甲潑尼龍預(yù)處理對機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷大鼠JNK信號通路的影響

崔秀玲 瞿敏 托景堂

滄州市中心醫(yī)院麻醉二科061001

機(jī)械通氣是救治危重癥患者及術(shù)中呼吸支持的重要手段,同時(shí)機(jī)械通氣還可導(dǎo)致肺損傷或加重原有的肺損傷稱為機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷[1]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族重要成員之一,廣泛參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化和凋亡、胚胎發(fā)育等多種生理病理過程。有報(bào)道指出,JNK 信號通路參與了機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷的發(fā)生[2-3]。甲潑尼龍屬中效糖皮質(zhì)激素是治療各種炎性疾病的常用藥物,具有強(qiáng)大的抗炎及免疫抑制作用,能有效消除肺組織水腫,能減輕呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷[2]。本研究通過制備大鼠大潮氣量機(jī)械通氣急性肺損傷模型,觀察甲潑尼龍預(yù)處理對大鼠肺組織炎癥、水腫、細(xì)胞凋亡的影響,并探討其機(jī)制,為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物來源、分組及處理 清潔級雄性SD大鼠80只,購至河北省實(shí)驗(yàn)動物中心,實(shí)驗(yàn)動物合 格 證 號：SCXK(冀)2015-0007,批 號：37001800000321,體質(zhì)量250～300 g。所有大鼠均按照實(shí)驗(yàn)動物管理和使用指南進(jìn)行飼養(yǎng)和處理,于恒溫環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)經(jīng)滄州市中心醫(yī)院倫理委員會核實(shí)批準(zhǔn)。將80只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(C 組)、機(jī)械通氣組(V 組)、甲潑尼龍(意大利Pfizer Manufacturing Belgium NV 公司)組(Mp組)、SP600125+甲潑尼龍組(SMp組),各20只。C 組不行機(jī)械通氣,自主呼吸空氣4 h；V 組、Mp組、SMp組大潮氣量機(jī)械通氣4 h,機(jī)械通氣前30 min,SP600125+甲潑尼龍組(SMp組)給予JNK 抑制劑SP600125(中國深圳晶美公司)30μg/100 g皮下注射；機(jī)械通氣前20 min,Mp組、SMp組分別靜脈輸注甲潑尼龍10 mg/kg；V組靜脈給予等容量0.9%氯化鈉。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 氧合指數(shù)(oxygenation index,OI) 采集各組大鼠插管即刻及機(jī)械通氣1、2、4 h 時(shí)(T1-4)股動脈血樣0.2 ml采用i-STAT1 型血?dú)夥治鰞x(美國雅培公司)行血?dú)夥治?記錄PaO2并計(jì)算OI。OI=PaO2/FiO2。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白含量、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)、肺通透指數(shù)(lung permeability index,LPI)及肺濕/干重(wet/dry weight,W/D) T4 時(shí)取各組大鼠股動脈血樣2 ml 4 ℃下3 000 r/min離心15 min,離心半徑7.9 cm,分離血清測定血漿蛋白濃度。取血后按照實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求經(jīng)動脈放血處死大鼠,開胸結(jié)扎大鼠右側(cè)肺門,采用4 ml生理鹽水灌洗左肺3 次,回收BALF,于4 ℃下1 500 r/min離心10 min,離心半徑15 cm,取上清液,-80 ℃保存。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)檢測BALF中的TNF-α和MIP-2的濃度。采用考馬斯亮藍(lán)法檢測BALF 中蛋白含量。LPI=BALF 蛋白濃度/血漿蛋白濃度。取左肺下葉稱肺濕重,然后置于75℃干燥箱中48 h烤至恒重后稱干重,計(jì)算W/D。

1.2.3 髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)與細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1) 取出右肺中葉,迅速存于液氮中以備勻漿,按重量體積比1∶19加入緩沖液制備5%組織勻漿,測定肺組織MPO 活性。取肺組織切片,采用免疫組織化學(xué)法檢測ICAM-1的表達(dá)水平。

1.2.4 肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI) 采用TUNEL 法光鏡下隨機(jī)選取各組大鼠肺泡區(qū)10個(gè)高倍視野(×400),觀察細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算AI,AI=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 肺組織病理學(xué)觀察及肺泡損傷率(alveolar injury rate,AIR) 取各組大鼠右肺下葉組織左肺下葉約(1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)組織,經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE 染色,光鏡下(×200)觀察肺組織病理學(xué)結(jié)果。光鏡下連續(xù)觀察200個(gè)肺泡計(jì)算AIR,即損傷肺泡計(jì)數(shù)占總肺泡計(jì)數(shù)的百分比。

1.2.6 RT-PCR法檢測肺組織JNK m RNA 表達(dá) 取大鼠右肺上葉組織100 mg,采用TRIzol法提取總 RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas Life Science公司)行cDNA 擴(kuò)增。采用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參β-actin 及JNK 引物。β-actin(產(chǎn)物片斷405 bp)：上游引物序列為5'-ATGGTATTCTTGCCTGAC-3',下游引物序列為 5'-AATGTACGTGGATACTGAG-3'； JNK(產(chǎn)物片斷400 bp)：上游引物序列為5'-AATCCTGAGCAAAGCTGAGAAC-3',下游引物系列為 5'-CGTACAAAACCAATCACGAGAA-3'。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、10 min,95 ℃、30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、30 s,33個(gè)循環(huán)后72 ℃、10 min。4 ℃終止反應(yīng)。采用Imager圖像分析儀測定各條帶吸光度值,以JNK 吸光度值與β-actin吸光度值之比代表JNK mRNA 的表達(dá)水平。

1.2.7 Western blotting 法檢測JNK、磷酸化JNK(p-JNK)表達(dá) 取各組大鼠右肺上葉組織100 mg,BCA 標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白濃度,取40μg蛋白上樣經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜,室溫下用封閉液封閉2 h后加入一抗(美國Santa Cruz公司)兔抗大鼠p-JNK、JNK、β-actin稀釋度(1∶500),4 ℃過夜。次日洗膜后加入山羊抗兔二抗(中國北京中杉金橋生物科技有限公司)稀釋度(1∶500),室溫孵育1.5 h,再次洗膜后置于NBT/BCIP 顯色液避光顯色,掃描蛋白印記圖,采用Reveal型lmager圖像分析儀(美國Bio-Rad公司)進(jìn)行半定量分析,以目的蛋白條帶吸光值比內(nèi)參β-actin條帶吸光值來反應(yīng)目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠OI比較 SMp組與V 組T3、T4時(shí)OI較 T1 時(shí)降低(F=12.16,P＜0.05)；V組與SMp 組 T3、T4 時(shí) OI較 C 組降低(F=11.95,P＜0.05)；與V 組比較,Mp組與SMp組T3、T4時(shí)OI升高(F=10.86,P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)OI比較(mm Hg,)

表1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)OI比較(mm Hg,)

注：1 mm Hg=0.133 kPa；C 組為對照組；V 組為機(jī)械通氣組；Mp組為甲潑尼龍組；SMp組為SP600125+甲潑尼龍組；OI為氧合指數(shù)；與T1時(shí)比較,F =12.16,a P ＜0.05；與C 組比較,F =11.95,b P ＜0.05；與 V 組比較,F =10.86,c P ＜0.05

組別 鼠數(shù) T1 T2 T3 T4 C組 20 585±33 565±25 561±31 553±25 V 組 20 583±32 503±28 251±13ab 213±11ab Mp組 20 581±29 574±33 559±21c 548±15c SMp組 20 586±34 521±26 271±14ab 224±13ab

2.2 各組大鼠 W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 比較 與C 組比較,V 組與SMp組肺組織W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 升 高(F=4.05、3.78、12.95、4.10、3.14,P值 均 ＜0.05),Mp組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與V 組比較,Mp組與SMp組肺組織 W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 降低(F=4.05、3.78、12.95、4.10、3.14,P值均＜0.05)；與Mp組比較,SMp 組肺組織 W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 升高(F=4.05、3.78、12.95、4.10、3.14,P值均＜0.05),見表2。

2.3 各組大鼠BALF 中總蛋白、TNF-α、MIP-2濃度的比較 與C 組比較,V 組與SMp組BALF中總蛋白、TNF-α、MIP-2 升高(F=19.45、13.68、12.53,P值均＜0.05),Mp組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與V 組比較,Mp組與SMp組BALF 中總蛋白、TNF-α、MIP-2濃度降低(F=19.45、13.68、12.53,P值均＜0.05)；與Mp組比較,SMp組BALF 中總蛋白、TNF-α、MIP-2 濃度升高(F=19.45、13.68、12.53,P值均＜0.05),見表3。

2.4 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果 光鏡下C組肺組織形態(tài)正常,肺泡完整,肺泡腔無滲出及出血,肺間質(zhì)未見增厚水腫,罕見中性粒細(xì)胞。V 組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺間質(zhì)水腫,肺泡間隔增厚,肺泡內(nèi)出血、水腫、紅細(xì)胞漏出、炎性細(xì)胞浸潤。Mp組較V 組病理損傷減輕,肺泡形態(tài)正常,肺泡間隔輕微增厚,肺間質(zhì)輕度水腫,肺泡腔無明顯出血及滲出,罕見中性粒細(xì)胞。SMp組肺損傷介于V組與Mp組之間。見圖1。

表2 各組大鼠W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 的比較()

表2 各組大鼠W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 的比較()

注:C組為對照組；V 組為機(jī)械通氣組；Mp組為甲潑尼龍組；SMp組為SP600125+甲潑尼龍組；W/D 為濕/干比值；LPI為肺通透指數(shù)；AIR 為肺泡損傷率；ICAM-1為細(xì)胞間黏附分子-1；MPO 為髓過氧化物酶；與C組比較，a P ＜0.05；與V 組比較,b P ＜0.05；與Mp組比較,c P ＜0.05

組別 鼠數(shù) W/D LPI(×10-3) AIR(%) ICAM-1(μg/L) MPO(U/g)C組 20 4.58±0.21 2.17±0.24 14.88±3.22 1.75±0.21 0.84±0.86 V 組 20 8.73±0.37a 5.41±0.51a 41.93±8.17a 6.48±1.51a 1.95±0.16a Mp組 20 4.74±0.21b 2.37±0.17b 15.75±3.44b 2.15±0.51b 0.89±0.95b SMp組 20 5.87±0.29abc 4.04±0.31abc 28.77±5.45abc 4.13±0.92abc 1.21±0.12abc F 值 4.05 3.78 12.95 4.10 3.14 P 值 0.01 0.02 0.00 0.01 0.02

表3 各組大鼠BALF中總蛋白、TNF-α、MIP-2濃度的比較()

表3 各組大鼠BALF中總蛋白、TNF-α、MIP-2濃度的比較()

注:C組為對照組；V 組為機(jī)械通氣組；Mp組為甲潑尼龍組；SMp組為SP600125+甲潑尼龍組；BALF 為支氣管肺泡灌洗液；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；MIP-2為巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2；與C組比較，a P ＜0.05；與 V 組比較,b P ＜0.05；與 Mp組比較,c P ＜0.05

組別 鼠數(shù) 總蛋白(mg/L) TNF-α(ng/L) MIP-2(ng/L)C組 20 335.12±24.5 74.36±4.21 138.85±19.32 V組 20 759.23±49.13a 152.39±9.19a 436.65±31.52a Mp組 20 359.36±28.25b 81.85±8.31b 146.39±26.22b SMp組 20 489.39±33.43abc 118.72±5.31abc 284.62±18.36abc F 值 19.45 13.68 12.53 P 值 0.00 0.00 0.00

2.5 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK 蛋白及JNK m RNA 表達(dá)比較 4組大鼠肺組織JNK 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.13,P＞0.05)；與C組比較,V 組和 SMp 組肺組織 p-JNK 和JNK m RNA 表達(dá)上調(diào)(F=3.78、3.29,P值均＜0.05),Mp組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.78、3.29,P值均＞0.05)；與 V 組比較,Mp組與SMp組肺組織p-JNK 和JNK m RNA 表達(dá)下調(diào)(F=3.78、3.29,P值均＜0.05)；與 Mp組比較,SMp組肺組織p-JNK 和JNK m RNA 表達(dá)下調(diào)(F=3.78、3.29,P值均＜0.05),見表4、圖2。

圖1 肺組織病理學(xué)變化 HE ×200 A：對照組；B：機(jī)械通氣組；C：甲潑尼龍組；D：SP600125+甲潑尼龍組

表4 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK 蛋白及JNK m RNA 表達(dá)比較()

表4 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK 蛋白及JNK m RNA 表達(dá)比較()

注:C組為對照組；V 組為機(jī)械通氣組；Mp組為甲潑尼龍組；SMp組為SP600125+甲潑尼龍組；JNK 為c-Jun 氨基末端激酶；p-JNK為磷酸化JNK；與C組比較，a P ＜0.05；與V 組比較,b P ＜0.05；與Mp組比較,c P ＜0.05

組別 鼠數(shù) JNK p-JNK JNK m RNA C組 20 0.73±0.04 1.04±0.15 0.38±0.03 V 組 20 0.75±0.07 2.91±0.44a 0.99±0.13a Mp組 20 0.71±0.05 1.25±0.22b 0.42±0.06b SMp組 20 0.78±0.09 1.96±0.31abc 0.71±0.09abc F 值 1.13 3.78 3.29 P 值 0.56 0.01 0.02

圖2 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK 表達(dá)水平

2.6 各組大鼠肺組織TUNEL 檢測結(jié)果比較 C組未出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡,V 組TUNEL 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加,Mp組TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)明顯降低,SMp組TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)介于V 組與Mp組之間。見圖3。

3 討論

一方面過度機(jī)械通氣可直接造成肺組織發(fā)生機(jī)械損傷[4-8],另一方面還介導(dǎo)肺組織發(fā)生以炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子表達(dá)增加等改變的生物學(xué)損傷[9-11]。W/D、LPI 可反映肺組織的水腫情況,MPO 是由中性粒細(xì)胞分泌的血紅素蛋白酶,其活性反映組織中性粒細(xì)胞激活程度[12]；ICAM-1 可促進(jìn)白細(xì)胞黏附、扣押于肺泡區(qū)域,導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷及持續(xù)細(xì)胞因子釋放[13-14]；BALF中總蛋白濃度、TNF-α和MIP-2濃度反應(yīng)肺組織炎癥反應(yīng)程度[15]。

本研究結(jié)果顯示,隨著機(jī)械通氣時(shí)間的延長V組大鼠OI逐漸下降,T4時(shí)與C 組比較,V 組大鼠AI、W/D、AIR、LPI均明顯升高,BALF 中總蛋白濃度、TNF-α和MIP-2濃度升高,MPO 與ICAM-1表達(dá)升高,肺組織病理損傷較重,細(xì)胞凋亡顯著增加,提示大鼠大潮氣量機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型制備成功。本研究參照文獻(xiàn)[16]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇甲潑尼龍的劑量與用法,依據(jù)文獻(xiàn)[17]選擇SP600125 的劑量與用法。研究結(jié)果顯示,與V 組比較,Mp組隨著機(jī)械通氣時(shí)間的延長OI逐漸升高,T4時(shí)肺組織AIR、LPI、W/D、AI均降低,光鏡下示肺組織病理學(xué)損傷減輕,TUNEL法示細(xì)胞凋亡減少,與Mp組比較,SMp組肺損傷較重。該結(jié)果提示甲潑尼龍具有肺保護(hù)作用,JNK 信號通路抑制劑一定程度上可逆轉(zhuǎn)甲潑尼龍的肺保護(hù)作用。

MAPK 屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶類,主要位于真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中,可將細(xì)胞外刺激信號傳遞到細(xì)胞核,可介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞,在增殖、分化、轉(zhuǎn)化、炎癥以及凋亡等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。 MAPK 有20多種亞型,如p38MAPK、JNK、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extra cellular signal-regulated kinase,ERK)1/2、ERK5等。多種刺激可使MAPK 中的蘇氨酸和酪氨酸殘基磷酸化而活化MAPK[18],在被激活后,ERK 具有抗凋亡作用,JNK 和p38則具有促進(jìn)炎癥及凋亡作用。

圖3 各組大鼠肺組織TUNEL 陽性細(xì)胞表達(dá)水平 TUNEL ×400 A：對照組；B：機(jī)械通氣組；C：甲潑尼龍組；D：SP600125+甲潑尼龍組

大潮氣量機(jī)械通氣時(shí)肺組織細(xì)胞表面產(chǎn)生了過度的機(jī)械刺激,肺組織上皮細(xì)胞受到機(jī)械刺激后可使JNK 的蘇氨酸和酪氨酸殘基磷酸化進(jìn)而激活JNK 通路,誘發(fā)相關(guān)炎性因子的合成與釋放加重肺損傷[3]。本研究也得出相同的結(jié)果,V 組大鼠p-JNK 和JNK m RNA 表達(dá)明顯高于C組。有研究顯示,糖皮質(zhì)激素可通過上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1表達(dá)來抑制JNK 信號通路活化,減少相關(guān)炎性因子的表達(dá),減輕肺損傷[19-20]。我們的前期研究也同樣發(fā)現(xiàn)甲潑尼龍可減輕大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷與其抑制p38MAPK 磷酸化有關(guān)[21-23]。本研究結(jié)果顯示,甲潑尼龍可下調(diào)大鼠肺組織p-JNK 和JNK mRNA 表達(dá),可使肺損傷明顯減輕,預(yù)先給予JNK 抑制劑SP600125皮下注射后甲潑尼龍的肺保護(hù)作用下降,該結(jié)果提示甲潑尼龍可通過抑制JNK 磷酸化來減輕大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷,既往文獻(xiàn)[19]報(bào)道支持該結(jié)果。

本研究中與V 組比較SMp組隨機(jī)械通氣時(shí)間的延長OI逐漸升高,T4 時(shí)肺組織LPI、W/D、AI、AIR 均降低,肺組織細(xì)胞凋亡減少,病理學(xué)損傷減輕,該結(jié)果提示SP600125并未完全逆轉(zhuǎn)甲潑尼龍的肺保護(hù)作用,提示在JNK 信號通路以外還有別的信號通路參與了甲潑尼龍的肺保護(hù)作用。

綜上所述,甲潑尼龍可通過抑制肺組織JNK磷酸化來減輕大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突