Picrophilus Torridus嗜熱酯酶的克隆表達(dá)及性質(zhì)研究

杜曉韻，張興群*，張曉彥

（1.東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620；2.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620）

鄰苯二甲酸酯（phthalate ester，PAE），俗稱塑化劑，是廣泛使用的人工合成有機(jī)化學(xué)品，由于它具有提高塑料柔韌性、耐用性和可加工性的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和消費(fèi)品中，如農(nóng)藥、潤滑劑、化妝品及食品包裝袋。由于PAE與塑料不是共價(jià)鍵結(jié)合，所以在日常的生產(chǎn)、使用及廢物處理中，PAE很容易從塑料中滲透并進(jìn)入環(huán)境中[1-2]。近年有報(bào)道顯示，一些污染工業(yè)區(qū)及電子廢棄物填埋場附近的土壤，被檢測出高含量的PAE[3]。這些高污染地點(diǎn)是PAE的重要污染源，隨著時(shí)間的推移，PAE會(huì)從外部環(huán)境中轉(zhuǎn)移到食物中，如從被污染的土壤或水中轉(zhuǎn)移到農(nóng)作物中[4]。PAE在極低濃度下就會(huì)干擾人和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，長期的PAE污染，有致畸、致癌和致突變的風(fēng)險(xiǎn)。因此，許多環(huán)境組織把多種PAE列為優(yōu)先污染物加以控制[5]。

PAE在自然環(huán)境中不易降解，依靠自然水解或光解來消除是不現(xiàn)實(shí)的。先進(jìn)的氧化方式對于污水中的PAE降解是有效的，如光催化氧化、UV光解和臭氧氧化[3]，這些方法在近年都被證實(shí)能破壞污水中的PAE，但顯然不適用于土壤中PAE的降解。多位學(xué)者已從受污染的土壤污泥中篩選到能降解PAE的微生物，并認(rèn)為降解PAE的最有效途徑為微生物介導(dǎo)[6]。微生物降解的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，因此除了利用菌種本身對土壤進(jìn)行修復(fù)外，提取微生物的降解酶類來進(jìn)行降解也是一種有效的手段。外源投入的微生物或者降解酶是否能很好地作用于自然環(huán)境，是否會(huì)對自然環(huán)境造成額外的影響，這也是一個(gè)重要的研究方向[7]。

本研究以Picrophilus torridusDSM 9790基因組為模板，通過篩選，得到一個(gè)高對硝基苯酚丁酸酯（pNPB）水解活性的中度嗜熱酶，并對其基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。以鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）為底物的初步降解實(shí)驗(yàn)表明，0.1 mg該酶能在24 h內(nèi)完全降解5 mmol/L的DBP，當(dāng)溫度提高到60 ℃時(shí)，降解的效率提高。該酶可應(yīng)用于一些高溫環(huán)境的土壤修復(fù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PCR擴(kuò)增儀（Bio-rad公司）；EPS-300A電泳儀（天能科技）；生物電泳圖像分析系統(tǒng)（上海復(fù)日）；Sorvall Legend Micro 17冷凍離心機(jī)（Thermofisher scientific）；UV-1800紫外分光光度計(jì)，Prominence LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津）。

1.2 材料

1.2.1 菌株及載體E.coliBL21（DE3），E.coliDH5α和表達(dá)載體pET-28a(+)為實(shí)驗(yàn)室所保存。Picrophilus torridusDSM 9790購自德國菌種庫DSMZ。

1.2.2 酶和主要試劑 擴(kuò)增EstPt 1基因的引物由上海捷瑞生物公司合成，各種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，LA Taq DNA聚合酶等分子生物學(xué)工具酶購自大連TaKaRa公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自北京天根生化，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.3 培養(yǎng)基 肉湯（LB）培養(yǎng)基（g/dL）：蛋白胨1.0，酵母粉 0.5，NaCl 1.0，pH 7.0；LB甘油培養(yǎng)基（g/dL）：甘油0.2，蛋白胨1.5，酵母粉0.75，NaCl 0.5，Na2HPO4·12H2O 1.26，KH2PO4 0.3，NH4Cl 0.1，MgSO41.2。

2 方法

2.1 EstPt 1基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

按NCBI公布的Picrophilus torridusDSM 9790嗜熱酯酶（NC_005877）基因序列設(shè)計(jì)引物，引物見表1，下劃線部分為引入的限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)，根據(jù)細(xì)菌基因組提取試劑盒的說明提取Picrophilus torridusDSM 9790基因組DNA，以此為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR，擴(kuò)增出嗜熱酯酶EstPt 1基因。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pET 28a(+)質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPtoE，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）中，成功構(gòu)建表達(dá)EstPt 1基因的菌株。

表1 克隆目的基因的引物

2.2 EstPt 1在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

將重組菌接種到含50 mg/L 硫酸卡那霉素（Kan）的LB甘油液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.4～0.6，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）， 37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)12 h，之后5000 r/min離心10 min收集菌體，重懸于10 ml預(yù)冷的PBS中，進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎（功率220 W，工作5 s，停3 s，99個(gè)循環(huán)），破碎液在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。粗酶液過鎳柱進(jìn)行純化，洗脫液為含100 mmol/L咪唑的PBS緩沖液，對收集到的液體用蒸餾水透析18 h，以去掉咪唑。對經(jīng)透析的純酶液進(jìn)行超濾濃縮，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測純度，純酶用于酶學(xué)性質(zhì)分析。

2.3 酶活性測定

向2.97 μl 50 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.0）中加入30 μl 1 mol/LpNPB母液，50 ℃保溫2 min，再加入適量的酶液，震蕩均勻。檢測波長405 nm，每隔10 s記錄一個(gè)A405值，記錄時(shí)長1 min[8]。根據(jù)以下公式計(jì)算酶活性。蛋白濃度通過Bradford方法測定[9]。

式中，?A405為A405值的變化量，t為反應(yīng)時(shí)間。

2.4 EstPt 1酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.4.1 最適pH測定 配制不同pH值的緩沖液：pH 6～8 PBS緩沖液（50 mmol/L），pH 8～9.5 Tris-HCl（50 mmol/L）緩沖液。分別孵育10 min，以pNPB為底物，采用分光光度計(jì)測定純化后的酯酶活性，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)測定3次。所有測定均于50 ℃進(jìn)行。

2.4.2 最佳反應(yīng)溫度測定 將純化得到的酯酶分別置于最適pH值下的4～95 ℃的反應(yīng)體系中，分別孵育10 min，以pNPB為底物，采用分光光度計(jì)測定純化后的酯酶活性，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)測定3次。

2.4.3 熱穩(wěn)定性檢測 將純化后的酯酶置于60，65，70 ℃水浴中，定時(shí)取樣與底物pNPB反應(yīng)，檢測酶活，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)測定3次。

2.5 對DBP的降解反應(yīng)

將DBP配制成50 mmol/L的母液，溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，取100 μl加入含900 μl PBS（pH 7.0）的玻璃小試管中，加入50 μl酶液，分別在37 ℃和60 ℃下避光反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用等體積的乙酸乙酯萃取。萃取液用TLC點(diǎn)板分析。

2.6 TLC分析

用毛細(xì)點(diǎn)樣管取乙酸乙酯萃取液點(diǎn)樣，吹干后放入展開劑中展開。展開劑配方：石油醚:乙酸乙酯:乙酸（10:1:0.5），待展開劑展開到硅膠板前沿位置處取出，235 nm紫外燈下檢測。

2.7 HPLC分析

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（80:20），檢測波長254 nm，柱溫40 ℃，流速0.8 ml/min。

3 結(jié)果與分析

3.1 EstPt 1基因在大腸桿菌中的表達(dá)

以Picrophilus torridusDSM 9790基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到906 bp的基因片段（見圖1），片段大小與預(yù)期相符，測序結(jié)果表明與NCBI（NC_005877）公布的基因序列一致。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE蛋白質(zhì)分析，在35 kD處有明顯的特異性表達(dá)條帶（見圖2），該條帶與預(yù)期結(jié)果一致，說明9790基因已成功表達(dá)。

圖1 重組質(zhì)粒pPtoE PCR結(jié)果

圖2 誘導(dǎo)重組菌9790電泳結(jié)果

3.2 嗜熱酯酶EstPt 1的純化

經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌超聲上清經(jīng)鎳柱親和層析和100 mmol/L咪唑洗脫，得到活性組分，經(jīng)SDSPAGE分析，可得到單一的明顯的蛋白質(zhì)條帶，說明100 mmol/L的咪唑可洗脫目標(biāo)蛋白。對粗酶與純酶進(jìn)行蛋白濃度和酶活檢測，結(jié)果見表2。純化倍數(shù)為3.09倍，純酶的比活達(dá)202.3 U/mg。

表2 EstPt 1純化結(jié)果

3.3 EstPt 1的酶學(xué)性質(zhì)

3.3.1 EstPt 1的最適pH值 EstPt 1嗜熱酯酶的最適pH值范圍見圖3，由圖3可見，其最適pH值為9.0。pH是決定酶活力的重要因素，該酯酶在偏堿性條件下的活性高于酸性條件下活性。由于底物在≥pH 10的條件下會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的自水解，因此無法檢測。

圖3 pH對EstPt 1活性的影響

3.3.2 EstPt 1的最適反應(yīng)溫度 溫度對于酶活力也有重要影響，見圖4。由圖4可見，隨著溫度上升，EstPt 1酶活力也逐漸升高，當(dāng)溫度高于85 ℃時(shí)，酶活下降，所以最適溫度為85 ℃。酶在80～90 ℃間相對酶活超過90 %，且在0 ℃仍有16 %的活性，這說明EstPt 1不僅可在高溫下發(fā)揮作用，在低溫環(huán)境下也可很好地發(fā)揮作用。

圖4 溫度對EstPt 1活性的影響

3.3.3 EstPt 1的熱穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性是酶的一個(gè)重要參數(shù)，代表酶能在一定溫度一定時(shí)間內(nèi)保持高效水解能力。由圖5可見，該酶在60 ℃保溫64 h，65 ℃保溫12 h，70 ℃保溫1 h，殘余活力均保持在50 %左右，表明EstPt 1具有良好的穩(wěn)定性，可用于高溫環(huán)境中PAE的降解。

圖5 熱穩(wěn)定性對比

3.4 EstPt 1降解塑化劑的應(yīng)用研究

3.4.1 TLC分析結(jié)果 結(jié)果見圖6。由圖6可見，DBP分解產(chǎn)物為鄰苯二甲酸單丁酯（MBP），其在37 ℃下24 h可被基本降解。

圖6 EstPt 1與底物DBP反應(yīng)24 h后的TLC結(jié)果

3.4.2 HPLC分析降解進(jìn)程曲線 結(jié)果見圖7。由圖7可見，初始30 min內(nèi)，底物消耗效率基本相同。此后，EstPt 1在60 ℃下對DBP的降解速度快于37 ℃下降解速度。反應(yīng)2 h后，60 ℃和37 ℃下，底物殘留分別為5 %和28 %。 EstPt 1在高溫下對DBP降解活性較好，可用于一些高溫環(huán)境，如高溫堆肥，夏季蔬菜大棚內(nèi)污染土壤的生物修復(fù)。

圖7 EstPt 1在37℃和60 ℃條件下對DBP的降解效果

4 結(jié)論

我們以Picrophilus torridusDSM 9790基因組DNA為模板，獲得了能降解PAE的嗜熱酯酶EstPt 1，該酶純化后的比活達(dá)到202.3 U/mg，其最適pH為9.0，最適反應(yīng)溫度為85 ℃，具有良好的熱穩(wěn)定性。

EstPt 1還顯示出對DBP良好的降解活性，TLC分析結(jié)果顯示，該酯酶可將DBP降解為單酯MBP；HPLC分析顯示，在37℃和60 ℃的溫度條件下，DBP在8 h內(nèi)被完全降解，其中60 ℃下的作用效果較優(yōu)。這對工業(yè)化降解環(huán)境中，尤其是高溫環(huán)境中的塑化劑降解有重要意義。