鮮食棗的快速繁殖體系研究初報

李學(xué)營，彭勇菲，王金鑫，彭建營

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定071001；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院石家莊果樹研究所，河北石家莊050061）

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指利用植物細胞的全能性，在無菌條件下將離體的器官（如根、莖、葉、花、果、莖尖等）、組織（如形成層、表皮層、皮層、髓部細胞、胚乳等）、細胞及原生質(zhì)體放在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在人工控制的環(huán)境里長成完整植株的過程。植物組織培養(yǎng)具有成本低、效率高、脫病毒等特點，最先始于20 世紀初期，形成于20 世紀中期，在20 世紀60 年代后被廣泛應(yīng)用。其在生物技術(shù)中尤為重要，同時也是植物無性繁殖的重要方式之一[1-3]。

近年來，我國棗生產(chǎn)發(fā)展較快，培育和發(fā)掘出許多優(yōu)良品種，其繁殖方式主要有嫁接、扦插、分株和組織培養(yǎng)繁殖等。嫁接繁殖成活率高，方法簡單易操作，因此，其成為當前栽培棗樹最為常用的方式，但其發(fā)枝量少，樹冠成形慢。嫩枝扦插繁殖由于其耗枝量大，并且必須選取當年萌發(fā)的半木質(zhì)化枝條，取材相對較困難。而對成年的大樹一般采取分株繁殖，且要采取人為斷根措施，這樣不僅對母樹造成傷害，還可能引起品種混雜[4-6]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可在短期內(nèi)獲得大量、無毒的組培苗，在一定程度上促進了棗樹優(yōu)良品種的發(fā)展，間接地提高了經(jīng)濟效益[7]。生長調(diào)節(jié)劑和外植體的選擇是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的重要條件。但不同品種、不同生長調(diào)節(jié)劑配比、不同外植體選擇存在較大差異。

筆者通過對6 個鮮食棗品種不同取材部位和不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比進行研究，以期篩選出棗最佳外植體材料和最佳啟動、繼代培養(yǎng)基，為棗組織快速繁殖體系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗以稷山板棗、上海白蒲棗、疙瘩棗、孔府酥脆棗、寧陽六月鮮和尖棗6 個鮮食棗品種為試材，于2012 年栽植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)林教學(xué)實驗基地，株行距1.5 m×3 m，按常規(guī)進行管理。

1.2 方法

本試驗用MS 培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L，通過添加不同質(zhì)量濃度配比的6-BA 和IBA篩選棗啟動培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基。在啟動培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中分別設(shè)計4 個配比處理（表1），生長調(diào)節(jié)劑在滅菌前加入，pH 值調(diào)至5.8～6.0，在高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃條件下滅菌20 min。培養(yǎng)條件為每日光照10～12 h，光照強度1 600 lx，溫度（25±2）℃。

表1 2 種培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的配比 mg/L

1.2.1 外植體消毒及啟動培養(yǎng)基篩選 2016 年3 月剪取休眠期1 年生枝和二次枝，帶回實驗室后用0.1%的洗衣粉水浸泡5～10 min，將枝條表面清洗干凈，用自來水沖洗30 min，插入燒杯中進行水培。水培20 d 左右后取萌發(fā)的帶腋芽莖段（6 個品種的混合取樣）作外植體，用0.1%HgCl2溶液滅菌處理8 min，蒸餾水沖洗4～5 次，切去莖段兩端各0.5 cm，接種于不同配比的培養(yǎng)基上，每個處理10 瓶，每瓶3 個，共30 個莖段，重復(fù)3 次。將接種好的莖段于組培室進行培養(yǎng)，每隔7 d 進行一次莖段生長狀況調(diào)查，統(tǒng)計萌芽數(shù)。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基篩選 外植體培養(yǎng)至5～6 cm時進行增殖繼代培養(yǎng)，每個莖段3～4 個腋芽，每瓶3 個莖段，設(shè)置不同的生長調(diào)節(jié)劑配比，每個處理10 瓶，重復(fù)3 次。將接種好的莖段于組培室進行培養(yǎng)，定期觀察記錄棗啟動芽的生長情況。

1.2.3 外植體篩選試驗 2016 年5 月分別采取稷山板棗、上海白蒲棗、疙瘩棗、孔府酥脆棗、寧陽六月鮮和尖棗6 個鮮食品種棗頭、棗吊、棗葉片為外植體進行研究。啟動培養(yǎng)基為1.2.1 篩選出的最適啟動培養(yǎng)基，前處理與1.2.1 相同，每個處理10 瓶，每瓶接種3 個材料，共計30 個，重復(fù)3 次，于組培室進行培養(yǎng)。每周觀察新梢的生長狀況，同時統(tǒng)計接種材料的存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對棗莖段啟動培養(yǎng)的影響

將帶腋芽的莖段分別接到不同處理的啟動培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14 d 后，莖段開始膨大，腋芽開始萌動并露出綠色芽點，切口處有愈傷組織出現(xiàn)；21 d 后發(fā)現(xiàn)，莖段腋芽處出現(xiàn)不定芽，長出1～2 個叢狀小枝；培養(yǎng)28～35 d 后，腋芽處長出2～3 cm 的小芽。

添加不同質(zhì)量濃度生長調(diào)節(jié)劑，不定芽生長分化有明顯差異，說明植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽的生長和分化起著重要作用。從表2 可以看出，Q2 處理效果最好，即生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度6-BA 為1.0 mg/L，IBA 為0.2 mg/L 時，芽的萌發(fā)數(shù)多，啟動率最高，為63.33%，顯著高于其他處理；Q1 處理效果次之，啟動率為46.67%；再次為Q3 處理，啟動率為33.33%；Q4 處理的效果最差，啟動率僅為26.68%。

表2 不同生長調(diào)節(jié)劑配比下棗莖段啟動培養(yǎng)情況

2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對棗增殖培養(yǎng)的影響

由表3 可知，不同生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度配比的培養(yǎng)基對棗增殖影響很大。Z3 處理（6-BA 2.0 mg/L，IBA 0.3 mg/L）的芽苗粗壯，長勢良好，增殖系數(shù)為2.33，顯著優(yōu)于其他處理；Z1處理次之，芽苗長勢細弱；而Z2，Z4 處理效果較差，長勢較弱，并逐漸死亡。

表3 不同繼代培養(yǎng)基的增殖情況

2.3 不同外植體材料對存活率的影響

從表4 可以看出，棗頭接種后存活率最高，為53.33%～83.33%，是棗樹組織培養(yǎng)快速繁殖很好的啟動材料；而棗吊接種后大部分直接枯萎死亡，只有少數(shù)成活，但在培養(yǎng)過程中逐漸衰亡，不宜作為組培快繁的接種材料；葉片接入啟動培養(yǎng)基后幾天漸漸衰亡，同樣不適宜作為棗組培的啟動材料。因此，棗組織培養(yǎng)的最佳啟動材料為棗頭。不同品種間棗頭的存活率也有差異，其中，稷山板棗和孔府酥脆棗存活率較高，分別為83.33%，80.00%；寧陽六月鮮棗和上海白蒲棗存活率較低，分別為56.68%，53.33%。

表4 外植體不同取材部位的成活率比較

3 結(jié)論與討論

棗樹的啟動培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基一般采用MS 培養(yǎng)基[8]。培養(yǎng)基中加入的植物生長調(diào)節(jié)劑是影響組織培養(yǎng)成功與否的一個重要條件[9]。植物生長調(diào)節(jié)劑的種類有很多，植物細胞分裂素的主要作用是促進植物細胞分裂和分化，誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成，細胞分裂素多采用6-BA 和KT；生長素的作用是影響莖尖和節(jié)間的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等，主要有IBA，IAA 和NAA。調(diào)節(jié)劑之間的搭配和濃度均對組織培養(yǎng)中的細胞有較大影響，本研究中棗的啟動培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L，增殖培養(yǎng)基為MS＋6-BA 2.0 mg/L＋IBA 0.3 mg/L 時，培養(yǎng)和增殖效果最好，增殖培養(yǎng)基中激素濃度均大于啟動培養(yǎng)基。

影響組織培養(yǎng)的重要因素有組培材料、消毒滅菌時間和方式、培養(yǎng)基類型、植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇等。植物組織培養(yǎng)中外植體材料的選擇是組織培養(yǎng)過程中關(guān)鍵步驟[10-13]。羅曉芳等[14-15]已建立了金絲小棗和贊皇大棗等的無菌體系。關(guān)于棗離體葉片組織培養(yǎng)研究相對較晚，葉部組織培養(yǎng)成功的報道均以試管苗葉片為試材，通過不同切割、擺放、基本培養(yǎng)基種類和生長調(diào)節(jié)劑配比等研究其再生[16-18]，而田間直接采取葉片無再生不定芽的能力[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同鮮食棗品種直接田間采取葉片接種培養(yǎng)，長出愈傷組織后逐漸枯萎死亡，成活率為零，進一步說明大田棗葉片不能作為組織培養(yǎng)材料。本研究中棗吊接入培養(yǎng)基后，未萌發(fā)新芽，而是枯萎變黃，有少數(shù)棗吊在瓶中開花后，逐漸枯萎，所以，棗吊同樣不適合作為棗組織培養(yǎng)的外植體材料；而棗頭接種于啟動培養(yǎng)基后，萌芽后生長緩慢，但成活率較高，因此，棗頭是棗快速繁殖的最佳外植體材料。