外泌體在氣道慢性疾病中作用機制的研究進展

王玉秀 馮婷婷 陳眾眾 顧建軍 閔凌峰

1江蘇省蘇北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 大連醫(yī)科大學第二臨床學院,揚州225001;2江蘇省蘇北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 揚州大學臨床醫(yī)學院,揚州225001

慢性氣道炎癥性疾病包括COPD 和哮喘[1]。其主要的病理表現(xiàn)為氣道的慢性炎癥反應和氣道重塑現(xiàn)象。氣道重塑主要表現(xiàn)為氣道壁的增厚、基質(zhì)膠原沉積以及上皮下纖維化等,在其發(fā)病過程中有多種細胞和炎性因子參與[2]。

外泌體是一類由多種細胞分泌的多形性囊泡樣小體,直徑約40～100 nm,廣泛存在并分布于各類體液中,如血液、尿液、唾液、滲出液甚至羊水,且有較高濃度。細胞持續(xù)接觸有害物質(zhì)可能會改變外泌體的組成,并通過外泌體將信息傳遞給周圍細胞[3],從而在氣道慢性炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中有一定的作用。這類體內(nèi)廣泛存在的納米級囊泡結(jié)構小體可參與細胞之間或細胞與環(huán)境之間的物質(zhì)、信息傳遞,在多種生理以及病理過程中發(fā)揮著重要的作用。不同組織部位細胞分泌的外泌體在其內(nèi)容物的組成和功能均有相應的區(qū)別,有學者認為這種生物學差異受到其所處的細胞外環(huán)境的調(diào)控[3]。外泌體是由蛋白質(zhì)、RNA、DNA以及少量脂類分子構成。其中蛋白質(zhì)是外泌體內(nèi)容物的主要組成部分：其中Annexins、Alix、Flotillin、Rab家族蛋白和TSG101等參與胞膜泡融合和運輸?shù)倪^程；蛋白激酶、G-蛋白等作為信號分子存在；CD63、CD9、CD81和CD82等跨膜區(qū)蛋白超家族成員則與外泌體的生成相關,它們是目前用來表征外泌體的標記物[4-5]；另外還包括分泌來源細胞的特異性蛋白等。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),外泌體作為細胞間信號以及信息傳遞工具,在炎癥反應、細胞轉(zhuǎn)分化、細胞增殖以及細胞凋亡等過程中發(fā)揮重要的作用,在炎癥性疾病、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展中有非常重要的作用。近年來有學者發(fā)現(xiàn)其在COPD、哮喘等慢性氣道炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展中同樣扮演一定的角色[6],明確外泌體在慢性氣道炎癥性疾病發(fā)病過程中的具體作用機制,可能為以后慢性氣道炎癥性疾病的診治提供新的思路。下面將就外泌體在COPD 以及哮喘中的主要作用及具體機制作一綜述。

1 外泌體可促進氣道慢性炎癥反應

慢性炎癥在氣道慢性疾病比如COPD 以及哮喘的病理過程中均有非常重要的作用,通常炎癥過程的失調(diào)在它們穩(wěn)定期以及進展期都有重要的作用。肺細胞包括氣道上皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、CD4+以及CD8+T 淋巴細胞、自然殺傷細胞以及髓-單核調(diào)節(jié)細胞均可以調(diào)節(jié)肺部炎癥反應,近期研究表明外泌體通過促進炎癥以及免疫活性在這些疾病病理過程中有一定的作用[7]。在氣喘患者,在其BALF分離出了外泌體,在哮喘發(fā)生、發(fā)展中有促進炎癥以及免疫活性的作用[8]。COPD 同樣是慢性炎性疾病,其肺部癥狀以及病理過程類似于哮喘,然而炎癥機制有不同。氣道刺激反應比如煙草煙霧激活肺泡Ⅱ型上皮細胞以及巨噬細胞促進炎癥反應以及Th1/Th2細胞毒性反應。另外,這些細胞可通過胞內(nèi)蛋白酶、促炎因子以及microRNA 而促進肺泡壁的損害,以及小氣道壁的纖維化,而導致肺氣腫的發(fā)生[9]。

在外界刺激包括煙草煙霧、感染、機械性損傷等的刺激下,可促進氣道細胞包括支氣管上皮細胞、內(nèi)皮細胞等釋放大量外泌體,其中包含有抗原、共刺激物以及一些促炎因子,可以完成細胞間的信號傳遞,從而誘導細胞的遷移、凋亡以及細胞因子的釋放以及其他炎癥誘導作用。在外周淋巴細胞,這可以誘導特異性免疫反應以及先天性免疫反應。

肺外泌體可來源于不同類型細胞,其中包括支氣管上皮細胞以及肺部免疫細胞,比如肺巨噬細胞、樹突狀細胞等[10],在氣道炎癥反應中有一定的作用。支氣管上皮細胞是肺外泌體的主要來源,支氣管上皮細胞是氣體交換的第一道屏障,在煙草煙霧等外界刺激下,首先刺激支氣管上皮細胞外泌體的分泌以及釋放[11]；有體外實驗研究顯示,IL-13刺激的支氣管上皮細胞外泌體的釋放可促進單核細胞的增殖[12]。在氣道慢性炎癥性疾病,巨噬細胞的數(shù)量明顯增加,肺泡巨噬細胞來源的外泌體可抑制細胞因子信號蛋白的轉(zhuǎn)運,并且可以抑制干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)誘導的信號傳感器的轉(zhuǎn)錄及翻譯,這都顯示巨噬細胞來源外泌體在氣道慢性炎癥中有一定的作用[13]。細菌刺激的巨噬細胞來源的外泌體在體內(nèi)可誘導記憶CD4+以及CD8+T細胞反應。在吸煙者低氧刺激下,外周血內(nèi)皮細胞來源的外泌體明顯增加,可促進大量促炎成分以及細胞因子的釋放[14]。嗜酸粒細胞來源的外泌體可增強IFN-γ 的刺激作用。有研究者發(fā)現(xiàn)在哮喘患者,嗜酸粒細胞的釋放增加了攜帶大量顆粒蛋白的外泌體數(shù)量。活性中性粒細胞釋放含有顆粒蛋白髓過氧化物酶的外泌體,并能將花生四烯酸輸送到受體的血小板中。在脂質(zhì)介導下,中性粒細胞與血小板之間信息交流明顯增強在炎癥過程中[15]。肥大細胞來源的外泌體可以誘導B淋巴細胞以及T 淋巴細胞的增殖,以及樹突狀細胞的成熟。在抗原刺激后,外周樹突狀細胞可產(chǎn)生帶有p MHC-Ⅱ的外泌體。這些樹突狀細胞來源的外泌體可以通過與樹突狀細胞以及B細胞相互作用而激活T 細胞并調(diào)節(jié)它們的極性。另外,巨噬細胞以及樹突狀細胞來源的外泌體還可以增強多核巨細胞的遷移,并且這些外泌體內(nèi)包括含有白介素合成酶而促進炎癥因子的分泌而促進炎癥反應[16]。

在煙草煙霧、感染等外界刺激下,外泌體內(nèi)容物如蛋白質(zhì)、RNA 和少量脂類分子等在氣道慢性炎癥過程中同樣有非常重要的作用。一方面,外泌體自身包含有大量炎性因子,研究顯示,外泌體內(nèi)包含有IL-1β的存在,而氣道IL-1β水平增加可促進炎癥反應以及誘導巨噬細胞基質(zhì)金屬蛋白酶的合成,在氣道慢性炎癥以及氣道重塑中扮演一定的角色[17]。另外,外泌體內(nèi)容物microRNA,如miR-15b、miR-223、miR-210等在氣道炎癥反應中有一定作用[18]。再者,外泌體內(nèi)部分蛋白同樣可促進氣道慢性炎癥,其中CCN1作為一基質(zhì)相關的CCN 家族蛋白,在煙草煙霧刺激后支氣管上皮細胞來源外泌體內(nèi)存在大量CCN1,其可溶解形式可通過Wnt信號通路刺激IL-8的產(chǎn)生,而募集炎癥細胞到肺實質(zhì),在氣道慢性炎癥反應中有一定的作用[19]。因此外泌體也許可作為炎癥細胞募集的主要介質(zhì)在氣道炎癥反應中起一定的作用。

在氣道慢性炎癥過程中,外泌體一方面作為細胞間主要信息傳導工具之一,可促進氣道上皮以及內(nèi)皮細胞與各個免疫細胞間的信號傳導而促進外界煙霧、感染等刺激下的氣道炎癥反應；另一方面外界不良因素刺激下氣道細胞外泌體分泌釋放增加,其內(nèi)容物(RNA、DNA、蛋白酶等)在促進氣道慢性炎癥中同樣有重要的作用(圖1)。

2 外泌體可促進氣道重塑反應

圖1 外泌體促進氣道慢性炎癥機制示意圖

氣道重塑是慢性炎癥性氣道疾病的一主要病理表現(xiàn),就目前研究,其主要的作用機制有：(1)在外界刺激下,促進氣道蛋白酶[如基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和 MMP-9 等]分泌,促進氣道纖維化從而導致氣道重塑；(2)在外界煙霧、感染等刺激下,產(chǎn)生部分細胞因子,比如活性氧成分等通過作用于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等因子而促進氣道上皮細胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而促進氣道重塑；(3)在各種細胞因子的刺激下,促進氣道平滑肌增殖以及表型轉(zhuǎn)化,同樣在氣道重塑中有非常重要的作用,近年來的研究顯示,外泌體作為細胞間信號傳遞的主要工具,在慢性氣道炎癥性疾病氣道重塑作用機制中有非常重要的作用[20]。

外泌體內(nèi)含有大量蛋白質(zhì)以及其他分子,并且在胞外環(huán)境中保護它們免受降解酶的降解[21]。之后隨外泌體很快轉(zhuǎn)運到遠處目標細胞,并且其表面的標記物使它們與目標細胞融合并內(nèi)化,從而影響目標細胞的功能。有研究顯示在脂多糖等刺激下,其可促進氣道中性粒細胞分泌釋放外泌體,并且轉(zhuǎn)移到氣道平滑肌細胞,使其被平滑肌細胞內(nèi)化,促進氣道平滑肌細胞的增殖,從而促進氣道重塑[22]。另外,他們的研究還顯示在中性粒細胞來源外泌體中大量蛋白酶如MMP-9和血管內(nèi)皮生長因子受體3 的存在,同樣在氣道重塑中扮演非常重要的作用[23]。除中性粒細胞外,煙草煙霧刺激同樣可誘導支氣管上皮細胞分泌的外泌體,可以調(diào)控成纖維細胞分化,同樣在氣道重塑中有非常重要的作用[24]。有研究發(fā)現(xiàn)在脂蛋白刺激下,氣道上皮細胞外泌體分泌釋放明顯增加,可促進蛋白酶的細胞外轉(zhuǎn)運,一方面促進氣道成纖維細胞的肌纖維分化,另一方面可通過Toll樣受體4信號作用調(diào)節(jié)氣道上皮細胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化,因此促進氣道重塑[20]。另外,支氣管成纖維細胞積極參與細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)維持,上皮屏障功能,修復機制和白細胞遷移。它們可以調(diào)控外周上皮細胞的增殖與分化。有研究證實了支氣管成纖維細胞在上皮細胞促進下釋放外泌體的能力,并且支氣管成纖維細胞分泌的外泌體包含有細胞因子、化學因子以及其他生長因子,在這些因子作用下,使成纖維細胞TGF-β表達減少,促進氣道上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而在氣道重塑過程中起一定的作用[24]。

在煙草煙霧、脂蛋白、過敏原等外界刺激下,氣道支氣管肺泡細胞以及免疫細胞外泌體分泌增加,一方面快速轉(zhuǎn)運到目標細胞,比如肺支氣管平滑肌細胞,調(diào)控目標細胞功能,促進其增殖,在氣道重塑中扮演重要的角色。再者外泌體包含有大量蛋白酶、DNA、RNA 等分子,在MMP等的作用下,促進氣道成纖維細胞肌纖維化,進一步促進氣道重塑。另外,外泌體同樣包含有大量細胞因子、化學因子以及生長因子等,可通過調(diào)控TGF-β的表達而促進氣道上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,同樣在氣道重塑中扮演重要的角色(圖2)。

3 外泌體在COPD作用機制中的研究

COPD 是一種以氣道慢性炎癥以及氣道重塑為主要病理特征的起到慢性炎癥性疾病,是呼吸內(nèi)科常見疾病,多發(fā)于老年患者,且近年環(huán)境污染的加重,其發(fā)病率也逐年上升。臨床主要表現(xiàn)為氣急、咳嗽、咳痰并常伴呼吸衰竭等。肺功能檢查多以持續(xù)氣流受限,且不完全可逆為特征[25]。眾所周知,煙草煙霧等外界刺激在COPD 的發(fā)生、發(fā)展中有至關重要的作用,氣體交換是維持機體正常生理活動主要的過程之一,其有賴于較大的氣血接觸面,不可避免的與外界危險因子的接觸包括顆粒、病原體以及化學刺激物。氣道的保護措施包括解剖屏障,纖毛上皮、黏液的誘導捕獲入侵者以及遍布于氣道的固有以及獲得性免疫細胞[26]。而外泌體作為一囊樣結(jié)構,研究顯示在煙草煙霧、病原體等刺激下,氣道上皮細胞分泌外泌體的量明顯增加,同時在COPD 氣道慢性炎癥以及氣道重塑等病理過程中扮演重要的角色[27]。

氣道慢性炎癥是COPD 主要的病理學特性之一,煙草煙霧以及其他刺激作用刺激氣道上皮細胞以及巨噬細胞釋放細胞因子以及生長因子而促進COPD 慢性炎癥反應。另外,激活的巨噬細胞可通過募集中性粒細胞、Th1 以及Tc1亞型以及分泌蛋白酶而促進炎癥反應。有研究表明,在煙草煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)處理后,肺上皮細胞分泌外泌體的量明顯增加,并且外泌體內(nèi)有CCN1的存在[28]。而CCN1 是CCN 家族蛋白之一,其可通過多種信號功能影響細胞的生存以及生長,他們就發(fā)現(xiàn)CCN1的可溶性形式可以通過Wnt信號通路刺激IL-8的產(chǎn)生,進而募集炎癥細胞到肺實質(zhì),導致肺部炎癥的發(fā)生,因此外泌體包含的CCN1也許在促進氣道炎癥反應有類似的作用[19]。另外,microRNA 作為外泌體主要內(nèi)容物之一,有研究發(fā)現(xiàn)其在氣道慢性炎癥反應中有一定的作用,已有研究顯示在CSE 處理的支氣管上皮細胞分泌的外泌體內(nèi)miR-210的表達上調(diào),可刺激氣道炎癥因子例如腫瘤壞死因子-α、IL-6、IL-1β等的分泌,從而刺激氣道慢性炎癥反應[29]。綜上均證明了外泌體在COPD 氣道慢性炎癥反應中的重要作用。

圖2 外泌體促進氣道重塑機制示意圖

COPD 是一種慢性非可逆氣道炎癥性疾病,其最終狀態(tài)即為氣道重塑、小氣道壁的纖維化以及肺泡腔的破壞,導致肺氣腫的發(fā)生。在香煙煙霧等外界刺激下,上皮細胞分泌的TGF-β和成纖維生長因子等可促進纖維細胞的增生以及小氣道的纖維化[30]。另外,COPD 患者氣道IL-1β的水平是明顯升高的,其可促進氣道炎癥反應,同時可促進基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生。而已經(jīng)有研究在人以及小鼠氣道細胞分泌的外泌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IL-1β以及MMP-9的存在[31-32],其均在促進氣道纖維化中扮演重要的角色。另外,大量研究表明多種miRNAs參與COPD 的發(fā)生發(fā)展,包括miR-15b、miR-223、miR-1274a、miR-424 以及 miR-210,這些miRNAs也許包含在外泌體內(nèi)并且改變受體細胞的功能[7],特別的,已經(jīng)有研究在CSE處理的支氣管上皮細胞分泌的外泌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)miR-210的表達上調(diào),并且這些miR-210相關的外泌體可通過拮抗ATG7而抑制自噬反應以及促進纖維細胞的肌纖維化在肺氣腫的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[33]。

4 外泌體在哮喘作用機制中的研究

哮喘是一種癥狀多樣的氣道慢性炎癥性疾病,主要以氣喘、呼吸困難以及胸部緊迫感為主要臨床特點,主要表現(xiàn)為可逆性的氣流受限、氣道高反應性、外周Th2-介導的氣道炎癥以及氣道重塑。氣道重塑主要包括氣道上皮細胞的改變、上皮下膠原蛋白的沉積、細胞外基質(zhì)的破壞以及支氣管平滑肌細胞的增生[34]。這些導致的結(jié)果就是氣道壁的增厚促進氣道炎癥反應,最終導致哮喘急性發(fā)作。哮喘的發(fā)展意味著氣道平滑肌細胞的收縮、增生、肥大、化生以及遷移[35]。近期研究顯示,外泌體可參與并介導免疫應答、抗原呈遞、炎癥反應和細胞遷移等多種病理生理過程[36]。其可參與哮喘患者的炎癥反應過程和細胞間通訊過程,在哮喘發(fā)病過程中均發(fā)揮作用。

Park等[37]研究結(jié)果顯示哮喘患者較健康對照者在BALF分泌有大量外泌體,并證明在外界刺激下由支氣管上皮細胞分泌,促進組織因子分泌到支氣管,在哮喘氣道慢性炎癥中有重要的作用。另外,Paredes等發(fā)現(xiàn)在輕度樺樹花粉過敏性哮喘患者BALF 外泌體CD63、CD81、CD36、HLA-DR 蛋白水平明顯高于正常對照組,其在哮喘患者中表現(xiàn)出不同的表型及功能；進一步發(fā)現(xiàn)來自哮喘的BALF外泌體可增加支氣管上皮細胞中組織因子的形成和IL-8的釋放,而半胱氨酰白三烯受體拮抗劑孟魯司特能降低外泌體誘導的IL-8釋放,因此BALF外泌體也具有支氣管上皮細胞中組織因子生物合成能力,參與哮喘的炎癥反應。

外泌體在細胞間通訊中發(fā)揮重要的作用,它可以穿過質(zhì)膜將其內(nèi)容物卸載,進而影響細胞的表型及功能。不同細胞來源的外泌體,其功能也就不同[38]。與哮喘有關的外泌體產(chǎn)物主要由嗜酸粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、上皮細胞及淋巴細胞產(chǎn)生,其中眾所周知,嗜酸粒細胞是哮喘中的重要效應細胞,它通過釋放含有多種炎癥因子的顆粒來發(fā)揮作用[39]。其中的一些顆粒即為外泌體,它是細胞外的納米囊泡,直徑約30～120 nm,并且包含有多種分子,其中包括核酸(DNA、microRNA、RNA)、蛋白以及脂質(zhì)介質(zhì)。有研究顯示,哮喘患者的嗜酸粒細胞來源的外泌體可以影響肺結(jié)構細胞的功能,改變細胞一些生理過程以及改變多種促炎因子的表達[40],他們還發(fā)現(xiàn)外泌體可顯著降低信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3以及絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT 因子的磷酸化,與此同時,這些細胞的凋亡水平增加以及傷口修復水平降低,從而在哮喘患者氣道重塑中有重要的作用[41]。Rossaint等[42]發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞中可以分離出外泌體,并證明外泌體在體內(nèi)表現(xiàn)為抗原呈遞作用,誘導T 細胞的反應,參與免疫細胞的調(diào)節(jié)。同樣的,Kulshreshtha等[43]發(fā)現(xiàn)在IL-13的影響下,上皮細胞來源的外泌體可誘導哮喘炎癥條件下肺內(nèi)未分化巨噬細胞的增殖和趨化,從而在哮喘發(fā)生發(fā)展中扮演一定角色。Du等[44]發(fā)現(xiàn)衍生自抗原呈遞細胞的外泌體能在細胞表面表達主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex-Ⅰ,MHC-Ⅰ)和MHC-Ⅱ類分子,有助于激活CD4+T 細胞和CD8+T 細胞以誘導特異性免疫應答,在哮喘患者氣道炎癥反應中扮演一定的角色。

綜上所述,外泌體作為細胞間信號傳遞的主要工具之一,在氣道慢性炎癥疾病尤其是COPD、哮喘等的發(fā)生、發(fā)展中有重要的作用,但外泌體是否可作為COPD、哮喘等慢性氣道炎性疾病的診斷或預后評估的指標之一,尚未得到一定的證實。同時外泌體在COPD、哮喘等慢性炎癥性疾病的慢性氣道炎癥以及氣道重塑等病理特征中的具體作用機制還需進一步的研究。外泌體的研究也許可以為慢性氣道炎癥性疾病的臨床診斷以及治療提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突