利用多能干細(xì)胞評估神經(jīng)發(fā)育毒性的研究進展

王丹丹，裴軼勁

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通過誘導(dǎo)成熟的體細(xì)胞表達特定基因得到的與胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）類似的細(xì)胞類型[1]。iPSCs 和 ESCs 在體外均具有無限增殖和多向分化的能力，兩者在藥物篩選、細(xì)胞治療等方面都發(fā)揮著重要作用，然而 iPSCs 來源廣泛，取材方便，其獲取可以避免醫(yī)學(xué)倫理問題。傳統(tǒng)的發(fā)育毒性研究方法不僅需要大量的實驗動物，而且實驗周期長，操作繁瑣，還存在種屬差異。1981年，Evans 和 Kaufman[2]首次從小鼠的囊胚內(nèi)細(xì)胞團中獲得小鼠 ESCs。1997年，Spielmann 等[3]利用小鼠 ESCs 向三胚層分化的特性建立了體外替代模型“胚胎干細(xì)胞試驗”，并成為體外發(fā)育毒性研究的經(jīng)典方法。隨后，人 ESCs 和人 iPSCs 被人們獲取并應(yīng)用于發(fā)育毒性體外替代模型中，這些人類細(xì)胞的應(yīng)用解決了種屬差異問題[4-6]。體外發(fā)育毒性模型最初是通過多能干細(xì)胞向心肌分化來評估化學(xué)物質(zhì)的毒性作用，之后向其他譜系分化的產(chǎn)物也逐漸被應(yīng)用到該模型中。

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程具有高度的時空性，對毒性物質(zhì)的敏感性取決于所處的發(fā)育階段，處于敏感階段時，即使較低的毒性物質(zhì)暴露水平也會造成不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷[7]。這種腦損傷有時并未表現(xiàn)出明顯的臨床特征，而是神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)性改變，被稱為“無聲發(fā)育毒性”[8]。除了神經(jīng)系統(tǒng)本身的脆弱性外，人類所接觸的神經(jīng)發(fā)育毒性（developmental neurotoxicity，DNT）物質(zhì)也逐漸增多。據(jù)統(tǒng)計顯示，從 2006年到 2013年DNT 物質(zhì)從 6 種增長至 12 種[9]。因此，DNT 問題越來越引起人們的重視。目前，利用多能干細(xì)胞建立體外細(xì)胞模型已經(jīng)成為 DNT 研究的重要途徑。由多能干細(xì)胞分化的神經(jīng)譜系細(xì)胞類型和 DNT 評估方法則成為該研究的重要環(huán)節(jié)。本文從多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系的分化、DNT 檢測指標(biāo)與應(yīng)用、高通量技術(shù)應(yīng)用、前景與挑戰(zhàn)等四個方面進行綜述。

1 多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系的分化

利用多能干細(xì)胞建立 DNT 研究的體外細(xì)胞模型，有賴于多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系分化技術(shù)的發(fā)展。隨著干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系分化的細(xì)胞類型也越來越多（表1），其分化方法主要有兩種：貼壁法和擬胚體（embryoid body，EB）法。貼壁法相對簡單，易于操作；EB 法盡管存在操作復(fù)雜、EB 大小難以控制、生長因子接觸不均衡等問題，但和貼壁法相比更接近自然狀態(tài)下的胚胎發(fā)育過程。

表1 多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系分化的概況

續(xù)表1

目前，利用多能干細(xì)胞分化產(chǎn)生的神經(jīng)譜系細(xì)胞類型有多巴胺神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等[10-20]，分化形成的神經(jīng)譜系細(xì)胞類型逐漸增多，空間結(jié)構(gòu)也經(jīng)歷了由二維到三維的轉(zhuǎn)變。例如，Reichman 等[19]誘導(dǎo)人 iPSCs 形成含有超微結(jié)構(gòu)光感受器的類視網(wǎng)膜器官；Pamies 等[21]利用 iPSCs 分化形成類似人腦的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由分化成熟的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成，可以模擬神經(jīng)發(fā)育過程中的突觸形成、神經(jīng)元自發(fā)放電和髓鞘形成等，其髓鞘化可達 40%。此外，Schwartz 等[22]通過將人 ESCs 分化得到的神經(jīng)祖細(xì)胞接種在人工合成的聚乙二醇水凝膠上進行培養(yǎng)，在其分化過程中再按一定比例添加 ESCs 來源的內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞前體，最終形成一個含有不同類型神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞群和相互連接血管網(wǎng)的三維神經(jīng)結(jié)構(gòu)。

總之，利用多能干細(xì)胞產(chǎn)生的不同類型的神經(jīng)細(xì)胞是體外 DNT 研究的重要基礎(chǔ)，還可以依據(jù)不同細(xì)胞類型對不同性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)敏感程度不同，如神經(jīng)祖細(xì)胞對誘導(dǎo)凋亡的化學(xué)物質(zhì)較為敏感[23]，建立專一性的細(xì)胞替代模型。除此之外，由多能干細(xì)胞分化產(chǎn)生的三維神經(jīng)結(jié)構(gòu)可模擬細(xì)胞間的相互作用，在結(jié)構(gòu)和功能上更接近體內(nèi)神經(jīng)組織，應(yīng)用于 DNT 研究可縮小細(xì)胞水平與體內(nèi)水平的差異，進一步提高 DNT 評估的準(zhǔn)確性。

2 DNT 檢測指標(biāo)與應(yīng)用

神經(jīng)發(fā)育過程包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移、突觸形成、突起和網(wǎng)絡(luò)形成、膠質(zhì)生成和髓鞘化等。利用多能干細(xì)胞模擬神經(jīng)發(fā)育過程進而評估化學(xué)物質(zhì)的 DNT，可以彌補傳統(tǒng)實驗的不足，但根據(jù)細(xì)胞模型如何全面準(zhǔn)確地評估化學(xué)物質(zhì)的 DNT 則是人們研究的難點。目前，體外評估 DNT 的檢測指標(biāo)大致分為三類：神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)行為、神經(jīng)元功能及其他指標(biāo)。

2.1 神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)行為

⑴增殖和凋亡：增殖和凋亡貫穿整個神經(jīng)發(fā)育過程，可依據(jù)細(xì)胞模型的增殖和凋亡水平初步評估化學(xué)物質(zhì)的 DNT，常用的相關(guān)檢測方法包括細(xì)胞計數(shù)、BrdU 染色法、CCK8、caspase3/7 活性等[23-30]。

⑵分化：多能干細(xì)胞分化形成形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能不同的神經(jīng)元，其本質(zhì)是基因的選擇性表達。通常采用實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、免疫染色等方法檢測特異性標(biāo)記物如神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白、髓鞘堿性蛋白的表達水平，進而評估毒性物質(zhì)對神經(jīng)分化過程的影響[31-32]。

⑶細(xì)胞遷移：神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移是人類胎兒發(fā)育的關(guān)鍵過程之一，倘若該過程受到外部環(huán)境或毒性物質(zhì)的干擾，胎兒會出現(xiàn)畸形發(fā)育。體外主要采用細(xì)胞劃痕實驗來評估毒性物質(zhì)對細(xì)胞遷移過程的影響[33-34]。

⑷突起生長：神經(jīng)元之間通過神經(jīng)突起相互連接進行信息的傳遞。Ryan 等[35]利用人 iPSCs 來源的神經(jīng)元研究發(fā)現(xiàn)，一些化學(xué)物質(zhì)并未引起細(xì)胞毒性，僅選擇性地抑制神經(jīng)元突起生長。可見，突起生長可作為評估 DNT 的重要指標(biāo)。

⑸髓鞘化：髓鞘的主要功能是提供軸突的電絕緣和加速電信號的傳遞，少突膠質(zhì)細(xì)胞是髓鞘的重要細(xì)胞來源，可通過檢測其前體細(xì)胞分化、遷移等過程間接評估化學(xué)物質(zhì)對髓鞘形成影響[24,36-37]。

2.2 神經(jīng)元功能

現(xiàn)有的研究顯示，采取常規(guī)的檢測手段不一定能夠發(fā)現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)的毒性作用。而電生理特性作為神經(jīng)元基本的功能特性，可作為評估 DNT 敏感的功能終端。例如，Yl?-Outinen 等[38]將人 ESCs 分化的神經(jīng)元在 500 nmol/L 氯化甲基汞環(huán)境中暴露 72 h 后，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的電生理信號會顯著減少，但細(xì)胞增殖、qPCR、免疫染色等檢測結(jié)果并未發(fā)生改變。

2.3 其他指標(biāo)

除了以上兩類檢測指標(biāo)外，還可通過其他指標(biāo)來評估 DNT。

⑴活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激：氧化應(yīng)激是化學(xué)物質(zhì)引起 DNT 的重要機制[39-40]。例如，砷、汞等會引起神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生過多 ROS，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡即氧化應(yīng)激水平升高，進而引起線粒體功能失調(diào)和細(xì)胞凋亡[41-42]。因此，可依據(jù)多能干細(xì)胞向神經(jīng)分化過程中細(xì)胞內(nèi) ROS 水平、超氧化物歧化酶等指標(biāo)來評估化學(xué)物質(zhì)的 DNT[43]。

⑵代謝產(chǎn)物：Pamies 等[43]利用非靶向性代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，由人 iPSCs 分化形成的三維神經(jīng)結(jié)構(gòu)在不同的分化階段其代謝產(chǎn)物存在差異，同時，用魚藤酮處理 48 h 后細(xì)胞代謝產(chǎn)物亦發(fā)生明顯改變。因此，研究細(xì)胞的代謝產(chǎn)物可以幫助人們從代謝角度發(fā)現(xiàn)微小差異，并進一步識別化學(xué)物質(zhì)的毒性作用。

⑶microRNA（miRNA）：miRNA 是一種小的內(nèi)源性非編碼 RNA 分子，通過靶向結(jié)合 mRNA 來調(diào)節(jié)基因的表達。目前，已經(jīng)明確的 miRNA 中超過 50% 在腦中表達，參與調(diào)控腦的發(fā)育過程[44]。已有研究表明，毒性物質(zhì)會引 起一些 miRNA 的異常表達，而這些 miRNA 與神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移、髓鞘化等密切相關(guān)[45]。

總之，神經(jīng)發(fā)育過程極其復(fù)雜，利用多能干細(xì)胞建立體外細(xì)胞模型評估 DNT 時，需要綜合不同的檢測指標(biāo)才能對化學(xué)物質(zhì)的 DNT 做出正確的評估，相信隨著科技的發(fā)展，更多敏感指標(biāo)會被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于 DNT 研究中。

3 DNT 高通量技術(shù)應(yīng)用

盡管利用多能干細(xì)胞建立體外替代模型評估化學(xué)物質(zhì) DNT 和傳統(tǒng)方法相比具有較多優(yōu)點，但對大量的細(xì)胞樣本進行不同的處理和檢測同樣具有挑戰(zhàn)性。基于體外模型能高效準(zhǔn)確地預(yù)測出體內(nèi)結(jié)果是 DNT 研究的關(guān)鍵，因此，高通量技術(shù)對于體外 DNT 研究十分必要。目前，利用多能干細(xì)胞研究 DNT 方法中也出現(xiàn)一些高通量技術(shù)應(yīng)用。

⑴高含量成像分析（high content imaging analysis，HCA）技術(shù)：HCA 是一種能夠高通量成像并可對圖像信息進行多種模型量化分析的重要工具，可用于大量化學(xué)物質(zhì)的毒性檢測[46]。例如，有研究報道將 80 種化學(xué)物質(zhì)分別作用 iPSCs 來源的神經(jīng)元 72 h 后，應(yīng)用 HCA 技術(shù)對其進行拍照，并從神經(jīng)元的細(xì)胞活性、突起長度、突起數(shù)目、分支數(shù)等 4 個參數(shù)分析圖像信息，極大提高了圖像信息的處理能力[35]。

⑵微流控芯片：微流控芯片是一個集細(xì)胞培養(yǎng)、分化、處理和檢測分析于一體的微型平臺，可進行二維和三維兩種干細(xì)胞培養(yǎng)方式，和不同的檢測系統(tǒng)結(jié)合可對細(xì)胞樣本進行不同指標(biāo)的分析[47]。該平臺應(yīng)用于 DNT 研究中，不僅可以實現(xiàn)對大量化學(xué)物質(zhì)的自動處理，還可以從不同的指標(biāo)分析化學(xué)物質(zhì)的 DNT，提高 DNT 的研究效率和評估準(zhǔn)確性。

⑶微電極陣列（microelectrode array，MEA）：MEA 是一種無創(chuàng)性的微電極細(xì)胞外電信號記錄技術(shù)，可以用于長時間培養(yǎng)細(xì)胞，實時記錄不同樣本產(chǎn)生的電信號，是高通量檢測神經(jīng)細(xì)胞電生理特性的重要工具[48-50]。

盡管高通量技術(shù)在一定程度上可以對大量樣本進行檢測和分析，但大部分高通量技術(shù)由于設(shè)備成本較高，操作復(fù)雜，需借助專業(yè)技術(shù)人員，還無法實現(xiàn)廣泛應(yīng)用。但隨著科技的進步，相信越來越多的高通量技術(shù)會得到進一步發(fā)展和應(yīng)用，從而提高利用多能干細(xì)胞評估 DNT 的研究效率和評估準(zhǔn)確性。

4 前景和挑戰(zhàn)

目前，多能干細(xì)胞研究已經(jīng)取得很大進展，例如，多能干細(xì)胞培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化，即無血清和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，成分更加明確，有利于實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。另外，利用多能干細(xì)胞在體外分化形成神經(jīng)細(xì)胞類型的多樣性（表1）、DNT 檢測指標(biāo)的多樣性、高通量檢測技術(shù)應(yīng)用等，這些在一定程度上均有助于降低研究成本，縮短 DNT 研究周期，提高預(yù)測準(zhǔn)確性等。但利用多能干細(xì)胞進行 DNT 研究也同樣面臨很多問題，如干細(xì)胞培養(yǎng)成本較高、神經(jīng)三維模型分化時間較長、對神經(jīng)組織（或細(xì)胞）模型缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的評估體系、化 學(xué)物質(zhì)的暴露方式不一（濃度、作用時間等）、化學(xué)物質(zhì)作用的細(xì)胞類型可能不敏感；檢測體系待完善等。此外，盡管由多能干細(xì)胞分化形成的三維模型已經(jīng)具備初步的結(jié)構(gòu)和功能，但與人體內(nèi)的神經(jīng)組織相比依然存在很大差距。而且目前體外檢測系統(tǒng)只能檢測化學(xué)物質(zhì)本身的毒性作用，對化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)代謝過程產(chǎn)生的毒性作用及體內(nèi)胎盤屏障和血腦屏障的復(fù)合作用均無法在體外模擬，這將容易造成高估或者低估化學(xué)物質(zhì)的 DNT[51]?？傊?，盡管應(yīng)用多能干細(xì)胞在體外建立細(xì)胞模型研究 DNT 還存在很多不足，但隨著相關(guān)技術(shù)的成熟和完善，相信多能干細(xì)胞尤其 iPSCs 在未來 DNT 體外模型應(yīng)用中將發(fā)揮不可替代的作用。