土生鱗傘液體發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化研究

秦靜 陶應(yīng)東 汪春涵 卜慶 宋梅 李作美

摘? 要：為了提高土生鱗傘菌絲體的產(chǎn)量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基起始pH對菌絲體干質(zhì)量的影響，并通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法確定土生鱗傘液體發(fā)酵最佳工藝條件，對影響土生鱗傘（Native scale umbrella）菌絲生長的關(guān)鍵影響因子最佳水平范圍進(jìn)行研究和探討。結(jié)果表明，土生鱗傘菌絲產(chǎn)量發(fā)酵培養(yǎng)條件的最佳組合是：溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時(shí)間9d，pH7，菌絲產(chǎn)量實(shí)測值為40.332g/100mL。此研究結(jié)果可為土生鱗傘液體發(fā)酵的試驗(yàn)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：土生鱗傘;響應(yīng)曲面法;優(yōu)化;發(fā)酵

中圖分類號(hào) X523? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? ?文章編號(hào) 1007-7731（2019）09-0029-5

Abstract：In order to increase the mycelium yield of Umbrella lucidum，the effects of initial pH，culture time，rotating speed of shaker and culture temperature on the mycelium dry mass were investigated on the basis of single factor experiment.The optimum technological conditions of liquid fermentation of Umbrella lucidum lucidum were determined by Box-Behnken design and response surface methodology.The optimum level range of the key factors affecting the mycelial growth of ative scale umbrella was studied and discussed.The results showed that the mycelial yield of native umbrella was fermented.The optimum combination of culture conditions was （100 mL）： pH;temperature;rotating speed of shaker;culture time;measured value of m ycelium yield.The mycelium yield of the optimized native umbrella was higher than that before optimization.The results could provide theoretical basis for the experimental production of liquid ferme ntation of native umbrella.

Key words：Native scale umbrella;Response surface method;Optimize;Fermentation

絕大數(shù)真菌活性物不僅留存在子實(shí)體，也可留存在發(fā)酵液和菌絲體中，特別是高等擔(dān)子菌已變?yōu)槿藗兲角笮禄钚晕锏囊粋€(gè)主要來源[1]。土生鱗傘（Native scale umbrella）又名地鱗傘，鱗環(huán)銹傘等，該菌種的主要特征為：子實(shí)體小型，叢生;菌蓋表面淡褐色;反卷較大的暗色鱗片在菌中部;菌肉為淺茶色至茶色的厚片，味道與氣味平淡。有關(guān)傘菌能夠增強(qiáng)免疫力、抗氧化和抗癌存在一部分的報(bào)道[2]，本實(shí)驗(yàn)采用Box—Behnken響應(yīng)曲面法聯(lián)合優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基，通過改進(jìn)土生鱗傘菌的培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化菌落，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間和初始pH，探究土生鱗傘液體發(fā)酵的最適條件，為土生鱗傘液體發(fā)酵的最佳生產(chǎn)供給理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌種 土生鱗傘。

1.2 儀器 電子天平（JA51001型）：上海天美天平儀器有限公司;酸度計(jì)（PHS-3C型）：上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫?fù)u床（HNY-211C型）：天津歐諾儀器股份有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A型）：上海一恒科技有限公司;BBS-DDC型超凈工作臺(tái)：山東博科科學(xué)儀器有限公司;搖瓶;培養(yǎng)皿等玻璃器皿。

1.3 試劑材料 葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaOH、HCl。

1.4 培養(yǎng)基 PDA斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL。首先將土豆除皮后切開，煮至沸騰約20min，用干凈紗質(zhì)布料過濾后加入葡萄糖與瓊脂[3]，溶化以后補(bǔ)水到1000mL，在121℃條件下[4]滅菌20min。

完全培養(yǎng)基（CM）：蛋白胨1.0%，葡萄糖2.0%，酵母膏0.2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.1%，pH值未調(diào)節(jié)。

1.5 方法

1.5.1 菌種的活化 將土生鱗傘菌養(yǎng)育在PDA斜面培養(yǎng)基于4℃冰柜內(nèi)留存，傳代1次時(shí)長為30d。菌苗傳代或活化菌苗步驟為：取土生鱗傘菌絲塊接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃條件養(yǎng)育7d[5]。取5塊長寬約2cm菌塊在培養(yǎng)基上（裝液量為100mL/250mL），靜止培養(yǎng)24h，再以轉(zhuǎn)速180r/min震蕩培養(yǎng)7d。將培育成功的土生鱗傘種子液按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的接種比例加入至發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)（100mL培養(yǎng)液裝入250mL搖瓶，加入10%的一級(jí)種子液，將轉(zhuǎn)速調(diào)為180r/min，26～27℃條件下培育5～6d），進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[6]。

1.5.2 培養(yǎng)溫度 將最適培養(yǎng)液100mL添加進(jìn)250mL搖瓶，121℃高溫滅菌20min，再接入10%的一級(jí)種子液，存放于恒溫?fù)u床上，溫度設(shè)成22、25、28、31、34℃，每個(gè)溫度設(shè)3組相同，培養(yǎng)9d后測定菌絲體產(chǎn)量，得出最適的培養(yǎng)溫度[7]。

1.5.3 轉(zhuǎn)速 將最適培養(yǎng)液100mL添加至250mL搖瓶，121℃高溫滅菌20min，再接入10%的一級(jí)種子液，放于恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速設(shè)成120、150、180、210、240r/min，每個(gè)轉(zhuǎn)速設(shè)3組相同，培養(yǎng)9d后測定菌絲產(chǎn)量，得出最適的轉(zhuǎn)速[8]。

1.5.4 培養(yǎng)時(shí)間 將最適培養(yǎng)液100mL添加至250mL搖瓶，121℃高溫滅菌20min，再接入10%的一級(jí)種子液[8]，放置于恒溫?fù)u床上，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)成5、7、9、11、13d，每個(gè)培養(yǎng)時(shí)長設(shè)3組相同，培養(yǎng)9d后測定菌絲產(chǎn)量，得出最適的培養(yǎng)時(shí)間。

1.5.5 起始pH 將最適培養(yǎng)基100mL添加至250mL搖瓶，121℃高溫滅菌20min，再接入10%的一級(jí)種子液[8]，用10%的NaOH和HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，每個(gè)pH設(shè)3組相同，培養(yǎng)9d后去測菌絲產(chǎn)量，得出最適的培養(yǎng)pH。

1.5.6 土生鱗傘培養(yǎng)條件的Box—Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 優(yōu)化土生鱗傘液體發(fā)酵采取響應(yīng)面曲線法，由單要素的實(shí)驗(yàn)成果，使用Design—expert8.0.6軟件系統(tǒng)，Box- Behnken響應(yīng)面法，自變量是培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間和起始pH[9]，響應(yīng)值是菌絲體干重，為擬和因素與指標(biāo)間函數(shù)的關(guān)系，設(shè)計(jì)4因素3水平的二次回歸方程，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，確定有關(guān)土生鱗傘液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳工藝。

1.5.7 菌絲體干重的測定 在結(jié)束養(yǎng)育后，用300目的濾網(wǎng)過濾100mL發(fā)酵液，用蒸餾水多次洗滌過濾菌絲球后[10]，在恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，用天平稱取重量即得菌絲重。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對土生鱗傘菌絲體量的影響 由圖1可知，菌絲體成長在不同培養(yǎng)溫下有差異，隨著溫度的增加土生鱗傘菌絲產(chǎn)量不斷增多[11]，到最高重量36.10g/100mL時(shí)為25℃，之后隨溫度上升，菌絲產(chǎn)量下降，菌絲體產(chǎn)量最少是在31℃，說明25℃最有利于土生鱗傘菌絲體的生長。

2.2 轉(zhuǎn)速對土生鱗傘菌絲體量的影響 由圖2可知，在不同轉(zhuǎn)速下菌絲體生長存在差異，轉(zhuǎn)速在150r/min菌絲體干重最大為37.14g/100mL，可能是因?yàn)楹趿吭诎l(fā)酵中對土生鱗傘菌絲的成長有影響[11]，在一定轉(zhuǎn)速水平，轉(zhuǎn)速越大，菌液中溶氧量越高，越有利于菌絲生長;但轉(zhuǎn)速過大又會(huì)破壞菌絲結(jié)構(gòu)，影響其生長。在150r/min時(shí)，土生鱗傘發(fā)酵的菌絲體干重最重。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對土生鱗傘菌絲體量的影響 由圖3可知，不同培養(yǎng)時(shí)間菌絲體生長在存在差異，養(yǎng)育9d菌絲體干質(zhì)量達(dá)到最大25.30g/100mL;說明土生鱗傘菌絲體的干重隨發(fā)酵時(shí)長增加呈現(xiàn)增多的改變[12]，9d為選擇的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.4 起始pH土生鱗傘菌絲體干重的影響 由圖4可知，在不同起始pH下菌絲體成長有差異，培養(yǎng)起始pH為6，菌絲體干質(zhì)量最多為25.5g/100mL;說明在一定的pH范圍內(nèi)，土生鱗傘干重隨pH的增加而增多[13]，pH為6是最佳養(yǎng)育起始pH。

2.5 Box—Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 由單要素試驗(yàn)的結(jié)果，選4個(gè)要素分別是培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間和起始pH，通過4要素3水平Box—Behnken實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法。設(shè)計(jì)29組實(shí)驗(yàn)，估計(jì)試驗(yàn)誤差采取5次中心試驗(yàn)，表2是具體組合和試驗(yàn)值。菌絲體干重（Y）為響應(yīng)值，Design Expert多元回歸擬合分析，如下多元二次回歸方程表示各要素對響應(yīng)值影響：菌絲產(chǎn)量Y=+29.04+6.40×A+1.59×B+5.63×C+5.50×D-3.35×A×B+6.47×A×C+8.02×A×D+5.41×B×C+3.06×B×D+4.89×C×D-2.10×A2-10.81×B2-4.65×C2-7.87×D2

土生鱗傘菌絲體干重整體模型P<0.01，顯示該二次方程模型是極顯著水平，說明該方程對試驗(yàn)擬合較好。根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)曲面，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間和起始pH對土生鱗傘菌絲體的影響，結(jié)果見圖5。

2.5.2 最佳工藝條件的預(yù)測與檢驗(yàn) 土生鱗傘液體發(fā)酵最佳工藝由回歸模型預(yù)測：菌絲產(chǎn)量最大值為40.332g/100mL時(shí)，培養(yǎng)溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)時(shí)間為9d和起始pH為7。為檢驗(yàn)最佳工藝條件的可靠性，培養(yǎng)前提同上后，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得菌絲體的實(shí)際值為40.247g/l00mL，說明二次回歸方程與實(shí)踐情況擬合較好。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和Box—Behnken試驗(yàn)以及用響應(yīng)面分析法建立的菌絲體干重與各單個(gè)要素間關(guān)系的回歸模型，土生鱗傘液體發(fā)酵最佳條件是：溫度25℃，轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時(shí)長9d，pH7;菌絲干質(zhì)量最重，為40.322g/100mL。對于各要素變量的二次回歸方程模型來說，該模型回歸極顯著，對試驗(yàn)擬合較好，有一定使用價(jià)值，為土生鱗傘菌絲體生物活性的提取奠定了一定的基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：王慧晴）

基金項(xiàng)目：2017年地方高校省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201711305071）;2018年安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2018A0570）;2016年安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目大學(xué)生創(chuàng)客實(shí)驗(yàn)室建設(shè)計(jì)劃（2016ckjh118）。

作者簡介：秦靜（1998—），女，安徽泗縣人，研究方向：食品生物技術(shù)。? ?*通訊作者? ? ?收稿日期：2019-03-30