磷酸肌酸鈉通過miR-25-3p/肌漿網(wǎng)Ca2+泵-2a信號通路改善多柔比星誘導(dǎo)大鼠心肌損傷

張雪潔，堯 青，胡 玲，柯志強，張 波，3，孟祥雯，楊曉松

（湖北科技學(xué)院1.藥學(xué)院，2.糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100；3.三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院，湖北 宜昌 44300）

臨床上常單獨使用多柔比星（doxorubicin，DOX）或與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合用于治療實體腫瘤、淋巴瘤和兒童白血病[1]，但因其嚴重的心臟毒性限制其在臨床的應(yīng)用[2]。研究結(jié)果顯示，DOX心臟毒性主要因其介導(dǎo)活性氧自由基（reactive oxygene species，ROS）大量產(chǎn)生引起心肌組織脂質(zhì)過氧化，而抗氧化活性的下降，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細胞凋亡[3]。此外，DOX還能刺激心肌細胞線粒體和肌漿網(wǎng)釋放Ca2+從而加劇胞漿內(nèi)Ca2+超載[4]。肌漿網(wǎng) Ca2+泵-2a（sarco/endoplasmic reticulumCa2+ATPase，SERCA2a）是分布在哺乳動物心肌中的重要Ca2+泵，在心動周期中控制Ca2+的輸運，通過水解ATP獲得的化學(xué)能源輸運Ca2+進入肌漿網(wǎng)內(nèi)[5]。SERCA2a通過維持Ca2+平衡確保心肌細胞的正常生理活動。當心肌細胞內(nèi)肌漿網(wǎng)Ca2+吸收不夠，將會導(dǎo)致心肌細胞收縮，可用的Ca2+減少，最終導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能出現(xiàn)障礙[6]。已有研究表明，DOX在心肌細胞中產(chǎn)生的H2O2會抑制SERCA2a的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，SERCA2a攝取Ca2+的能力顯著下降[7]。因此，SERCA2a在DOX心臟毒性中發(fā)揮重要調(diào)控作用，具體調(diào)控機制還不清楚。

微RNA（microRNA，miRNA，miR）作為基因表達的重要調(diào)節(jié)物，通過與目的基因mRNA的3’UTR區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平抑制基因表達，在許多生理及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8]。在多種心血管疾病如心律失常、左心室肥厚和重構(gòu)中[9]都可檢測到miR-25的異常表達，如在心力衰竭的心肌組織中miR-25高表達，抑制miR-25的表達可增強心臟收縮力從而改善心力衰竭[10]。據(jù)報道，在主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)小鼠心衰模型中，miR-25靶向SERCA2a mRNA3′UTR，抑制SERCA2a的表達，是主動脈弓縮窄（transverse aortic constricition，TAC）誘導(dǎo)心衰的重要因素[11]。也有研究認為，miR-25在離體心肌細胞延遲Ca2+的攝取，抑制miR-25表達可以提高SERCA2a表達水平，從而達到改善心臟功能的目的[12]。

磷酸肌酸鈉（creatine phosphate sodium，CP）是一種小分子高能磷酸化合物，也是心肌細胞最主要和最直接的功能物質(zhì)，可快速進入細胞并在短時間內(nèi)即達到有效濃度。具有保護細胞結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定心肌細胞電生理平衡的功能[13]，在臨床上作為心肌保護藥物，主要用于治療心力衰竭和心肌梗死等的治療藥物[14-15]，近年來也在臨床上用于DOX所致心肌損傷的保護藥物[16]，但其保護機制目前還不清楚。本研究采用DOX誘導(dǎo)SD大鼠心肌損傷以及誘導(dǎo)心肌細胞H9C2損傷作為體內(nèi)外模型，采用CP進行干預(yù)，評價CP對DOX所致心肌損傷的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

DOX粉末和CP（美國Sigma公司）；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cystine，NAC）（中國Meilunbio公司）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Gibco公司）；HE染色試劑盒和Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol試劑（美國Ambion公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（TUNEL Apoptosis Detection Kit FITC）（上海翊圣生物科技有限公司）；RT-PCR試劑盒（日本Takara公司）；細胞裂解液、蛋白酶抑制劑（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、BCA蛋白定量/濃度測定試劑盒（中國Meilunbio公司）；化學(xué)發(fā)光（electro-chemilumines-cence，ECL）顯影液，蛋白酶抑制劑（protease inhibitor cocktail）（美國Thermo Fisher公司）；兔抗人SERCA2a多克隆抗體（中國ABclonal公司），小鼠抗人超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）單抗（美國Abcam公司），兔抗人活化的胱天蛋白酶3多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG抗體（二抗）（美國Biosharp公司）。

1.2 動物和DOX誘導(dǎo)大鼠心肌損傷模型制備

40只SD雄性大鼠，實驗動物合格證號：SCXK（京）2016-0011，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。SD大鼠隨機分為3組，以下給藥均為隔天1次（給藥持續(xù)26 d）。正常對照組（n=10），ip給予生理鹽水 5 mL·kg-1；DOX組（n=15），前3次ip給予生理鹽水5 mL·kg-1，之后ip給予生理鹽水30 min后，再ip給予DOX 2 mg·kg-1，共給藥7次；CP+DOX組（n=15），前3次ip給予CP 200 mg·kg-1，之后ip給予CP 200 mg·kg-130 min后，再ip給予DOX 2 mg·kg-1，共7次，之后ip給予CP 200 mg·kg-13次，停藥后繼續(xù)喂養(yǎng)7周，處死大鼠取心肌組織-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HE染色觀察大鼠心肌組織病理變化

固定后的心臟組織按照常規(guī)方法進行組織脫水、透明、浸蠟、包埋以及切片。之后將石蠟切片放入二甲苯中脫蠟10 min，經(jīng)100%～70%梯度乙醇浸泡5 min，使用PBS沖洗5 min，滴加50 μL蘇木精染色15 min后用自來水沖洗，滴加1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒后，使用1%氨水返藍1 min，自來水沖洗，接著滴加50 μL伊紅染色5 min，在80%～95%梯度乙醇中快洗，100%乙醇浸泡10 min（處理2次），二甲苯透明10 min（處理2次），中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 Masson染色檢測心肌組織膠原纖維沉積

將心尖組織切片脫蠟后放在二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，再分別用95%，90%，80%，70%乙醇浸泡5 min，之后滴加Bouin液在濕盒中過夜，第2天流水沖洗至黃色消失，天青石藍染色液滴染2～3 min后稍水洗，之后用Mayer蘇木素染色液滴染2～3 min后水洗，酸性乙醇分化液分化約10 s，接著流水沖洗10 min，麗春紅品紅染色液滴染2 min，蒸餾水沖洗；磷鉬酸溶液處理約10 min，傾去上液，直接滴入苯胺藍染色液染6 min，0.1%～0.3%冰醋酸溶液處理約30 s，100%乙醇脫水2 min，二甲苯透明10 min，吹干后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察膠原累積。

1.5 TUNEL染色法檢測大鼠心肌組織細胞凋亡

石蠟組織切片常規(guī)脫蠟至水，用PBS輕輕潤洗切片并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體；每個樣本上滴加100 μL蛋白激酶K工作液，室溫孵育20 min；滴加100 μL 1× Equilibration 緩沖液室溫孵育10～30 min，加入50 μL TdT孵育緩沖液37℃孵育60 min，用PBS洗5 min，共2次；在暗室中將載玻片浸入DAB溶液中，室溫孵育5 min，用H2O終止反應(yīng)；封片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。采用Image Pro軟件對圖片結(jié)果進行分析，選取陽性染色部位光密度（intensity absorbance，IA）值與圖片的面積之比即為平均光密度值，以此值來半定量細胞凋亡。

1.6 H9C2心肌細胞培養(yǎng)和分組

大鼠心肌細胞系H9C2（上海復(fù)旦IBS細胞資源中心）；H9C2細胞在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)于含10%FBS及1%青、鏈霉素混合液（100×）的DMEM培養(yǎng)基中，細胞融合度為80%～90%時傳代。將處于對數(shù)生長期的H9C2細胞種于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后給藥。分組① DOX 1 μmol·L-1處理心肌細胞H9C2不同時間（0，3，6，12和24 h），收集細胞。分組② 細胞分為5組：細胞對照組（0.1%DMSO），DOX 1 μmol·L-1組，CP 1 mmol·L-1組，CP 1 mmol·L-1+DOX 1 μmol·L-1組，NAC 0.5 mmol·L-1+DOX 1 μmol·L-1組，處理24 h后收集細胞。

1.7 CCK8檢測H9C2心肌細胞存活率

取1.6分組②前4組的細胞，置37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑，然后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，采用酶標儀測定450 nm處的吸光值（A450nm）。細胞存活率（%）=（實驗組A450nm-空白孔A450nm）/（細胞對照組A450nm-空白孔A450nm）×100%。

1.8 熒光定量PCR檢測大鼠心肌組織和H9C2心肌細胞中miR-25-3p的表達

取1.2分組大鼠心肌組織0.2～0.4 μg，加入1 mL Trizol，采用電動勻漿機將組織磨碎，然后加入1/5體積的氯仿，渦旋振蕩混勻后靜置10 min，4℃條件下12 000×g離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，加入等體積異丙醇，渦旋振蕩后靜置10 min，12 000×g，4℃條件下離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，12 000×g，4℃條件下離心5 min，吸干乙醇，通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，加入適量無RNA酶無菌水溶解沉淀，超微量核酸分光光度計測定RNA濃度及純度，-20℃保存以備后續(xù)熒光定量分析。1.6分組①和分組②的細胞采用Trizol裂解H9C2細胞，后續(xù)總RNA提取同上；以抽提的總RNA作為模板，采用莖環(huán)引物rno-miR-25-SLP合成cDNA，再以cDNA為模板，SYBR Green I作為熒光染料，U6作為內(nèi)參，rno-miR-25-3p和UDP作為正反引物檢測miR-25-3p的表達水平，用2-△△Ct法計算待測基因的相對表達。引物序列見表1。

1.9 Western印跡法檢測大鼠心肌組織和H9C2心肌細胞SOD2、SERCA2a和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達

取1.2分組大鼠心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA，冰浴條件下采用電動勻漿機打碎組織，冰浴10～20 min，4℃條件下以12 000×g，離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管，采用BCA法測定蛋白濃度；1.6分組②前4組細胞加入含蛋白酶抑制劑的RIPA，充分裂解細胞，后續(xù)蛋白抽提方法同上；SDS-PAGE蛋白電泳分別采用4%的濃縮膠和10%的分離膠，上樣量為25 μg總蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，然后更換為一抗（1∶1000）溶液于4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min，二抗（1∶5000）溶液室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL顯影液顯影，經(jīng)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集，Image J軟件進行半定量分析，用目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶IA值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

Tab.1 Sequence of primers for RT-PCR

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用±s表示。采用GraPhPad Prism 5 Project軟件進行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析和t檢驗進行分析處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 磷酸肌酸鈉對多柔比星誘導(dǎo)大鼠心肌組織病理損傷的影響

大鼠心肌組織HE和Masson染色結(jié)果（圖1）所示，DOX組心肌組織肌纖維排列紊亂，甚至部分肌原纖維溶解、斷裂，膠原纖維增多；相對于DOX組，CP+DOX組心肌組織肌纖維排列較為整齊，肌纖維較完整，膠原沉積量減少，心肌組織病理病變得到改善。

Fig.1 Effect of creatine phosphate sodium（CP）on pathological changes in myocardial tissues of rats with myocardial injury induced by doxorubicin（DOX）.Rats were ip injected with normal saline（5 mL·kg-1）or DOX（2 mg·kg-1），or CP（200 mg·kg-1）+DOX once every other day，for 7 times，and then were fed for another 7 d after the last injection.Arrows show the collagen accumulation in rat myocardial tissue.

2.2 磷酸肌酸鈉對多柔比星誘導(dǎo)大鼠心肌組織細胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果（圖2）所示，與正常對照組比較，DOX組心肌組織的棕黃色陽性細胞核增多，約為正常對照組的4倍（P＜0.05）；CP+DOX組陽性染色細胞核明顯少于模型組，約為DOX組的1/2（P＜0.05），表明CP能夠減輕DOX誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

Fig.2 Effect of CP on apoptotic rate of myocardiocytes of rats with myocardial injury induced by DOX（TUNEL staining）.See Fig.1 for the rat treatment.Arrows show apoptosis cells in the rat myocardial tissues.B：semi-quantitative result of A.IA：intensity absorbance.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

2.3 磷酸肌酸鈉對多柔比星誘導(dǎo)大鼠心肌和H9C2細胞miR-25-3p mRNA表達的影響

熒光定量PCR法檢測結(jié)果（表2）顯示，與正常對照組比較，DOX組大鼠心肌組織中miR-25-3p表達上升了4.57倍（P＜0.05），而CP+DOX組miR-25-3p表達水平相對DOX組下降77.3%（P＜0.05），基本恢復(fù)到正常對照組的水平。

Tab.2 Effect of CP on miR-25-3p mRNA in myocardial tissue of rats with myocardial injury induced by DOX

熒光定量PCR分析結(jié)果（圖3A）顯示，H9C2細胞miR-25-3p表達水平隨著DOX刺激時間的延長而持續(xù)升高，呈時間依賴性上調(diào)（r=0.9681，P＜0.05）。與 DOX 1 μmol·L-1組比較，NAC+DOX 組和CP+DOX組miR-25-3p表達水平均顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖3B）。

Fig.3 Effect of CP or N-acetylcysteine（NAC）on miR-25-3p mRNA expression in H9C2 cells induced by DOX by quantitative real-time PCR（qRT-PCR）.A：H9C2 cells were treated with DOX 1 μmol·L-1for 0，3，6，12 and 24 h.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group（0 h）.B：H9C2 cells were pretreated with CP 1 mmol·L-1or NAC 0.5 mmol·L-1 for 1 h，then DOX 1 μmol·L-1for 24 h.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

2.4 磷酸肌酸鈉對多柔比星誘導(dǎo)H9C2心肌細胞活力的影響

CCK8檢測結(jié)果（圖4）顯示，DOX 1 μmol·L-1組H9C2細胞存活率顯著降低（P＜0.05）；與DOX組相比，CP+DOX組細胞存活率升高（P＜0.05），表明CP 1 mmol·L-1能夠明顯改善DOX對H9C2細胞存活的抑制作用。

Fig.4 Effect of CP on H9C2 cell viability incluced by DOX.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

2.5 磷酸肌酸鈉對多柔比星誘導(dǎo)大鼠心肌組織和H9C2細胞SOD2、SERCA2a和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達水平的影響

Western印跡法檢測結(jié)果（圖5A和B）顯示，與正常對照組比，DOX組SOD2和SERCA2a蛋白表達水平分別下降了約30%和20%（P＜0.05），而活化胱天蛋白酶3蛋白上升了約50%；與DOX組比較，CP+DOX組SOD2和SERCA2a蛋白表達上調(diào)（P＜0.05），顯著降低了活化的胱天蛋白酶3蛋白表達水平。

Fig.5 Effect of CP on protein expressions of superoxide dismutase 2（SOD2），sarco/endoplasmic reticulum-Ca2+ATPase（SERCA2a）and cleaved-caspase 3 in rats with myocardial injury induced by DOX by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B：semi-quantitaive results of A.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

Western印跡結(jié)果（圖6A和B）顯示，DOX刺激H9C2細胞3 h，SERCA2a蛋白表達上升，隨后開始下降，直至24 h，其表達水平遠低于0 h；而活化的胱天蛋白酶3蛋白表達水平呈時間依賴性上升（r=0.8124，P＜0.05）。當CP 1 mmol·L-1預(yù)處理H9C2細胞1 h后，再加生理鹽水或DOX 1 μmol·L-1繼續(xù)處理24 h，結(jié)果如圖（圖6C和D所示），與細胞對照組相比，CP組SOD2，SERCA2a和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達均無明顯變化；與DOX組比較，CP+DOX組SOD2和SERCA2a蛋白表達上調(diào)（P＜0.05），而活化的胱天蛋白酶3蛋白表達下調(diào)（P＜0.05）。

Fig.6 Effect of CP on protein expressions of SOD2，SERCA2a and cleaved-caspase 3 in H9C2 cells induced by DOX by Western blotting.See Fig.4 for the cell treatment.B：semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with 0 h.D：semi-quantitative result of C.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，CP在一定程度上改善DOX所致大鼠心肌組織肌原纖維紊亂，減少膠原蛋白的累積和心肌組織細胞凋亡；另一方面，DOX減弱心肌組織抗氧化活性蛋白SOD2和涉及Ca2+動態(tài)平衡調(diào)控的SERCA2a蛋白的表達，上調(diào)凋亡信號活化胱天蛋白酶3蛋白和miR-25-3p表達。CP的干預(yù)部分緩解DOX誘導(dǎo)SOD2和SERCA2a的表達下調(diào)，降低活化的胱天蛋白酶3蛋白和miR-25-3p的表達水平。以上結(jié)果表明，CP的干預(yù)改善DOX誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞凋亡，同時miR-25-3p/SERCA2a信號通路發(fā)生相應(yīng)的變化。由此，CP緩解DOX誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷，可能機制涉及CP對DOX誘導(dǎo)miR-25-3p/SERCA2a信號通路的抑制，改善心肌細胞內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡，減少心肌細胞凋亡。

DOX處理H9C2細胞3 h，miR-25-3p的表達水平無變化，從第6 h開始，miR-25-3p的表達水平呈時間依賴性上升；miR-25-3p靶基因SERCA2a的表達水平在DOX刺激3 h時急劇增加，隨后隨著時間的延長而逐漸下降，24 h的表達水平要遠低于0 h，在最初3 h的急劇增加可能是細胞應(yīng)激反應(yīng)，起到自我保護的作用，隨后SERCA2a受到miR-25-3p的干擾而表達水平逐漸下降；CP預(yù)處理1 h后再給予DOX刺激H9C2 24 h，結(jié)果同動物實驗結(jié)果一致，CP改善DOX誘導(dǎo)SOD2和SERCA2a蛋白表達下調(diào)，抑制活化的胱天蛋白酶3蛋白和miR-25-3p表達增加；我們之前報道NAC的干預(yù)減輕DOX誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[17]。本研究CCK8實驗結(jié)果表明，NAC和CP都能顯著改善DOX的心肌細胞毒性作用。以上結(jié)果說明，CP具有較好的抗氧化活性的同時，可能通過抗氧化作用來抑制DOX誘導(dǎo)miR-25-3p/SERCA2a信號通路的活性，改善心肌細胞內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡，減輕DOX的心肌毒性。

DOX所致心肌損傷的機制主要涉及β腎上腺素受體途徑、細胞內(nèi)Ca2+途徑和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡，SERCA2a的表達上調(diào)能夠減輕DOX心肌毒性[18-19]。CP在臨床上應(yīng)用于心臟手術(shù)或癌癥患者化療前的心臟保護作用，但其作用機制并不明確。本研究體內(nèi)外實驗結(jié)果表明，CP具有較好的抗氧化活性，并顯著改善DOX心臟毒性。深入研究發(fā)現(xiàn)，CP抑制DOX誘導(dǎo)miR-25-3p表達上調(diào)，SERCA2a的表達下調(diào)。綜上所述，CP有可能通過調(diào)控miR-25-3p/SERCA2a信號通路改善細胞內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡，減輕DOX誘導(dǎo)的心臟毒性，揭示了CP改善DOX心臟毒性的可能調(diào)控機制，為臨床預(yù)防和改善DOX的心臟毒性提供一定的理論基礎(chǔ)和研究思路。