低乳糖發(fā)酵乳的制備

陶志強 王麗 馬雁 陳萱 趙瑞峰 張棟 陸震 印伯星 關成冉

摘? 要：目的：制備一款低乳糖發(fā)酵乳。方法：以12%全脂乳粉與6%蔗糖為基礎，利用乳糖酶直接酶解，通過單因素實驗及正交實驗對乳糖酶的添加量、酶解溫度及酶解時間進行優(yōu)化，并對制備的發(fā)酵乳的發(fā)酵特性及質(zhì)構進行分析。結果：酶添加量0.8μL/g，酶解溫度46℃，水解時長4.5h，乳糖的水解率為99.54%。在此條件下制備低乳糖發(fā)酵乳，低乳糖發(fā)酵乳發(fā)酵過程中酸度變化快，酸度值為78.20°T，表觀黏度在9.82～15.82Pa·s，觸變性最大值為8.96Pa·s。

關鍵詞：低乳糖發(fā)酵乳;乳糖酶;水解;質(zhì)構

中圖分類號 TS252.54? ?文獻標識碼 A? ?文章編號 1007-7731（2019）09-0025-5

Abstract：Objective：Preparation fermented milk with low lactose.Method：The 12% whole milk powder and 6% sucrose was digested by lactase enzyme.By single factor test and orthogonal test， the optimization of lactase dosage， temperature and time of enzymolysis were optimized.And then the fermentation characteristics and texture of the prepared fermented milk were analyzed.Result：The results showed that the optimized amount of enzyme addition， the hydrolysis temperature and the hydrolysis time were seperately 0.8μL/g， 46℃and 4.5h.The hydrolysis rate of lactose in fermented milk is 99.54%.Under this condition， the low lactose fermented milk was prepared.The acidity of the low lactose fermented milk was rapidly changed， and the acidity value was 78.2。T.The apparent viscosity was between 9.82Pa·s and 15.82Pa·s， and the maximum thixotropy was 8.96Pa·s.

Key words：Low lactose fermented milk; Lactase; Hydrolysis; Texture

隨著我國經(jīng)濟社會的迅速發(fā)展，人民生活的持續(xù)改善，人們對食品的要求也越來越高。近幾年來，我國乳業(yè)發(fā)展十分迅速，與世界平均水平的差距正逐漸縮小。目前，制約我國乳業(yè)發(fā)展的一個重要原因就是消費者中普遍存在乳糖不耐癥[1]。乳糖需要乳糖酶的協(xié)助才能被消化吸收，而我國大多數(shù)人都存在不同程度的乳糖酶缺乏癥，腸上皮細胞的乳糖酶在體內(nèi)缺乏或處于活性不足的邊緣，乳糖不能被完全消化吸收，大量的短鏈脂肪酸和氫氣在腸內(nèi)積聚，從而出現(xiàn)腹脹甚至嘔吐、腹瀉、消化不良等癥狀[2-3]。乳酸菌發(fā)酵乳可在一定程度上緩解乳糖不耐癥[4]，然而在乳酸菌發(fā)酵乳發(fā)酵過程中，僅有20%～30%的乳糖被乳酸菌分解，其乳糖水解率相比較于酶解法來說很低。為此，研究者利用商品級乳糖酶[5]，配合進口奶粉和混合菌株，應用酶解技術和發(fā)酵技術制備低乳糖發(fā)酵乳，以改善國內(nèi)乳制品市場結構，滿足更多的消費者的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與主要試劑 本實驗所用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳酸桿菌混合菌株HT456B購自意大利SACCO。全脂乳粉，揚大康源;脫脂乳粉，新西蘭;乳糖、蔗糖、乳糖酶、胰蛋白胨、葡萄糖吐溫-80甲醇、1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）等化學試劑，國藥集團。

1.1.2 儀器與設備 JF-SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMYG公司;PL2002電子天平，梅特勒公司;GYB60-08高壓均質(zhì)機，上海東華高壓均質(zhì)機廠;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;DNP-9272恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司;ZXWY-Vortex-Genie渦旋儀，美國Scientific Industries公司;高效液相色譜儀，Agilent 1260 Infinity;TMS-PRO質(zhì)構儀，美國TMS公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏10g、酵母浸膏5g、無水醋酸鈉5g、胰蛋白胨10g、葡萄糖20g、吐溫-80 1mL、K2HPO4 2g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、水1000mL（固體培養(yǎng)基按1.5%加入瓊脂）。12%脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉120g，水880g。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化 取實驗室凍藏的菌粉，于MRS液體培養(yǎng)基中活化3代，12%脫脂乳培養(yǎng)基活化第4代，將活化好的菌株4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 原料乳的配制 將全脂乳粉與蔗糖以12%和6%的質(zhì)量比進行配置，過篩;將牛乳進行均質(zhì)，低壓40～50Bar，高壓200～220Bar;將均質(zhì)后的牛乳定容150g裝瓶，放入水浴鍋進行巴氏殺菌。待產(chǎn)品冷卻后，4℃冷藏備用。

1.2.3 酶解條件的優(yōu)化

1.2.3.1 添酶量的優(yōu)化 將配置好的乳在43℃分別以0.13μL/g、0.27μL/g、0.40μL/g、0.53μL/g、0.67μL/g、0.80μL/g的濃度添加乳糖酶，水解2h后，95℃滅酶5min，冷卻后于4℃冷藏備用。將上述樣品進行樣品前處理后進行HPLC色譜分析，確定乳糖酶的最適添加量。

1.2.3.2 酶解溫度的優(yōu)化 將配置好的乳在37℃、40℃、43℃、46℃、49℃、52℃、55℃時，分別以0.40μL/g的濃度比添加乳糖酶，水解2h后，95℃滅酶5min，冷卻后于4℃冷藏備用。將上述樣品進行樣品前處理后進行HPLC色譜分析，確定乳糖酶酶解的最適溫度。

1.2.3.3 酶解時間的優(yōu)化 將配置好的乳在43℃分別以0.40μL/g的濃度比添加乳糖酶，在43℃分別水解0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h，水解結束后，95℃滅酶5min，冷卻后于4℃冷藏備用。將上述樣品進行樣品前處理后進行HPLC色譜分析，確定乳糖酶酶解的最適時間。將以上牛乳以3%的接菌量，在42℃發(fā)酵至酸度60℃，并在4℃后酸化12h，取10mL樣品備用[6]。

1.2.4 酶解條件正交優(yōu)化 確定了乳糖酶酶解的添酶量、酶解溫度和酶解時間以后，將篩選出來的最佳添酶量、酶解溫度和酶解時間設計3因素3水平正交實驗對低乳糖牛乳進行優(yōu)化。正交因素水平見表1。

1.2.5 發(fā)酵乳參數(shù)測定

1.2.5.1 乳糖含量 樣品衍生采用王柳[7]等方法進行，利用高效液相色譜進行乳糖含量的測定。測定條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6×150mm，5μm），流動相為純乙腈和濃度為100mmol/L，pH5.5的乙酸銨溶液，體積比為22∶78;流速為1mL/min;柱溫為30℃;進樣量為10μL;測定波長選擇244nm。

1.2.5.2 酸度 參照國標[8]的方法采用NaOH滴定法進行測定。

1.2.5.3 乳酸菌活菌總數(shù) 參照國標[9]的方法采用平板記數(shù)法進行測定。

1.2.5.4 低乳糖發(fā)酵乳流變特性 利用Malvern Kinexus Pro旋轉(zhuǎn)流變儀，選用CP2/50 SR0162 SS錐板，對樣品的觸變性和表觀粘度進行測定[8]。

1.2.5.5 表觀粘度 在25℃、恒定剪切速率1.0-1的條件下，剪切時間為2min，每10h采集1個數(shù)據(jù)點，檢測樣品的表觀粘度隨時間的變化情況。

1.2.5.6 觸變性及觸變環(huán)面積 在25℃，分升速和降速2個步驟進行測定，首先升速過程剪切速率由0.1-1線性升高到100-1，每2h采集1個數(shù)據(jù)，測定時間為2min;降速過程剪切速率到達100-1后再線性降速到0.1-1，每2h采集1個數(shù)據(jù)，測定時間為2min，檢測樣品剪切應力隨剪切速率的變化關系。

2 結果與分析

2.1 乳糖標準曲線的制作 精準吸取標準單糖溶液2μL、4μL、6μL…14μL，以峰面積（y）與其中乳糖含量（x）制作標準曲線、回歸方程、相關系數(shù)。乳糖標準曲線如圖1所示。

2.2 乳糖酶酶解條件的選擇

2.2.1 酶添加量的優(yōu)化 為了降低牛乳中乳糖的含量，采用酶水解法[10]，進行酶添加量優(yōu)化的實驗。由圖2可知，在43℃，酶解2h的條件下，隨著添酶量的增加，乳糖酶解率逐漸增加，當超過0.53μL/g趨于平緩。表明隨著乳糖酶的添加量的逐漸增大，牛乳中的乳糖逐漸被水解，而當添酶量達到一定數(shù)值以后，剩余可被水解的乳糖變少，此時酶解率很難再升高。因此，在使用乳糖酶酶解乳糖時，乳糖酶的添加量在0.53μL/g以上即可。

2.2.2 溫度的優(yōu)化 為了選出合適的溫度以水解牛乳中的乳糖，使用實驗方法中所述的幾個溫度，進行酶解溫度優(yōu)化的實驗[11]。其他條件保持不變，酶添加量150g到乳中，0.06mL即4×10-4mL/g，酶解2h的情況下，只改變酶解溫度。由圖3可知，隨著溫度的增加，乳糖酶解率先增高，而后逐漸降低，這是因為乳糖酶有1個最適反應溫度。隨著溫度的升高，乳糖酶的水解效率逐漸增高，在達到最適溫度后，溫度的繼續(xù)升高會使乳糖酶逐漸失活，從而使水解效率下降。因此，在使用乳糖酶酶解乳糖時，溫度以46℃左右為宜。

2.2.3 時間的優(yōu)化 為了降低牛乳中乳糖的含量，采用酶水解法，添加0.06mL的乳糖酶，在43℃分別水解0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h，進行酶解時間優(yōu)化的實驗。其他條件保持不變，在添酶量0.06mL，酶解溫度43℃的條件下只改變酶解時間。由圖4可知，隨著時間的增加，乳糖酶解率先逐漸增加，而后趨于平緩。為保證酶解率，在使用乳糖酶酶解乳糖時，酶解時間以3h以上為宜。

2.3 乳糖酶水解條件正交優(yōu)化 為了得出水解率更高的低乳糖牛乳，根據(jù)優(yōu)化后3個因素的數(shù)據(jù)進行正交優(yōu)化實驗，正交優(yōu)化表如表2所示。根據(jù)正交實驗結果可知，酶解時間產(chǎn)生的影響最大，酶解溫度產(chǎn)生的影響最小，所以乳糖酶最優(yōu)水解條件為A3B3C3，即乳糖酶的添加量0.8μL/g，酶解溫度46℃，水解時間4.5h。由于得到的最優(yōu)組合在正交設計中沒有，故需要進行驗證實驗，驗證實驗的結果為98.59%，優(yōu)于正交表中最高的第4組的值。將最優(yōu)一組的低乳糖牛乳發(fā)酵，得出乳糖水解率為99.54%的低乳糖發(fā)酵乳。

2.4 低乳糖發(fā)酵乳的發(fā)酵特性

2.4.1 發(fā)酵過程中酸度的變化 為了解低乳糖發(fā)酵乳發(fā)酵過程中酸度的變化，將低乳糖發(fā)酵乳與普通發(fā)酵乳同時進行發(fā)酵，每隔1h測定1次酸度，酸度變化結果如圖5所示[12]。從圖5可以看出，在發(fā)酵的初期，發(fā)酵乳的酸度變化相對較小。在2～4h，發(fā)酵乳的酸度迅速增加，酸度隨著發(fā)酵時間的延長而增加[13]。比較2種牛乳發(fā)酵的酸度，同一時間加酶的牛乳酸度比普通牛乳酸度大，這是因為乳糖酶將牛乳中的乳糖水解稱為葡萄糖和半乳糖，發(fā)酵時乳酸菌可以直接利用這些糖進行發(fā)酵產(chǎn)酸，所以酸度變化較快[14]。

2.4.2 發(fā)酵過程中活菌總數(shù)的變化 為了研究低乳糖發(fā)酵乳發(fā)酵期間活菌總數(shù)的變化，將低乳糖乳與普通牛乳同時進行發(fā)酵，每2h取樣1次以查看發(fā)酵過程中菌數(shù)的變化，結果如圖6所示。由圖6可知，普通牛乳經(jīng)過發(fā)酵后菌數(shù)從0.07×109CFU/mL增長到0.93×109CFU/mL，菌數(shù)有了較大幅度的增長，加酶后牛乳發(fā)酵后菌數(shù)從0.07×109CFU/mL增長到1.54×109CFU/mL，可以看出，加酶后菌數(shù)約為普通牛乳的2倍，說明加酶有助于乳酸菌的生長。這是因為牛乳發(fā)酵時乳酸菌分解乳糖產(chǎn)生乳酸，牛乳的pH值下降，乳酸菌的生長受到了抑制，在有乳糖酶的參與后，由于酶的降解，乳糖被水解為葡萄糖和半乳糖，這種單糖可以直接被乳酸菌所利用。與此同時，乳糖酶使乳糖含量變小，反而沒有產(chǎn)生乳酸，減弱了乳糖菌的抑制作用。

2.4.3 低乳糖發(fā)酵乳的流變特性 為了研究低乳糖發(fā)酵乳產(chǎn)品的感官指標，將其與普通發(fā)酵乳的表觀黏度與觸變性的進行了實驗[15]，結果如圖7、8、9所示。從圖7可以看出，4組樣品的表觀粘度都隨著剪切時間的增加而減少，最后趨于平穩(wěn)。這是由于剪切使得樣品內(nèi)部粒子所形成的結構遭到破壞，從而出現(xiàn)粘度隨著剪切時間的延長而下降，即表現(xiàn)出切稀現(xiàn)象。樣品的表觀粘度在9.82～15.82Pa·s。與普通發(fā)酵乳相比較，低乳糖發(fā)酵乳表觀黏度普遍升高，這可能是因為它發(fā)酵時乳清析出較少所致。

觸變性流體的機理可以理解為隨著剪切速率的增加，粒子間結合的結構受到破壞，粘度變小。從圖8、圖9看出，低乳糖發(fā)酵乳觸變性的最大值為8.96Pa·s，而普通發(fā)酵乳觸變性的最大值為7.66Pa·s。低乳糖發(fā)酵乳觸變性相對較大，這可能是因為牛乳經(jīng)過乳糖酶水解后，牛乳的黏度升高，導致低乳糖發(fā)酵乳更為粘稠。

3 結論

本實驗使用商品級的乳糖酶，通過單因素實驗確定乳糖酶的加酶量、酶解溫度和時間，利用正交實驗優(yōu)化低乳糖發(fā)酵乳的酶解條件，并對優(yōu)化后低乳糖發(fā)酵乳的發(fā)酵特性進行了研究，得出以下結論：

（1）采用單因素和正交實驗對低乳糖發(fā)酵乳制備條件進行優(yōu)化，以低乳糖牛乳中乳糖水解率作為評價指標，確定芒果發(fā)酵乳的制備條件為：添酶量0.8μL/g，酶解溫度46℃，酶解時間4.5h，所得發(fā)酵乳中乳糖水解率為99.54%，優(yōu)于普通發(fā)酵乳30%的水解率。

（2）對低乳糖發(fā)酵乳進行分析，發(fā)現(xiàn)本研究制備的低乳糖發(fā)酵乳口味適宜，口感醇厚。在發(fā)酵2～6h內(nèi)，酸度由23.9°T增加到78.2°T，略高于普通發(fā)酵乳的75.1°T?；罹鷶?shù)在發(fā)酵期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，活菌數(shù)在6h內(nèi)最高達1.74×109CFU/mL，2h后降到1.54×109CFU/mL，均優(yōu)于普通發(fā)酵乳的1.34×109CFU/mL和0.93×109CFU/mL。

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（責編：張宏民）

基金項目：國家自然科學基金——青年科學基金，31700079;枯草桿菌細胞密度依賴型自誘導表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制;江蘇省自然科學基金——青年科學基金，BK20170496;基于細胞密度的枯草桿菌自誘導表達系統(tǒng)的表達調(diào)控機制及適用性研究。

作者簡介：陶志強（1997—），男，江蘇啟東人，研究方向：發(fā)酵乳工藝。? ?*通訊作者? ?收稿日期：2019-03-20