一株煙草青枯拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定和培養(yǎng)特性研究

吳 翔，甘炳成，謝麗源，譚 昊，黃忠乾，彭衛(wèi)紅，唐 杰

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南區(qū)域農(nóng)業(yè)微生物資源利用科學(xué)觀測實驗站，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南山地農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，四川 成都 610066）

青枯病是由青枯勞爾氏菌（Ralstonias olanacearum）引起的細(xì)菌性枯萎病，該病原菌可以侵染50多個科近200多種植物［1］，是一種在世界范圍內(nèi)危害大、分布廣、造成損失極其嚴(yán)重的植物病害之一。如今，青枯病的侵染影響范圍越來越廣，其感染的植物種屬也在不斷增加。就農(nóng)業(yè)栽培作物而言，茄科類作物受R.solanacearum的影響最為嚴(yán)重，其中以煙草、番茄、辣椒等作物更為突出。煙草青枯病于1908年被Smith［2］發(fā)現(xiàn)，它是一種土傳病害，目前煙草青枯病在我國大部分煙草種植區(qū)大面積發(fā)病，造成的損失已居煙草病害的第4位［3］，引起廣大科學(xué)工作者的重視。目前有化學(xué)防治、選育抗病煙草品種、改善耕作制度管理、生物防治等方法應(yīng)用于煙草青枯病的防治，與常用的化學(xué)防治方法相比，生物防治方法具有成本低、無二次污染和效果持久等優(yōu)點，而相對于選育抗病煙草品種和耕作制度管理兩種方法，生物防治方法分別具有研發(fā)周期相對短以及節(jié)約勞力等優(yōu)點，因此生物防治是目前煙草青枯病防治中最熱門的研究方向，而篩選更多效果好、易培養(yǎng)的拮抗菌是煙草青枯病生物防治的基礎(chǔ)工作，具有重要意義。本研究從高粱根際土中分離獲得的一株細(xì)菌MT-002-B-7對煙草青枯病原菌具有良好的拮抗效果，對該菌進行了鑒定，并對其拮抗菌液的發(fā)酵條件進行了研究，以期為該菌用于煙草青枯病防治的生物有機肥研制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草青枯病病原菌：由云南省煙草科學(xué)研究院惠贈。

TM培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，葡萄糖5.0 g，酪素水解物（Trypticase）1.0 g，瓊脂粉18.0 g，蒸餾水1 000 mL；

NA 培 養(yǎng) 基： 牛 肉 浸 膏 3.0 g， 蛋 白 胨 5.0 g，葡 萄 糖 20.0 g， 瓊 脂 20.0 g， 蒸 餾 水 1 000 mL，pH值6.8～7.2；

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 7.4；

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值6.8～7.2；

碳氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基∶氮源10.0 g（蛋白胨5.0 g，硫酸銨5.0 g），碳源（葡萄糖）10.0 g，Na2HPO4·12H2O 4.0 g，NaH2PO4·2H2O 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.5。

生理生化指標(biāo)檢測試劑和培養(yǎng)基參照趙斌等［4］的《微生物學(xué)實驗》。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的初篩

初篩采用噴霧法和雙層平板法［4-6］，將病原菌接種于液體TM培養(yǎng)基，30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，離心收集菌體并用無菌水重懸，放置于經(jīng)70%酒精和10%雙氧水消毒的無菌噴瓶里，然后均勻地噴灑在TM平板上，每皿噴霧約0.2 mL，制成含菌平板。晾干后再倒上一層薄薄的NA培養(yǎng)基，制成雙層平板。將純培養(yǎng)微生物點接于上層培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)，通過觀察菌株是否產(chǎn)生拮抗透明圈判斷該菌是否具有拮抗煙草青枯病原菌的能力。

1.2.2 拮抗菌的復(fù)篩

在直徑9 cm培養(yǎng)皿中準(zhǔn)確倒入20 mL TM培養(yǎng)基，用與初篩相同方法制成含病原菌的平板，在離平板中心距離相等的3個方向分別用6 mm無菌打孔器打孔備用。將初篩所得菌株于液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每孔中注入30 μ L發(fā)酵液，于30℃正置培養(yǎng)36 h后，記錄孔周圍的抑菌圈直徑，抑菌圈直徑大小代表各菌株對病原菌抑制能力的大小。

1.2.3 盆栽試驗驗證拮抗菌對煙草青枯病的抑制效果

處理設(shè)置：CK：不施菌液；菌液：MT-002-B-7發(fā)酵液。各處理5個重復(fù)。病原菌及供試處理菌液的施用方法：兩個處理的青枯病原菌的接入方法采用莖基部穿刺接種法，每個植株注入1 mL病原菌菌懸液。將菌株MT-002-B-7在LB培養(yǎng)液中發(fā)酵，28℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)24～ 56 h，獲得濃度為108cfu/mL的菌液。施用時采取灌根的方法，吸取5 mL原液，將其用水稀釋至100 mL，每個處理5個重復(fù)。分別在移栽當(dāng)天、移栽第25 d、40 d各施用1次，盆栽試驗共進行65 d。病情調(diào)查方法參考煙草病蟲害分級及調(diào)查方法進行［7］。

1.2.4 菌株拮抗條件優(yōu)化

1.2.4.1 培養(yǎng)基礎(chǔ)條件 菌株特性研究以LB培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，特性研究和碳氮源篩選的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件：接種量為1%、裝液量40%、初始pH值7.0、溫度 28℃、轉(zhuǎn)速 170 r/min、培養(yǎng) 24 h 為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件。

1.2.4.2 菌株培養(yǎng)特性研究 培養(yǎng)時間：分別在培養(yǎng) 5、10、16、21、25、30、40 和 45 h 時取樣檢測；裝液量：10%、20%、30%、40%、60%（v/v）LB液體培養(yǎng)液；培養(yǎng)溫度：分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為20、25、30、35和40℃；初始pH值：用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)LB液體培養(yǎng)基的初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0；搖床轉(zhuǎn)速：將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100、120、150、180、200 r/min；菌種接種量：分別設(shè)置菌液接種量為1%、2%、3%、5%、10%。將各處理于基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，用復(fù)篩方法測定各種條件下待測菌株對煙草青枯病的拮抗效果，同時測定菌株在600 nm處的吸光度了解菌株生長情況，每個處理設(shè)3個重復(fù)，計算其平均值。

1.2.4.3 不同碳源和氮源對菌株拮抗效果的影響固定碳氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其它元素，分別將10 g/L碳源和10 g/L氮源的備選碳源、氮源加入至基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測定菌株的拮抗效果，在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，用復(fù)篩方法測定各發(fā)酵液對煙草青枯病的拮抗效果，同時測定菌株在600 nm處的吸光度了解菌株生長情況，每個處理設(shè)3個重復(fù)，計算其平均值。

1.2.5 菌株的鑒定

1.2.5.1 顯微形態(tài)、培養(yǎng)形態(tài)和生理生化特征分析將菌株于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱適溫、適時培養(yǎng)，對菌落形態(tài)拍照，挑取單菌落進行革蘭氏染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察其顯微形態(tài)。菌株大部分生理生化特征利用BiologGenⅢ型細(xì)菌鑒定儀的微孔板檢測，具體按照Biolog-GenⅢMicroPlateTM使用說明書步驟操作，其微孔板布局如圖1所示。其它生理生化試驗檢測內(nèi)容參照趙斌等［4］的《微生物學(xué)實驗》進行操作。將培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9、10、11，NaCl含量調(diào)節(jié)為1%、4%、8%和10%（w/v）檢測菌株生長pH值范圍和NaCl耐受情況，檢測菌株在7、15、25、30、40、45和50℃條件下的生長情況。

1.2.5.2 細(xì)菌總DNA提取與PCR擴增 細(xì)菌基因組DNA的提取采用杭州博日科技有限公司的試劑盒進行，按廠商說明書操作。用細(xì)菌通用引物對（正向引物 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物 1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴增菌株16S rDNA基因。PCR反應(yīng)體系為20 μ L，所用程序為：95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃90 s，共 25 個循環(huán)；72℃ 10 min。由上海生工生物工程有限公司對PCR產(chǎn)物測序。

圖1 Biolog GEN Ⅲ MicroPlate微孔板測試布局

1.2.5.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 得到DNA序列后，首先利用計算機對其序列進行分析處理并進行排序，如果是反向引物得到的序列，還要將之轉(zhuǎn)化成互補鏈的序列；利用Blast軟件在GenBank、NCBI等數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索；選取同源性比較高的典型菌株的16S rDNA序列作為參比對象；用CLUSTALW 1.8軟件進行多序列比對并計算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性；應(yīng)用MEGA5.0軟件，將測序獲得各菌株的16S rDNA序列進行多序列完全比對，去掉兩端差異序列后，利用Neighbor-Joining法根據(jù)Kimura-2法計算各類群間的核苷酸差異值，運行1 000次bootstrap構(gòu)建獲得系統(tǒng)發(fā)育。將測得的16S rDNA序列提交GenBank，獲得各菌株核酸登錄號。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選

通過判斷菌株在檢測培養(yǎng)基上的透明圈，初步篩選出對煙草青枯病具有拮抗作用的微生物菌株28株；再通過判斷28株初篩菌株發(fā)酵液在復(fù)篩培養(yǎng)基上的抑菌圈大小，復(fù)篩出1株拮抗效果較好的細(xì)菌MT-002-B-7，該菌的發(fā)酵液在培養(yǎng)基上的抑菌圈明顯，抑菌圈直徑達(dá)到28.67 mm，如圖2所示。

圖2 MT-002-B-7發(fā)酵液打孔拮抗病原菌情況

2.2 盆栽試驗驗證拮抗菌對煙草青枯病的抑制效果

在盆栽試驗期間，共進行3次病情調(diào)查，調(diào)查結(jié)果如表1所示。菌液處理在盆栽的整個試驗期都無煙草青枯病的發(fā)病現(xiàn)象，而對照在第25 d的發(fā)病率達(dá)到100%，在3次病情調(diào)查中其病情指數(shù)逐漸升高。試驗結(jié)果證明菌株MT-002-B-7對煙草青枯病具有良好的抑制效果。

表1 各處理菌液施用后對煙草青枯病的防治效果（%）

2.3 MT-002-B-7液體發(fā)酵條件優(yōu)化

從圖3的8種因素對菌株MT-002-B-7拮抗煙草青枯病的影響結(jié)果中可以看出，當(dāng)發(fā)酵液以葡萄糖為碳源時和以谷氨酸為氮源時最利于該菌抑制煙草青枯病原菌，同時分別以這兩種物質(zhì)為碳、氮源時菌液的濃度亦是最大。以促進MT-002-B-7抑制煙草青枯病的效果排序，則供試6種碳源的順序如下：葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖＞甘露醇＞蔗糖＞木糖，供試6種氮源的順序如下：谷氨酸＞酵母粉 ＞ 蛋白胨 ＞（NH4）2SO4＞NH4NO3＞KNO3；以促進MT-002-B-7生長的效果排序，則供試6種碳源的順序如下：葡萄糖＞乳糖＞甘露醇＞麥芽糖＞蔗糖＞木糖，供試6種氮源的順序如下：谷氨酸＞酵母粉 ＞ 蛋白胨 ＞NH4NO3＞（NH4）2SO4＞KNO3。由4項排序結(jié)果可以看出，最利于該菌抑制煙草青枯病原菌和促進菌株生長的葡萄糖和谷氨酸以及最不利于該菌抑制煙草青枯病原菌和促進菌株生長的木糖和KNO3在各自組的排序相同，而其它10種碳、氮源在對該菌抑制煙草青枯病原菌和促進菌株生長的時候有些許變化，如碳源中的麥芽糖和氮源中的NH4NO3，可能是因為它們的發(fā)酵產(chǎn)物僅僅利于促進拮抗物質(zhì)的分泌，卻對菌株的生長幫助不大。

圖3 8種因素對菌株MT-002-B-7拮抗煙草青枯病的影響

從圖3中也可以看出，就利于菌株MT-002-B-7產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的最優(yōu)水平而言，培養(yǎng)溫度呈現(xiàn)不規(guī)律的變化，在5～16 h拮抗物質(zhì)活性出現(xiàn)下降后再上升的情況，直到培養(yǎng)25 h最利于其產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，之后逐漸下降，而隨著培養(yǎng)時間的增加菌液濃度逐漸升高，仍然在第25 h達(dá)到最高的菌液濃度，之后逐漸下降；隨著裝液量的增加，菌株MT-002-B-7產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的量逐漸降低，菌株生長濃度亦是逐漸降低。

另外，將培養(yǎng)液的初始pH值調(diào)節(jié)為7.0的情況下，裝液量10%，接種3 mL（即接種量3%）的菌株母液，并將搖床溫度控制在35℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min的條件下培養(yǎng)25 h，該菌株對煙草青枯病原菌的抑制效果最好。而與以上條件不同的是，將pH值調(diào)節(jié)為8.0、搖床轉(zhuǎn)速調(diào)為180 r/min以及接種量控制在5%，其它條件不變則最利于該菌株的生長。

2.4 菌株MT-002-B-7的鑒定結(jié)果

2.4.1 菌株MT-002-B-7的形態(tài)特征

菌株MT-002-B-7在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上微隆起，邊緣整齊，呈藍(lán)綠色，培養(yǎng)基在其生長過程中顏色變化較大，起初為黃綠色，之后逐漸加深，在培養(yǎng)基加深的過程中，菌落表面出現(xiàn)金屬光澤。該菌是革蘭氏陰性的好氧細(xì)菌，其光學(xué)顯微形態(tài)呈短桿狀，如圖4所示。

圖4 菌株MT-002-B-7在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及其光學(xué)顯微形態(tài)（×1 000）

2.4.2 菌株MT-002-B-7的生理生化檢測結(jié)果

菌株MT-002-B-7的pH值生長范圍是5～9，最適生長pH值為6和7，耐受NaCl的能力一般，能在含4% NaCl的培養(yǎng)基中生長，生長溫度為15～45℃，溫度在30～40℃時，菌株長勢都好。油脂水解，甲基紅反應(yīng)、明膠液化、牛奶凝固、產(chǎn)硫化氫反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)和過氧化氫酶反應(yīng)為陽性，水解淀粉、纖維素水解反應(yīng)呈陰性，如表2所示，位置對應(yīng)內(nèi)容如圖5。

從菌株MT-002-B-7培養(yǎng)22 h后在Biolog鑒定板上的鑒定結(jié)果可知，該菌與Pseudomonas aeruginosa相似形最高，其中二甲胺四環(huán)素反應(yīng)、L-組胺利用、葡糖醛酰胺利用和γ-氨基-丁酸的反應(yīng)結(jié)果有所不同，其余的反應(yīng)結(jié)果相同，如圖5所示。它們的相似度（SIM）為0.595，距離（DIST）為4.031，匹配的可能性（PROB）為82.8%，根據(jù)SIM＞0.5，DIST＜5表示匹配良好的原則，從鑒定板結(jié)果初步判定菌株MT-002-B-7為Pseudomonas aeruginosa。

表2 菌株MT-002-B-7的部分生理生化特征

圖5 MT-002-B-7和Pseudomonas aeruginosa在微孔板上的反應(yīng)結(jié)果對比

2.4.3 菌株 MT-002-B-7 16S rRNA 基因部分序列分析

圖6 通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株MT-002-B-7及相關(guān)菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株MT-002-B-7的16S rRNA基因部分序列 長 度 為 1 461 bp， 在 GenBank 核 酸 登 錄 號 為KR136350。根據(jù)菌株MT-002-B-7系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株MT-002-B-7屬于假單胞菌（Pseudomonas）細(xì)菌，與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的典型菌株（銅綠假 單 胞 菌 ）Pseudomonas aeruginosa JCM 5962T聚為一簇，其16S rRNA基因相似性為99.4%，其次 是 典 型 菌 株 Pseudomonas otitidis MCC10330T和Pseudomonas alcaligenes NBRC 14159T，其 16S rRNA基因相似性分別為98.0%和97.0%。菌株與假單胞菌（Pseudomonas）其它典型菌株的相似性＜97.0%。通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株MT-002-B-7及相關(guān)菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示。結(jié)合其形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA基因部分序列分析結(jié)果［8-9］，判定菌株MT-002-B-7屬于假單胞菌屬的銅綠假單胞菌。

3 討論與結(jié)論

從高粱根際土中分離獲得一株對煙草青枯病原菌具有較好拮抗效果的細(xì)菌MT-002-B-7，基于形態(tài)、培養(yǎng)和生理特征，結(jié)合16S rDNA序列分析，初步鑒定為銅綠假單胞菌。該菌對煙草青枯病原菌的抑菌圈直徑可以達(dá)到28.67 mm，和易有金等［10］篩選的拮抗菌B-001的抑菌圈直徑為25 mm、繆莉等［11］篩選獲得的真菌抑菌圈直徑為2.6 cm、董夏偉等［12］分離所得的拮抗菌對病原菌的抑菌圈為28.9 mm等研究效果相比，該菌抑菌效果較好。

關(guān)于銅綠假單胞菌拮抗煙草青枯病的特性已有不少報道［12-15］，結(jié)合已有報道中的研究方法，本研究經(jīng)過單因素優(yōu)化后，獲得利于菌株MT-002-B-7抑制煙草青枯病原菌的最佳培養(yǎng)基碳氮源和培養(yǎng)條件為：以葡萄糖為碳源，以谷氨酸為氮源，裝液量10%，培養(yǎng)基初始pH值7.0，接種量3%，溫度35℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)25 h。該優(yōu)化結(jié)果為工業(yè)生產(chǎn)該菌株提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時也根據(jù)菌株MT-002-B-7能在常規(guī)條件下進行發(fā)酵生產(chǎn)、對發(fā)酵條件無苛刻要求的情況，可以初步判斷該菌具有一定的環(huán)境適應(yīng)能力。

關(guān)于銅綠假單胞菌最多的研究集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它是傷口感染較常見的一種細(xì)菌，被醫(yī)學(xué)界廣泛、深入地進行了多方面的研究。盡管如此，由于銅綠假單胞菌的次生代謝產(chǎn)物種類極其豐富，就已被研究鑒定的就有24種［16］，這些次生代謝產(chǎn)物在抑制作物病原菌生長和促進作物生長等方面的作用顯著，不僅對青枯病具有抑制作用，也能夠抑制除了青枯病外的腐霉菌、灰葡萄孢菌、稻瘟菌、尖鐮刀菌、鏈格孢菌、黑曲霉、紋枯病等眾多植物病原菌［17-23］，因此該類菌在農(nóng)業(yè)生物防治方面的作用不容忽視。本研究說明銅綠假單胞菌對煙草青枯病具有防治效果，具有進一步研究的價值。