哺乳動物細胞瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)研究進展

孫靜靜，李桂林，周雷鳴，周偉偉，趙巧輝

目前全球越來越多的重組抗原及重組抗體用于醫(yī)療，尤其針對腫瘤、自身免疫病等難治病癥，以及體外診斷試劑。越來越多的高校和企業(yè)開始重視重組蛋白新藥的開發(fā)，這就要求能夠快速生產(chǎn)足夠候選蛋白用于臨床前研究，因此能夠快速生產(chǎn)毫克到克級別的重組蛋白瞬時表達體系開始得到廣泛應(yīng)用[1]。

重組蛋白的生產(chǎn)方法主要可分為兩種，一種是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（stable gene expression，SGE），另一種是瞬時轉(zhuǎn)染（transient gene expression，TGE）。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，是指外源 DNA 轉(zhuǎn)入宿主細胞后將外源目的基因整合到宿主染色體中進行表達。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染需要使用線性 DNA，線性 DNA 雖然較超螺旋 DNA 轉(zhuǎn)入量低，但整合率高。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過程中，外源 DNA 整合到宿主細胞染色體中概率很小，只有大約 1%，且通常需要通過一些選擇性標記反復(fù)篩選，才能得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。瞬時轉(zhuǎn)染，是指外源 DNA/RNA 轉(zhuǎn)入宿主細胞后不整合到宿主染色體中進行外源目的基因的表達。因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染效率較高。在轉(zhuǎn)染后 24～72 h（依賴于不同的構(gòu)建）分析結(jié)果時，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白、β 半乳糖苷酶等來幫助檢測。瞬時轉(zhuǎn)染現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于重組蛋白生產(chǎn)，不同的瞬時表達系統(tǒng)用于多種重組蛋白的制備。

規(guī)?；乃矔r轉(zhuǎn)染表達工藝從前期質(zhì)粒 DNA 的制備、細胞的擴增到瞬時基因轉(zhuǎn)染，所需時間不到一個月，即可獲得毫克到克級的蛋白產(chǎn)物，而且瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用規(guī)模越來越大，最大已達到百升的水平[2]。與穩(wěn)定基因表達相比，瞬時轉(zhuǎn)染有三方面優(yōu)勢：第一，大大縮短了獲得重組蛋白的時間[3]；第二，技術(shù)門檻較低，幾乎可以在每一個細胞培養(yǎng)相關(guān)的實驗室展開，無需特殊設(shè)備；第三，通量高，靈活性高，可以運用到多種不同重組蛋白的表達，甚至包括對宿主細胞有毒性的蛋白，而且可同時進行多種不同蛋白的表達。由于其靈活性高，瞬時轉(zhuǎn)染非常適用于提供數(shù)量少但是種類繁多的蛋白小規(guī)模生產(chǎn)供應(yīng)，或者是創(chuàng)新藥物蛋白早期的表達篩選[4-5]。當然瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)的表達量相對較低、放大時較大量的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑會限制放大工藝的進行等問題，行業(yè)也非常關(guān)注。本文對瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)的細胞系及構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染試劑、工藝優(yōu)化及培養(yǎng)放大現(xiàn)狀進行綜述。

1 表達系統(tǒng)

1.1 HEK293 表達系統(tǒng)

自 1977年Graham 等[6]建立人類胚胎腎（human embryonic kidney cell，HEK）293 細胞系以來，其已成為世界上最常用的瞬時轉(zhuǎn)染細胞株之一。HEK293 細胞具有穩(wěn)定性好、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，適于進行瞬時轉(zhuǎn)染放大生產(chǎn)。近幾十年來，瞬時轉(zhuǎn)染用的 HEK293 細胞已形成復(fù)雜的系統(tǒng)，經(jīng)過遺傳修飾或單克隆篩選形成了商業(yè)用或者科研用細胞，有些細胞已經(jīng)被淘汰不再使用，也有一些細胞需被授權(quán)才能使用。

早期 HEK293 貼壁培養(yǎng)時主要使用 DMEM 添加 10% 胎牛血清，倍增時間為 24～36 h，主要適用于小規(guī)模培養(yǎng)。隨著技術(shù)發(fā)展，進行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)時，需使用無 血清、無蛋白、化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基，在不進行補料情 況下，通常 HEK293 細胞懸浮培養(yǎng)最大細胞密度可達 8 × 106個/ml。一般小量懸浮培養(yǎng)時使用三角瓶，體積 100～300 ml 不等，大量懸浮培養(yǎng)時需使用生物反應(yīng)器，體積幾升到幾百升不等[7]。

HEK293 家族有多種不同的細胞系，不同的蛋白在同一細胞系中的表達情況不同，同一蛋白在不同的細胞系中表達情況也不同。如果一個蛋白在一種宿主細胞系中表達水平較差，可嘗試其他宿主細胞系進行表達。Geisse[8]總結(jié)了 6 種不同的 HEK293 細胞系的特點以及小量表達 14 種不同的蛋白的表達量，均為懸浮培養(yǎng)，6 孔板轉(zhuǎn)染，每孔 2 ml，包括 7 μl 轉(zhuǎn)染試劑、2 μg 質(zhì)粒、1 × 106個細胞。結(jié)果顯示，14 種蛋白在不同 HEK293 系統(tǒng)中的表達水平在 1～40 mg/L 之間，比較同一蛋白在 6 種 HEK293 細胞中的表達量差異，HEK293-6E（NRC）的表達量較高。常見的瞬時表達用 HEK293 細胞的特性如表1所示。

1.2 CHO 表達系統(tǒng)

最早的 CHO 細胞是 1956年由 Theodore Puck 從來源于一個部分同系交配的中國倉鼠的卵巢細胞分離獲得的一個自發(fā)永生化的成纖維細胞群[9]。CHO 細胞為上皮貼壁型細胞，具有不死性，可以傳代百代以上，是生物工程上廣泛使用的細胞。另外，CHO 屬于成纖維細胞，是一種非分泌型細胞，它本身很少分泌 CHO 內(nèi)源蛋白，因此對目標蛋白分離純化工作十分有利。哺乳動物細胞表達可形成有活性的二聚體，具有糖基化的功能，是表達復(fù)雜生物大分子的 理想宿主。目前，重組蛋白生產(chǎn)上通常使用的 CHO 細胞系有 3 種：①從 1957年得到的 CHO 細胞群通過單細胞克隆得到的 CHO-K1（即野生型 CHO 細胞），CHO-S 為 CHO-K1 馴化后的懸浮細胞；②敲除 CHO-K1 的二氫葉酸還原酶（DHFR）等位基因得到的CHO-DXB11；③通過電離輻射 CHO 細胞群得到兩個 DHFR 等位基因都被敲除的CHO-DG44。雖然 CHO 細胞還有很多其他的衍生細胞系，但是目前進行 CHO 細胞系的改造，多以這 3 種為初始細胞。目前市面上商品化的 CHO 細胞圖譜如圖1所示，常見的瞬時表達用 CHO 細胞的特性如表2所示。

表1 瞬時表達用 HEK293 細胞系和表達系統(tǒng)匯總[8]

圖1 商品化 CHO 細胞系圖譜

表2 瞬時表達用 CHO 細胞系和表達系統(tǒng)匯總[10]

2 轉(zhuǎn)染試劑

目前，將外源 DNA 導(dǎo)入哺乳動物細胞的方法大致可分為兩大類，即生物方法和物理化學(xué)方法。生物方法主要以病毒作為載體，通過病毒感染的方式將外源 DNA 導(dǎo)入到細胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)最為常用。物理化學(xué)方法中常用的有磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔，以及最近出現(xiàn)的以高分子聚合物為載體的基因傳遞技術(shù)。其中最常用的是化學(xué)方法，磷酸鈣、聚乙烯亞胺（PEI）、脂質(zhì)體等化學(xué)試劑較為常用。

2.1 磷酸鈣

磷酸鈣是使用超過 30年的哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染試劑[11]，可用于 HEK293 細胞轉(zhuǎn)染。此方法操作簡單，主要包括 2 個步驟：① DNA 質(zhì)粒和氯化鈣溶液混合；②加入磷酸鹽緩沖液形成 CaPi-DNA 復(fù)合物。Coonrod 等[12]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后 1 h，質(zhì)粒 DNA 已經(jīng)到達細胞核周圍區(qū)域，當進行有絲分裂細胞核膜溶解時，質(zhì)粒進入細胞核。Batard 等[13]使用疊氮溴乙錠和熒光肽核酸標簽標記質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)每個細胞可以轉(zhuǎn)進約 1 000 000 個質(zhì)粒，加入培養(yǎng)體系的質(zhì)粒，只有 5% 可轉(zhuǎn)進細胞核內(nèi)。

磷酸鈣轉(zhuǎn)染，CaPi-DNA 復(fù)合物的形成是動態(tài)可逆的過程，轉(zhuǎn)染的過程需要注意多個參數(shù)，如細胞密度、磷酸鹽緩沖液的 pH、質(zhì)粒濃度、氯化鈣濃度、磷酸鹽濃度等。盡管磷酸鈣轉(zhuǎn)染已可以放大到 100 L 的規(guī)模，但是也存在著較 大的缺點：一是需要添加血清和白蛋白以降低 CaPi 的毒性，二是需要換液，所以目前此方法應(yīng)用并不廣泛。

2.2 PEI

2.2.1 作用原理 目前使用最廣泛的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑是 PEI。PEI 制備簡單，價格便宜，有線狀和枝狀兩種商業(yè)試劑可選，是瞬時轉(zhuǎn)染放大轉(zhuǎn)染試劑的不二選擇。自 19世紀70年代發(fā)現(xiàn) PEI 可以結(jié)合 DNA 質(zhì)粒，直到 20年后，PEI 才真正用于哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染，成為非常有潛力的非病毒質(zhì)粒載體試劑。由于 PEI 帶正電荷，與帶負電荷的 DNA 結(jié)合形成帶正電荷的 PEI-DNA 復(fù)合物，可以與帶負電荷的細胞表面結(jié)合。PEI-DNA 復(fù)合物通過胞吞作用進入細胞內(nèi)部形成內(nèi)涵體，之后一部分從內(nèi)涵體中逃逸進入細胞核內(nèi)，未逃逸的進入溶酶體被降解，無法入核的 DNA 會在 100 min 內(nèi)被胞漿中的 DNA 酶降解（圖2）[14-15]。每毫升轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)?；旌衔镄纬杉s 1 × 1010個 DNA/PEI 復(fù)合物，大小為 300 nm 左右。經(jīng)過 15 min 孵育，轉(zhuǎn)染時每個細胞進入約 250 個 DNA/PEI 復(fù)合物[16-17]。

圖2 PEI 轉(zhuǎn)染機制

2.2.2 不同 PEI 的比較 枝狀的 800 kD PEI 是首次報道的可用于多種細胞轉(zhuǎn)染的試劑，枝狀的 25 kD PEI（25B）用于 HEK293 細胞大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率較枝狀 2 kD、600 kD、800 kD 或線狀 22 kD PEI（22L）的高[18]。之后比較了枝狀 70 kD、50～100 kD、25 kD PEI 和線狀 25 kD PEI（25L），結(jié)果表明 25B 和 25L 的轉(zhuǎn)染效率較高，適合于哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染，但是 25L 比 25B 更適用于懸浮哺乳動物細胞 HEK293 和 CHO 轉(zhuǎn)染。Delafosse 等[19]比較了 3 種商品化的 PEI 轉(zhuǎn)染試劑 25 kD LPEI、40 kD PEI-Max、PEI pro，轉(zhuǎn)染 HEK293 和 CHO 細胞，PEI pro 的轉(zhuǎn)染效率低于 25 kD LPEI、40 kD PEI-Max，PEI pro 的毒性最強。經(jīng)過優(yōu)化，PEI-Max 的表達量優(yōu)于 25 kD LPEI。

在 HEK293 細胞，無論是使用搖瓶轉(zhuǎn)染還是大規(guī)模的 Wave 波浪生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)染，PEI 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率均在 60% 左右。在 CHO 細胞，PEI 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染相對數(shù)據(jù)較少，轉(zhuǎn)染效率在 40%～60% 之間。

PEI 介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染中 DNA 和 PEI 比例一般為 1:2～1:3（W/W），提高轉(zhuǎn)染試劑比例會提高轉(zhuǎn)染效率，但是隨之細胞毒性也會增加。另外轉(zhuǎn)染時的細胞密度、DNA-PEI 聚合物的大小、培養(yǎng)基的組成等都會影響轉(zhuǎn)染效果[11]。

2.3 脂質(zhì)體

陽離子脂質(zhì)體易穿透細胞膜，轉(zhuǎn)染效率要明顯高于其他轉(zhuǎn)染試劑，因而也廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染，但因其化學(xué)合成不易，商業(yè)化常用的脂質(zhì)體如 Lipofectamine 價格較高，遠貴于其他化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑，因此只適合于小量瞬時轉(zhuǎn)染。目前最常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系是將陽離子脂質(zhì)體與 DNA 溶液混合，以形成 DNA 夾在脂質(zhì)雙分子層之間的結(jié)構(gòu)。

HEK293 細胞是非常適合進行瞬時轉(zhuǎn)染的細胞，很容易接收外來 DNA，在合適的轉(zhuǎn)染條件下，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率可達 80% 以上，使用商品化羅氏的 FuGene HD 或者 Invitrogen 的 Lipofectamine2000 的轉(zhuǎn)染效率甚至可達 90% 以上。但是傳統(tǒng)的 CHO 細胞的轉(zhuǎn)染效率相對較低，只有 40%～60%。近年來 Thermo Fisher 公司新開發(fā)的 Expi293F 和 ExpiCHO 瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率和表達量有了較大的提升，但是商品化的轉(zhuǎn)染試劑盒培養(yǎng)基價格較貴，不太適用于產(chǎn)業(yè)化放大，Jain 等[20]比較了用 Expi293F 和 ExpiCHO 表達系統(tǒng)表達 14 種不同蛋白的表達水平，結(jié) 果表明 ExpiCHO 表達系統(tǒng)的表達量優(yōu)于 Expi293F，不同類型的蛋白，表達量差異比較大，但即使是同一亞型的抗 體，表達量也有較大差異，ExpiCHO 表達 4 個 IgG 的 表達量在 84～3271 mg/L，表達 3 個雙特異性抗體的表達量在 75～398 mg/L，表達 5 個融合蛋白的表達量在 68～894 mg/L。

3 瞬時轉(zhuǎn)染優(yōu)化

3.1 DOE 實驗

瞬時轉(zhuǎn)染優(yōu)化首先考慮的就是影響瞬時表達的因素，主要包括轉(zhuǎn)染試劑的類型和濃度、DNA 的濃度、孵育時間、細胞類型、培養(yǎng)基類型、細胞代次、轉(zhuǎn)染時細胞密度等。這些因素必須綜合考慮，才能達到最佳的轉(zhuǎn)染條件。最常用的優(yōu)化瞬時轉(zhuǎn)染表達體系的方法是 DOE 實驗，可以在減少實驗次數(shù)的情況下，應(yīng)用生物學(xué)統(tǒng)計學(xué)方法得到較好的結(jié)果。Vink 等[21]建立了一種穩(wěn)定高效瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)表達抗體，利用 Freestyle 293-F 表達人重組抗體 IgG 和 Fab，通過 Design-Expert 軟件進行 DOE 設(shè)計，優(yōu)化質(zhì)粒比例，使表達量從平均的 30 mg/L 提升到 400 mg/L。

3.2 降溫

降溫也是常用的提升 CHO 表達系統(tǒng)蛋白產(chǎn)量的方法，從常規(guī)的 37 ℃ 培養(yǎng)，到轉(zhuǎn)染后降低至 30～32 ℃。降低溫度可以使細胞停留在 G1 期，降低代謝速率，同時提高蛋白產(chǎn)量[22-23]。由于生物反應(yīng)器具有精確的溫度控制系統(tǒng)，因此很容易進行放大。據(jù)報道，已經(jīng)成功放大至 50～100 L[24]。

3.3 添加化學(xué)復(fù)合物

加入化學(xué)復(fù)合物是一種常用的提高轉(zhuǎn)染效率的方法。最常用的是組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDCA）抑制劑，通過解除轉(zhuǎn)錄抑制來提高重組蛋白表達量。一般在轉(zhuǎn)染后 4 h 加入，此時 DNA 已進入細胞核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄剛剛 開始。最常用的 HDCA 抑制劑是丙戊酸和丁酸鈉[25]。也有一些試劑可以提高細胞膜的通透性，進而提高轉(zhuǎn)染效率，如 DMSO 和乙酸鉀，一般在轉(zhuǎn)染前添加[26]。

3.4 共表達調(diào)節(jié)蛋白

共表達調(diào)節(jié)蛋白也是一種常用的提高表達量的方 法[27]。在 HEK293 轉(zhuǎn)染表達目的蛋白時，共轉(zhuǎn)染 3 個調(diào)節(jié)蛋白 P18、P21、αFGF，使活細胞密度和抗體分泌提升。Zustiak 等[28]共轉(zhuǎn)染了抗細胞凋亡基因 bcl-xL，以降低細胞凋亡，提升蛋白表達。Zhang 等[29]通過共表達凋亡基因 Bcl-xL 和 Mcl-1，提高了 PD-1 抗體在 CHO 細胞中的 表達。

4 瞬時轉(zhuǎn)染的放大

關(guān)于瞬時轉(zhuǎn)染的放大報道較少，原因可能是瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)目前還停留在科研階段，生產(chǎn)企業(yè)采用的較少。瞬時轉(zhuǎn)染的放大主要采用三角瓶、Wave 波浪生物反應(yīng)器和攪拌式生物反應(yīng)器。某些制藥公司也開始嘗試進行瞬時轉(zhuǎn)染的放大，從 0.1 L 開始，轉(zhuǎn)染體積甚至到 80～100 L 規(guī)模[30-31]。瞬時轉(zhuǎn)染的表達水平與蛋白的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，很難進行直 接對比。一般情況下，使用轉(zhuǎn)染試劑 PEI，無論是 HEK293 細胞還是 CHO 細胞，表達水平均在 1～80 mg/L。重組 抗體 IgG 表達時，使用 3～150 L 不同體積的反應(yīng)器，不論是批式培養(yǎng)或者流加補料培養(yǎng)，抗體表達水平均在 2～80 mg/L[26]。也有表達量較高的報道，HEK293 瞬時轉(zhuǎn)染達到 1～2 g/L，ExpiCHO 瞬時轉(zhuǎn)染表達量達到 2 g/L[32-33]。在瞬時基因表達工藝的放大中，需確保工藝放大前后細胞的活性、目的蛋白的產(chǎn)量與質(zhì)量等保持不變[34-35]。不同的培養(yǎng)規(guī)模下，溫度、pH、流加策略一般不改變，但攪拌速度和通氣速率等因素受體積影響，需要遵循一定的變化準則。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，在蛋白表達過程中添加營養(yǎng)物質(zhì)以延長蛋白的表達過程，提高重組蛋白表達量，如加入水解蛋白、進行分批補料等。工藝放大（縮?。┩ǔ２捎孟嗤瑔挝惑w積 功率 P/V、傳質(zhì)系數(shù) kLa 等作為準則。Gutiérrez-Granados 等[36]對使用 PEI 進行 HEK293 和 CHO 細胞瞬時轉(zhuǎn)染放大的工藝進行了總結(jié)，包括生物反應(yīng)器放大時的參數(shù)控制，轉(zhuǎn)速、pH、DO 等物理參數(shù)以及轉(zhuǎn)染前細胞密度、質(zhì)粒量和質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的比例等，從而實現(xiàn)放大的產(chǎn)能增加，質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的最優(yōu)比從 1:1.5～1:4.5 不等，表達量從 1 mg/L～1 g/L 不等。

5 展望

瞬時轉(zhuǎn)染表達技術(shù)主要用于快速獲得毫克級別到克級別的蛋白。盡管現(xiàn)在穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建篩選已經(jīng)非常成熟，且表達量較高，但是對于一些特殊的應(yīng)用，仍需要瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，如基因治療、體外診斷試劑、個性化藥物、VLP 蛋白、疫苗等的生產(chǎn)[37-41]，甚至還用來大量表達膜蛋白[42]。影響瞬時轉(zhuǎn)染表達的因素主要有以下幾個方面：細胞系的選 擇、表達載體的選擇、質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量、轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基和補料方法[43]，需要同時進行多個方面的優(yōu)化，才能實現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)染的高表達。經(jīng)過多年的技術(shù)發(fā)展，瞬時轉(zhuǎn)染關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化取得了一定的成績，如細胞系、表達載體、轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基等，且由于表達載體和培養(yǎng)基方面的研究 進展，目前 CHO 重組蛋白的瞬時表達水平已經(jīng)達到1～2 g/L，雖與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達的 3～10 g/L 仍有一定差距，但瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)的自身優(yōu)勢也在促使其不斷的發(fā)展。