肺炎鏈球菌自溶素研究進展

邵致遠，游雪甫，楊信怡

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是一種革蘭陽性（G+）條件致病菌，常定植于人鼻咽部，近一半健康人攜帶此菌[1]。當(dāng)人體免疫力降低，定植的肺炎鏈球菌可穿透黏膜等防御體系引起多種感染。臨床上，肺炎鏈球菌是導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎、腦膜炎、中耳炎等的重要病原之一。易感人群包括兒童、老年人，及伴有其他基礎(chǔ)疾?。ㄈ缒[瘤、紅斑狼瘡）的青壯年患者[2]。據(jù)報道，每年死于這類病原菌感染的人數(shù)與死于結(jié)核病的人數(shù)大體相當(dāng)[3]。

人體常見病原菌中，肺炎鏈球菌是少有的在生長進入穩(wěn)定期后能觀測到大量自溶的細菌[4]。與肺炎鏈球菌穩(wěn)定期自溶現(xiàn)象直接相關(guān)的生物分子中，有一類稱作自溶素（autolysin，Lyt）的蛋白最早引起人們關(guān)注。目前，在肺炎鏈球菌中已發(fā)現(xiàn) LytA、LytB、LytC 三種自溶素，且生理功能各不相同。其中，肺炎鏈球菌所特有、自溶活性最強、研究最深入的是 LytA[5-6]。本文重點圍繞三種自溶素的結(jié)構(gòu)、功能及部分應(yīng)用有關(guān)的進展進行綜述，為進一步揭示細菌自溶現(xiàn)象的生物學(xué)本質(zhì)，并為相關(guān)領(lǐng)域研究工作提供參考。

1 LytA

1.1 LytA 基因序列與蛋白結(jié)構(gòu)

LytA 是一種 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸水解酶，García 等[7]最早于 1986年測定其編碼基因（lytA）并成功異源 表達、純化該蛋白。LytA 含 318 個氨基酸殘基，分子量為 37 kD，PI 值為 5。其 N 末端為酰胺酶結(jié)構(gòu)域（amidase domain，AD），C 末端為膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域（choline binding domain，CBD），兩者間有一段 6 個氨基酸殘基（aa171-aa176）的連接片段。

研究者對不同血清型、不同臨床來源肺炎鏈球菌的lytA序列進行對比發(fā)現(xiàn)，其基因保守性相對較高，多態(tài)性較低（0.11%～3.2%），近似管家基因。研究中用于對比的其他毒力因子基因如nanA、pspA等多態(tài)性則高達 30%[8]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，許多肺炎鏈球菌噬菌體（Dp-1）具有的細胞壁裂解酶（Pal），與宿主 LytA 的一個或兩個結(jié)構(gòu)域存在高度相似性[9]。另外，實驗室條件下，研究者也觀察到噬菌體 DNA 和lytA之間有發(fā)生重組的可能。這一現(xiàn)象提示，肺炎鏈球菌在長期進化過程中，曾可能從特定噬菌體基因組中獲得部分或全部lytA片段。

Morales 等[10]對不同肺炎鏈球菌菌株基因組進行分析，發(fā)現(xiàn)在基因空間分布上，lytA普遍與溶血素 A 編碼基因plyA靠近（間距 11～19 kb），且在健康兒童的肺炎鏈球菌定植菌群中發(fā)現(xiàn)兩基因的轉(zhuǎn)錄水平也相近，提示lytA和plyA有聚集于相同毒力島，且功能存在協(xié)同的可能。而在毒力較低的緩癥鏈球菌 SMG（Streptococcus mitisGroup）共生性菌群中，lytA-plyA存在非常顯著的同步缺失（90%～100%），進一步暗示了lytA和plyA對于肺炎鏈球菌致病性的貢獻，也勾勒出高致病性肺炎鏈球菌通過丟失該致病島，從病原菌進化為共生菌的可能圖景。

人們發(fā)現(xiàn) LytA 必須與膽堿結(jié)合，發(fā)生同源二聚化才能發(fā)揮自溶活性。在細胞質(zhì)中，lytA的翻譯產(chǎn)物是 LytA 單體（E-form），呈低活性，只有當(dāng)其結(jié)合膽堿，形成同源二聚體（C-form），并釋放至胞外，才具有完全活性。該活性形式的二聚體結(jié)構(gòu)最早由 Tomasz 和 Westphal 于 1971年證實[11]。其晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示，兩個 LytA 單體的 N 端球狀酰胺酶結(jié)構(gòu)域（Met1-Asn170，紅色）通過六氨基酸殘基接頭（Gly171-Thr176，藍色）連接至 C 端圓柱形 CBD（Gly177-Lys318，青色），單體依對稱軸形成回旋鏢二聚體結(jié)構(gòu)，內(nèi)角 85°，兩臂長 10.6 nm，酰胺酶催化活性必需的 Zn2+（灰色球狀）之間距離為 10.3 nm，C 端 CBD 中有 6 個依次排列的膽堿結(jié)合氨基酸殘基位點，由特有的 β-發(fā)夾結(jié)

圖1 LytA 二聚體的蛋白結(jié)構(gòu)[12]

圖2 LytA 酰胺酶結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)[14]

構(gòu)堆疊形成左手超螺旋，最后一個膽堿結(jié)合位點不參與膽堿結(jié)合，但對二聚化有重要貢獻[13]。

有研究將 LytA 的 AD 結(jié)構(gòu)域與多種其他細菌中的酰胺酶，諸如弗勞地枸櫞酸桿菌的 AmpD、葡萄球菌的 AmiA、AmiE 進行比較發(fā)現(xiàn)，盡管這些酰胺酶的編碼基因與lytA同源性很低（10%～20%），但蛋白三級結(jié)構(gòu)卻十分相似，尤以 AmiA 相似度最高，提示這些蛋白在不同種屬細菌中可能具有相似的生理功能和底物選擇性。

進一步研究顯示，LytA N 末端球形 AD 晶體結(jié)構(gòu) （圖2）中存在一個較舒展的 Y 形槽，由 3 條裂縫交匯組成，鋅離子結(jié)合于該交匯處形成穩(wěn)定的非共價結(jié)構(gòu)。該 Y 形槽被認為是 LytA 結(jié)合并催化底物水解的活性區(qū)域。通過計算機擬合與實驗手段結(jié)合，人們推測其能與 4～5 種含糖長鏈多肽緊密結(jié)合，并催化后者水解。通過點突變研究發(fā)現(xiàn) Y 形槽內(nèi) His26、Glu87、His133、His147、Asp149 及 Y 形槽外的 His24、His54、Lys131 對 LytA 的酶催化活性均十分重要[14]。

1.2 LytA 誘導(dǎo)自溶機制及調(diào)控

作為一種 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸水解酶，LytA 有 水解細胞壁肽聚糖層肽橋與雙糖結(jié)構(gòu)之間共價連接的活性（圖3）。與大多數(shù)分泌至胞外起效的膽堿結(jié)合蛋白不同，LytA 沒有分泌肽，屬典型的胞內(nèi)蛋白[15]。正常情況下，95% 的 LytA 存在于肺炎鏈球菌細胞質(zhì)中，僅 5% 通過 CBD 結(jié)合于細胞壁脂磷壁酸（LTA）膽堿基團，因沒有特定轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，LytA 只能通過裂解細菌釋放至胞外。而這些 LytA 究竟以何種方式轉(zhuǎn)移至胞外，機制尚不清楚[16]。

在肺炎鏈球菌的遲緩生長期至對數(shù)生長期，因某種目前未知的保護機制，結(jié)合于細胞壁上的 LytA 并不顯示出裂解活性，即使人為提高胞外 LytA 濃度，細菌的對數(shù)期生長曲線仍與正常對照組一致。但當(dāng)肺炎鏈球菌進入生長穩(wěn)定期后，該保護機制失效，細菌開始緩慢裂解。此時如提高胞外 LytA 濃度，則細菌的自溶時間提前、自溶速度加快[17]。

圖3 LytA 作用位點

關(guān)于 LytA 如何從對數(shù)生長期的無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定期的有活性狀態(tài)，目前有兩種主流假設(shè)。第一種假設(shè)認為，LTA 是 LytA 的抑制物，胞外 LytA 在與 LTA 的結(jié)合下不呈現(xiàn)活性。當(dāng)細胞壁合成停止時，兩者間的平衡關(guān)系遭破壞，LytA 脫離 LTA 而激活，自由接觸其底物發(fā)揮作用，導(dǎo)致細胞自溶。第二種假設(shè)則基于 LytA 在細胞壁的物理定位，通過熒光小分子技術(shù)，研究者觀察到胞外 LytA 主要結(jié)合于肽聚糖合成最活躍的赤道板，LytA 與新生肽聚糖的共定位提示其可能需要特定底物。LytA 在對數(shù)生長期間占據(jù)細胞壁而不誘導(dǎo)裂解[18]，但當(dāng)細菌細胞壁的合成停止、營養(yǎng)缺乏，或抗生素治療時誘導(dǎo)裂解，由此人們假定結(jié)構(gòu)完整、連接成片的成熟肽聚糖并不能作為 LytA 的底物。在細胞壁快速合成的對數(shù)期，肽聚糖單體不斷被轉(zhuǎn)肽至合成區(qū)域，LytA 也無法接觸到開放的不完整的肽聚糖結(jié)構(gòu)。但在肽聚糖合成停滯的穩(wěn)定期，轉(zhuǎn)肽停止，新生肽聚糖的結(jié)構(gòu)暴露出來，才能為 LytA 提供正確的底物，從而開啟最初的裂解進程[17]。

隨著菌體的裂解，儲存于細胞質(zhì)中的 LytA 不斷釋放至環(huán)境中并逐漸積累，在整個穩(wěn)定期期間，LytA 的細胞外部分占比緩慢增加至約 30%，釋放的 LytA 又與鄰近完整菌體的細胞壁結(jié)合，促發(fā)裂解級聯(lián)反應(yīng)。達到特定閾值濃度時，細菌自身調(diào)控 LytA 活性的平衡機制被打破，最終導(dǎo)致連鎖 的自溶現(xiàn)象。目前，這一閾值濃度經(jīng)間接證明約為 0.5 μg/ml 即 14 nmol/L 左右。

LytA 的活性調(diào)控與膽堿密切相關(guān)，細胞壁 LTA 中的膽堿基團介導(dǎo) LytA 從低活性的E-form 轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘?C-form，在 LytA 的二聚化中扮演重要角色。但低濃度的游離膽堿（0.1% 及以上）卻可通過抑制 LytA 活化的方式抑制肺炎鏈球菌的自溶。其抑制形式既可能是非競爭性抑制，即通過結(jié)合 LytA 的非活性部位使得作為中間絡(luò)合物的 LytA-底物-膽堿結(jié)合物無法釋放出產(chǎn)物，也可能是競爭性抑制，即通過競爭性結(jié)合 LytA 膽堿結(jié)構(gòu)域的方式，使其失去與 LTA 結(jié)合的機會，從而無法定位到正確的底物位置。但究竟哪種抑制方式更接近真實的情況，目前尚無定論。另外，肺炎鏈球菌在生長過程中如采用含乙醇胺而無膽堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)，LytA 的表達量下降，細菌不發(fā)生自溶[19]。這提示，膽堿也可能在 LytA 表達、翻譯、修飾過程中發(fā)揮重要作用。

1.3 LytA 的其他功能

眾所周知，補體系統(tǒng)是介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的關(guān)鍵組分，用于識別和清除各類病原菌。而 LytA 能有效幫助肺炎鏈球菌免疫逃逸。通過流式細胞術(shù)、ELISA 等手段，研究者觀察到，與野生型菌株相比，LytA 缺陷菌株表面的補體 C3b 沉積有明顯增加。同時，LytA 可以降低補體 C1q 和急性期蛋白與肺炎鏈球菌的結(jié)合，或直接降解 C3b 和 iC3b，從而減少細菌表面補體經(jīng)典途徑的活化。除直接影響補體系統(tǒng)，LytA 還可募集肺炎鏈球菌細胞壁的補體下調(diào)蛋白 C4BP 和 FH，利用補體系統(tǒng)自身的調(diào)節(jié)蛋白減少補體對于肺炎鏈球菌的識別與結(jié)合[20]。

除干擾宿主免疫系統(tǒng)，LytA 還能通過介導(dǎo)肺炎鏈球菌的莢膜脫落避免抗菌肽的殺傷作用。通常情況下，細菌產(chǎn)生莢膜以抵御抗生素與宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。但另一方面，莢膜使肺炎鏈球菌對宿主上皮細胞分泌的抗菌肽十分敏感。當(dāng)抗菌肽存在時，LytA 可在數(shù)分鐘內(nèi)將菌體表面的莢膜清除，從而使細菌存活[21]。與經(jīng)典的細菌自溶過程不同，在莢膜脫落期間，LytA 促進肺炎鏈球菌存活并且使細菌向周圍侵襲，因此莢膜的脫落將顯著增加肺炎鏈球菌對上皮細胞的侵襲。不少研究者曾一度困惑為何在作用于細胞壁的抗生素（如青霉素）對 LytA 產(chǎn)生巨大選擇壓力的情況下，LytA 仍保守地存在于幾乎所有肺炎鏈球菌臨床致病株中？現(xiàn)在看來，上述研究或可一定程度解釋這一現(xiàn)象。

1.4 LytA 的應(yīng)用前景

1.4.1 臨床檢測lytA僅存在于肺炎鏈球菌中，且基因序列具有高度保守性。這為臨床上將其作為鑒定肺炎鏈球菌的潛在檢測標(biāo)志物提供了可能。例如有報道顯示，用 PCR 法定性檢測胸腔積液中的肺炎鏈球菌，相較其他標(biāo)志基因（如plyA、psaA），lytA有更高靈敏度[22]。而采用lytA-qPCR 手段定量檢測咽拭子與痰液標(biāo)本中的肺炎鏈球菌，也顯示出較高的靈敏度和特異性[23]。同時，LytA 在肺炎鏈球菌定植菌群的表面豐度與環(huán)境豐度，和處在快速侵襲擴張期的肺炎鏈球菌菌群相比存在很大的差異。這種差異可通過熒光定量 PCR 或 ELISA 等手段進行檢測，從而區(qū)分一般性定植與侵襲性感染的可能[24]。

1.4.2 免疫預(yù)防 LytA 也可以作為特異性免疫的疫苗進行開發(fā)，因其廣泛分布于所有血清型的肺炎鏈球菌表面，可以克服現(xiàn)有多糖疫苗的血清型局限，也可以克服多糖-蛋白結(jié)合疫苗不能產(chǎn)生免疫記憶的問題[25]。有動物實驗證明，使用 LytA 免疫幼齡小鼠可以獲得比莢膜多糖疫苗更好的免疫效果[26-27]，是一種較理想的備選被動疫苗。

2 LytB 與 LytC

LytB（77 kD、PI 5）和 LytC（59 kD、PI ≈ 6）是另兩種重要的肺炎鏈球菌自溶素，也屬于膽堿結(jié)合蛋白家族，擁有細胞壁水解活性，但具體底物至今尚未完全明確。它們的一級結(jié)構(gòu)與 LytA 相反，催化活性中心位于 C 末端，膽堿結(jié)合域位于 N 末端。另外，lytB與lytC并非肺炎鏈球菌專有，在輕型鏈球菌和口腔鏈球菌中能找到它們的高同源性基因。這些基因與lytB的同源性大致在 70%～90% 之間，與lytC的同源性大致在 70%～80% 之間。與lytA相比，lytB與lytC的基因保守性稍低，不同菌株之間，lytB的差異可達 10%，lytC可達6%。總體而言，目前關(guān)于這兩個自溶素蛋白的研究尚不充分，研究者們利用與 LytA 相似的方法構(gòu)建了缺陷菌株，借此研究了它們的生理功能?，F(xiàn)認為，LytB 與肺炎鏈球菌特征性的大規(guī)模自溶無關(guān)，但 LytC 具有一定的間接關(guān)系[28]。

LytB 是一種存在于不同細菌中的 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，具有分泌肽序列，可以水解可溶性 N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）寡聚體并顯示出較弱的糖基轉(zhuǎn)移酶活性，但這些酶活性在細菌生長、繁殖中的功能定位尚不清楚。不同于 LytA，在肺炎鏈球菌中，LytB 分布在遠離赤道板的菌體兩端，參與子代細胞的分離[29]與生物膜形成。典型的肺炎鏈球菌為雙球菌或短鏈狀排列，這些生長形式受 LytB 氨基葡萄糖苷酶的功能調(diào)控。敲除 LytB 基因，肺炎鏈球菌將呈約 100 個菌體長度的長鏈狀排列，且對細菌的生物被膜形成產(chǎn)生負面影響。此外，與 LytA 近似，LytB 也能夠介導(dǎo)肺炎鏈球菌對補體系統(tǒng)的逃避，但其所介導(dǎo)逃避方式的多樣性則不及前者[30]。另外，敲除 LytB，肺炎鏈球菌定植于人鼻咽部的能力降低。

LytC 是一種胞壁水解酶，不同于 LytA 和 LytB，其最適活性溫度為 30℃，而這恰好是上呼吸道中的生理溫度。在肺炎鏈球菌肺炎感染模型中，LytC 缺陷菌株感染能力顯著減弱。提示其是一種有助于肺炎鏈球菌定植于鼻咽部、引發(fā)肺炎的毒力因子[31]。此外，與野生型菌株相比，鼻內(nèi)接種 LytC 突變菌株，引起的菌血癥發(fā)生率降低，提示 LytC 對細菌從肺組織穿透毛細血管屏障，進入循環(huán)系統(tǒng)的過程中起重要作用[32]。

目前認為，作為毒力因子，LytB 和 LytC 具有累加或協(xié)同作用，均廣泛參與到肺炎鏈球菌在宿主的免疫逃避、鼻咽定植、生物膜形成、上呼吸道感染等多個環(huán)節(jié)中[33]。另 外，最近有報道顯示，LytB、LytC 都擁有結(jié)合 DNA 的能力，共聚焦激光掃描顯微鏡證實肺炎鏈球菌生物膜中細胞間 DNA-LytB、DNA-LytC 蛋白復(fù)合物的存在，提示二者與肺炎鏈球菌的胞間 DNA 交換存在一定聯(lián)系[34]。

3 小結(jié)

肺炎鏈球菌保留lytA等自溶素基因的生物學(xué)本質(zhì)，可能還是基于受調(diào)控的自溶能力能給細菌帶來諸多的生物學(xué)競爭優(yōu)勢。從目前研究中獲得的線索判斷，Lyt 的相應(yīng)功能，無論是促侵襲、定植，還是免疫逃避、DNA 交換，均利于肺炎鏈球菌在宿主-環(huán)境-病原多角關(guān)系中獲得更多存活機會?？梢酝茰y，對于肺炎鏈球菌而言，大規(guī)模自溶可能是一種雙刃劍式的平衡策略，利用自溶帶來的侵襲、定植、免疫逃避、遺傳物質(zhì)交換與重組的能力，可幫助細菌自身低強度地擴張至宿主身體的其他位置。因丟失諸如lytA等基因而失去部分致病能力與大規(guī)模自溶能力的個體，則可能逐漸進化成致病力較弱的鏈球菌種群，與宿主形成相對穩(wěn)定的共生關(guān)系，這對于種群總的生存與進化具有重要意義[10]。從 LytA、LytB、LytC 已知的功能判斷，在肺炎鏈球菌的生長、繁殖、宿主侵襲等過程中，三個蛋白之間很可能存在復(fù)雜的聯(lián)動和交互關(guān)系，如能結(jié)合它們的上下游基因功能，從整體的視角分析、探討三者的生理、生化功能，或可為進一步揭示肺炎鏈球菌獨特生存方式的秘密提供一把有效的鑰匙。不過，LytB 和 LytC 的研究仍相對薄弱，目前雖已積累了較多基因功能方面的研究結(jié)果，但兩種蛋白的細胞壁作用位點、底物特征、作用形式、調(diào)控與激活分子機制等尚待進一步闡明。此外，Lyt 在肺炎鏈球菌臨床微生物學(xué)診斷、疫苗設(shè)計，甚至藥用開發(fā)領(lǐng)域的潛在價值已開始獲得關(guān)注，如有研究者以 LytA 重組蛋白為潛在抗菌生物制劑，評價其體外、體內(nèi)條件下選擇性殺滅肺炎鏈球菌的活性，發(fā)現(xiàn)其聯(lián)用 β-內(nèi)酰胺類藥物可增強后者的殺菌效果，這樣的研究或可為 Lyt 蛋白的藥用探索提供一定的啟發(fā)。鑒于肺炎鏈球菌中 Lyt 蛋白獨特的結(jié)構(gòu)和功能，以及在醫(yī)藥領(lǐng)域潛在的應(yīng)用價值，相信未來人們對這類蛋白的研究將更加深入、系統(tǒng)地開展下去。