h陽性細(xì)胞數(shù)/(n=5，個(gè)/平方毫米，

表4 RIRI組和給藥組P53再灌注后各時(shí)間段陽性細(xì)胞數(shù)/(n=5，個(gè)/平方毫米,

注：a組內(nèi)1 h與6 h比,P<0.01；b組內(nèi)12 h與6 h比,P<0.01；c組內(nèi)24 h與12 h比,P<0.01；d組內(nèi)48 h與24 h比,P<0.01；e組內(nèi)72 h與48 h比,P<0.01；f組內(nèi)7 d與72 h比,P<0.01

表5 RIRI組和對(duì)照組在再灌注后6 h、24 h凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/(n=5，個(gè)/平方毫米，

3 討論

丁苯酞化學(xué)名稱為消旋-3-正丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide)，是我國近年自主研發(fā)的一類新藥。既往大量的實(shí)驗(yàn)研究及臨床觀察證實(shí)了丁苯酞在人體內(nèi)靶點(diǎn)眾多，能廣泛分布于胃、腸、腦、脂肪等器官，直接透過血-腦屏障，能作用于心腦缺血疾病的多個(gè)病理環(huán)節(jié)，對(duì)腦缺血性疾病、血栓形成、血小板聚集、甚至急性缺血性腦卒中等疾病起到明顯改善作用，不僅能改善線粒體功能，還對(duì)腦部缺血區(qū)域的血流量、微循環(huán)、清除自由基和腦部功能代謝均起到改善作用，促進(jìn)功能恢復(fù)的同時(shí)無明顯不良反應(yīng)及毒副作用[5-10]。Xu等[11]實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了丁苯酞對(duì)腦組織缺血性神經(jīng)損傷有很強(qiáng)的保護(hù)作用，可最大程度恢復(fù)神經(jīng)功能。有學(xué)者[12-13]研究丁苯酞對(duì)凋亡相關(guān)因子的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丁苯酞對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)Bax的表達(dá)有關(guān)。袁曉勇[14]通過研究家兔體內(nèi)丁苯酞藥動(dòng)學(xué)發(fā)現(xiàn)其口服給藥吸收迅速，30 min即可達(dá)最大血藥濃度，且能迅速消除。雖然口服給藥生物利用度較低，但大量實(shí)驗(yàn)研究表明口服給藥方式在體內(nèi)諸多器官廣泛分布，以腦組織為主要靶器官，能起到有效的抑制細(xì)胞凋亡、減輕神經(jīng)損傷的作用。本次實(shí)驗(yàn)也表明了丁苯酞對(duì)RCGs的凋亡具有較好的保護(hù)作用。

表6 RIRI組和給藥組再灌注后各時(shí)間段凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/(n=5，個(gè)/平方毫米，

注：1.a組內(nèi)1 h與6 h比，P<0.01；2.b組內(nèi)12 h與6 h比，P<0.01；3.c組內(nèi)24 h與12 h比，P<0.01；4.d組內(nèi)48 h與24 h比，P<0.01；5.e組內(nèi)72 h與48 h比，P<0.01；6.f組內(nèi)7 d與72 h比，P<0.01

細(xì)胞凋亡的發(fā)生由凋亡基因來進(jìn)行調(diào)控，從一些早期的研究我們可以得知在視網(wǎng)膜缺血再灌注模型中，凋亡細(xì)胞存在于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層以及內(nèi)核層[15]。任玉偉和宿華威[16]的實(shí)驗(yàn)研究表明Bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡作用，而P53則作為調(diào)控Bax/Bak的上游調(diào)控機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。本次實(shí)驗(yàn)通過等劑量的丁苯酞與食用麻油灌胃給藥，可見在缺血再灌注損傷后1～24 h Bcl-2/P53表達(dá)均明顯增加，24 h達(dá)到高峰，24 h后則表達(dá)逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在給藥組中我們可以見到Bcl-2的表達(dá)均比同一時(shí)間點(diǎn)的RIRI組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)意義(7 d組除外)；P53的表達(dá)給藥組均低于同一時(shí)間點(diǎn)的RIRI組，差異有統(tǒng)計(jì)意義，證明了丁苯酞可以通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)P53的表達(dá)起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。而TUNEL試驗(yàn)中給藥組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)均小于RIRI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7 d組除外)，也同樣證實(shí)了丁苯酞對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡起到了保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中7 d時(shí)凋亡和Bcl-2蛋白的陽性表達(dá)的組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能是與在7 d時(shí)觀察時(shí)間過長(zhǎng)，RIRI對(duì)視網(wǎng)膜的損傷逐漸減輕及視網(wǎng)膜自身修復(fù)作用逐漸加強(qiáng)有關(guān)。

從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果整體來看可以得出，丁苯酞能上調(diào)Bcl-2和下調(diào)P53的表達(dá)，減少凋亡細(xì)胞的表達(dá)數(shù)目，對(duì)RIRI后的細(xì)胞凋亡起到了一定的保護(hù)作用，提示丁苯酞可以透過血-視網(wǎng)膜屏障。但并未能完全避免凋亡的發(fā)生，可能的原因?yàn)橐坏┑蛲鰴C(jī)制啟動(dòng)，凋亡的發(fā)生可能是無法避免的。本次實(shí)驗(yàn)沒有給予不同濃度的劑量，故不同藥物濃度對(duì)RIRI的影響有待進(jìn)一步深入研究。

(本文圖1～4見插圖7-1)