miRNA-1297通過靶向BH3結構域凋亡誘導蛋白促進肝細胞癌的進展

陶元平，王麗萍，楊遠，黃智平，倪俊聲，周偉平

肝細胞癌（HCC）是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，尤其是在中國[1]。但由于其發(fā)病過程復雜，目前其發(fā)病機制尚不完全清楚。肝癌的臨床治療效果非常有限，手術仍是最常用的治療方法。然而，低治愈率和手術后高復發(fā)率降低了手術的療效[2-3]。因此，迫切需要進一步研究肝細胞癌的發(fā)病機制和發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點以期實現(xiàn)對肝細胞癌的個體化靶向治療。

microRNAs（miRNAs）是一類在真核生物中廣泛存在的長度為 20～22 個核苷酸的內源性非編碼 RNA。這些分子大約占整個人類基因組的 1%，在各種組織中廣泛表達[4]。miRNAs 可以直接靶向靶基因的 3'-非翻譯區(qū)（UTR），從而抑制這些基因的翻譯或誘導降解。研究證實 miRNAs 在包括細胞增殖、分化、凋亡和遷移在內的多種重要的生物學過程中發(fā)揮著重要作用。因此 miRNAs 在腫瘤的發(fā)生和進展中扮演重要角色，并可能作為潛在的治療靶點[5-8]。目前已經證實 miR-361[5]、miR-122[9]和 miR-199[10]等異常表達的 miRNAs 參與了肝癌的發(fā)生和進展。最新的研究證實，miR-1297 與多種癌癥聯(lián)系緊密，包括胃癌[11]和胰腺癌[12]。本研究證實 miR-1297 在肝癌組織中的高表達與患者的不良預后顯著相關，并重點關注了 miR-1297 在肝細胞癌發(fā)展過程中的作用以及相應的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 109 對 HCC 組織和其匹配的癌旁組織來自 2013年1月- 2015年12月海軍軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院進行根治手術的肝細胞癌患者。癌旁組織距離癌灶邊緣超過 5 cm。標本和相應的鄰近組織來自同一肝癌患者。由本院擁有 5年以上經驗的病理醫(yī)師檢查每個組織樣本 并確認組織類型。術后腫瘤組織立即凍存于 -80 ℃ 液氮中以備后用?；颊咴谑中g前沒有接受任何治療。本研究經海軍軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會批準且所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 細胞系 人肝細胞癌細胞系 SMMC-7721 和 HepG2、人肝細胞系 QSG-7701 和 HEK293 購自中國科學院細胞庫。

1.1.3 試劑 胎牛血清購自美國 Gibco 公司；DMEM 培養(yǎng)基和 lip2000 購自美國 Invitrogen 公司；miR-1297 陰性對照、抑制劑或模擬物購自廣州市銳博生物科技有限公司；報告基因購自上海吉馬生物制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞系培養(yǎng)與轉染 將 SMMC-7721、HepG2、QSG-7701 和 HEK293 細胞培養(yǎng)在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37 ℃ 置于 5% CO2中。將 2.5 × 105SMMC-7721 或 HepG2 細胞接種于 6 孔板中培養(yǎng)過夜，然后用 50 nmol/L miR-1297 陰性對照、抑制劑或模擬物根據產品說明書，使用 lip2000 進行轉染。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 具體實驗操作過程依照參考文獻[13]，U6 為內參基因。用 2-ΔΔCT方法分析 miR-1297 的相對表達情況。

1.2.3 細胞增殖和凋亡實驗 具體實驗操作過程依照參考文獻[13]。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因分析 具體實驗操作過程依照參考文獻[13]和試劑說明書進行。

1.2.5 蛋白質印跡分析 具體實驗操作過程依照參考文獻[13]。所用抗體 BID（ab32060）、Anti-Bid Cleavage Site（ab108293）、cytochrome C（ab13575）和 gapdh（ab8245）。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 18.0 版進行統(tǒng)計分析。Kaplan-Meier 生存分析法用于肝細胞癌患者的生存資料分析，并用對數(shù)秩檢驗進行顯著性檢驗。t檢驗來比較兩組的數(shù)據，當P＜ 0.05 時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-1297 在肝細胞癌中顯著上調表達

為了研究 miR-1297 在肝細胞癌中的表達情況，通過 qRT-PCR 分析了 109 對肝癌組織和匹配的癌旁組織中 miR-1297 的表達水平，結果提示其在肝細胞癌中顯著上調表達（圖1A）。qRT-PCR 結 果證實，相對于肝細胞系 QSG-7701，miR-1297 在肝癌細胞系 SMMC-7721 和 HepG2 中的表達也明顯上調（圖1B）。為了評估 miR-1297 表達與預后的關系，將 109 例肝細胞癌患者的組織樣本按照 miR-1297 的中位表達分為高/低兩組。生存曲線顯示，在肝細胞癌組織中 miR-1297 的高表達與患者不良預后顯著相關（圖1C 和 1D）。

2.2 抑制 miR-1297 降低肝癌細胞增殖能力

研究了 miR-1297 在肝細胞癌進展中的潛在作用。首先將 miR-1297 抑制劑轉染至肝癌細胞系 SMMC-7721 和 HepG2 中，通過 qRT-PCR 證實 miR-1297 在轉染后的肝癌細胞系中顯著下調表達（圖2A）。細胞增殖實驗證實降低 miR-1297 表達可以顯著抑制肝細胞癌細胞的增殖能力（圖2B）。以上結果提示 miR-1297 在體外可以增強肝細胞癌細胞的增殖能力。

2.3 抑制 miR-1297 促進肝癌細胞凋亡

本研究還檢測了 miR-1297 在調節(jié)肝癌細胞凋亡中的作用，實驗結果證實抑制miR-1297 的表達可促進肝癌細胞的凋亡（圖2C）。以上數(shù)據表明在肝細胞癌中高表達的 miR-1297 可抑制肝癌細胞凋亡。

2.4 miR-1297 直接靶向 BID

為了探索 miR-1297 促進肝癌細胞進展的分子學機制，利用在線軟件 TargetScan 7.2 預測 miR-1297 的潛在結合靶點。在被預測的所有靶基因中，發(fā)現(xiàn) BH3 結構域凋亡誘導蛋白（BH3 interacting domain death agonist，BID）（Bcl2 家族成員）與細胞凋亡的關系最為密切（圖3A）。首先構建了包含 BID 的 3'-UTR 區(qū)的雙熒光素酶報告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)通過與 miR-1297 模擬物共轉染后熒光素酶活性顯著降低，然而在 3'-UTR 中含有突變潛在靶位點的熒光素酶活性無變化（圖3B）。此外，Western blot 實驗證實在 HepG2 和 SMMC-7721 細胞中抑制 miR-1297 可提高 BID 的蛋白表達水平（圖3C）。

以往研究證實 BID 可通過 tBID-線粒體途徑誘導細胞凋亡[14]。因此，接下來研究了 miR-1297 在肝細胞癌細胞中對相關信號通路的影響。Western blot 實驗證實抑制 miR-1297 表達顯著提高了線粒體中 tBID 和細胞色素 C 的表達水平（圖3D）。以上結果提示，miR-1297 可通過 tBID 線粒體凋亡途徑抑制肝癌細胞的凋亡。

圖1 miR-1297 在肝癌組織和細胞系中上調（A：qRT-PCR 檢測 109 對肝癌組織和匹配的癌旁正常組織中 miR-1297 的表達水平；B：qRT-PCR 檢測 miR-1297 在永生化正常肝細胞系 QSG-7701 和肝癌細胞系 SMMC-7721 和 HepG2 中的表達水平；C：Kaplan-Meier 生存曲線分析 miR-1297 表達水平與無復發(fā)生存率之間的關系；D：Kaplan-Meier 生存曲線分析 miR-1297 表達水平與總體生存率之間的關系；**P ＜ 0.01 和 ***P ＜ 0.001） Figure 1 miR-1297 is up-regulated in HCC tissue and cell lines (A：qRT-PCR analysis of miR-1297 expression levels in 109 pairs of HCC tissues and matched nontumor tissues; B：Relative expression of miR-1297 in the immortalized normal hepatic cell line QSG-7701 and HCC cell lines SMMC-7721 and HepG2 was detected by qRT-PCR; C：Kaplan-Meier survival curves showing the relationship between high or low miR-1297 expression levels with the overall survival of HCC patients; D：Kaplan-Meier survival curves showing the relationship between high or low miR-1297 expression levels with the recurrence free survival of HCC patients;**P ＜ 0.01 and ***P ＜ 0.001)

2.5 BID 是 miR-1297 介導的抑制細胞凋亡的 原因

為了進一步闡明 BID 在 miR-1297 介導肝癌細胞凋亡中的作用，我們用 Bcl2 抑制劑 ABT-199 處理了 SMMC-7721 和 HepG2 細胞。發(fā)現(xiàn)在 SMMC-7721 和 HepG2 細胞中，ABT-199 對 miR-1297 的表達沒有任何影響（圖4A），而加入 ABT-199 后抵消了降低 miR-1297 表達對肝癌凋亡的抑制作用（圖4B）。這些結果表明 miR-1297 主要通過靶向 BID 蛋白發(fā)揮其抑制凋亡的生物學功能。

3 討論

以前的研究表明，miRNAs 在肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[11,15-17]，并且可以用作診斷或預后標志物。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) miR-1297 在肝癌組織中顯著上調表達，并且 miR-1297 的高表達預示著肝癌患者術后的預后不良。本研究表明 miR-1297 可能是一個潛在的預測肝細胞癌患者手術預后臨床標志物和治療的分子靶點。

圖2 抑制 miR-1297 促進肝癌細胞凋亡并降低增殖能力（A：qRT-PCR 檢測 miR-1297 抑制劑或對照轉染至 SMMC-7721 和 HepG2 細胞后 miR-1297 的表達；B：用 CCK8 法評估 miR-1297 抑制劑或 miR-NC 轉染的 SMMC-7721 細胞和 HepG2 細胞的增殖能力；C 用流式細胞儀檢測 miR-1297 抑制劑或 miR-NC 轉染的 SMMC-7721 細胞和 HepG2 細胞的凋亡率；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 和 ***P ＜ 0.001） Figure 2 Inhibition of miR-1297 promotes HCC apoptosis and reduces proliferation (A：Relative expression of miR-1297 in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with 80 nmol/L miR-1297 inhibitor or control; B：Estimation of cell proliferation in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with control or miR-1297 inhibitor by CCK8 assays; C：Rate of apoptosis of SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-1297 inhibitor or miR-NC was detected by FACS; *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01 and ***P ＜ 0.001)

BID 蛋白與線粒體途徑誘導的細胞凋亡有關，能夠有效促進細胞凋亡[18]。BID 主要分布在細胞質中，無促進細胞凋亡的活性。然而，當 caspase8 被激活時，BID 蛋白被識別并裂解成蛋白質的激活形式被稱為 tBID，并且 tBID 從細胞質被轉運到外線粒體膜以與 Bcl2 蛋白結合并抑制其抗凋亡作 用[14,19]或增加線粒體通透性以誘導細胞色素 C 的釋放，從而激活下游 caspase3 和 caspase9 以促進細胞凋亡。最近發(fā)現(xiàn)，miR-20a 直接靶向 BID 基因，通過 tBID 線粒體途徑誘導 TRAIL 耐藥性直腸癌細胞 SW480 的凋亡。以往研究表明，HepG2 和 SMMC-7721[15-16]細胞的凋亡是由 tBID 介導的線粒體途徑調控的，這與本研究的發(fā)現(xiàn)是一致的。本研究通過一系列實驗證實發(fā)現(xiàn)，miR-1297 可以通過抑制 tBID-線粒體凋亡途徑抑制細胞凋亡，為 BID 對細胞凋亡的調控機制研究提供了新的思路。

圖3 miR-1297 直接靶向 BID[A：TargetScan 分析顯示 BID 的 3'-UTR 區(qū)段存在 miR-1297 潛在結合位點，示意圖顯示了 miR-1297 與 BID 結合的 3'-UTR 野生型（WT）和 BID 3'-UTR 突變體（MUT）；B：過表達 miR-1297 降低了 BID 3'-UTR WT 熒光素酶活性，而未改變突變的 BID 3'-UTR MUT 中熒光素酶活性；C：Western blot 分析miR-NC 和 miR-1297 抑制劑轉染的 SMMC-7721 和 HepG2 細胞中 BID 的表達；D：Western blot 分析 miR-NC 或 miR-1297 抑制劑轉染的 SMMC-7721 和 HepG2 細胞系中 tBID 和 cytochrome C 蛋白表達；***P ＜ 0.001]Figure 3 miR-1297 directly targets BID [A：TargetScan analysis demonstrated the presence of putative miR-1297 targets sites in the 3'-UTR of BID.Schematic showing the putative binding sites of miR-1297 in the 3'-UTR of BID and mutations in the miR-1297 binding sites; B：Relative luciferase activity in BID 3'-UTR wild-type (WT) and BID 3'-UTR mutant (MUT) demonstrated that miR-1297 mimics downregulate luciferase activity from wild-type BID 3'-UTR,but not from mutant BID 3'-UTR; C：Western blot analysis of BID expression in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-NC and miR-1297 inhibitor; D：Western blot analysis of the tBID-mitochondrial pathway in SMMC-7721 and HepG2 cell lines transfected with miR-NC or miR-1297 inhibitor; ***P ＜ 0.001]

圖4 miR-1297 通過 BID 的轉錄后調控抑制 HCC 細胞凋亡（A：qRT-PCR 分析在 miR-NC 和 miR-1297 抑制劑轉染的 SMMC-7721 和 HepG2 細胞后用 ABT-199 或 DMSO 處理后 miR-1297 的表達情況；B：流式細胞儀檢測用 A 圖處理后各組細胞的凋亡率，***P ＜ 0.001） Figure 4 miR-1297 inhibits HCC apoptosis by the post-transcriptional regulation of BID (A：qRT-PCR analysis of miR-1297 expression in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-NC or miR-1297 inhibitor,followed by treatment with ABT-199 or DMSO,as indicated; B：Rate of apoptosis of SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-1297 inhibitor or miR-NC and treated with ABT-199 or DMSO was detected by FACS; ***P ＜ 0.001)

研究證實，miR-1297 通過靶向不同靶點在多種癌癥中發(fā)揮重要作用，例如：通過靶向 cyclin D2 抑制結腸癌細胞的增殖和轉移能力[17]；靶向 CREB1 抑制胃癌細胞的增殖[12]；還可靶向異黏蛋白（MTDH）抑制胰腺癌的增殖和轉移[12]。MTDH也被稱為星形膠質細胞上調基因-1（AEG-1）蛋白，是一種跨膜蛋白[20]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MTDH 在肝細胞癌中起著重要作用。Jung 等[21]報道，高表達的 MTDH 是肝癌患者術后總生存率和無病生存率的獨立預測因子。Jyoti 等[22]的研究結果表明，MTDH 可誘導脂肪變性、抑制衰老和激活凝血途徑來促進肝癌的發(fā)生和發(fā)展。Zhou 等[23]報道 MTDH 可通過誘導上皮間充質轉化過程來促進肝癌轉移。Li 等[24]報道敲除 MTDH 后抑制了肝癌細胞的生長并誘導其凋亡。基于 MTDH 在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，我們大膽猜測 miR-1297 也極有可能通過靶向 MTDH 抑制肝癌的發(fā)展，這將是我們下一步研究的重點方向。

綜上所述，本研究表明，miR-1297 在肝細胞癌組織中上調表達，增強了肝細胞癌細胞的增殖能力。一系列的體外分子實驗證實 miR-1297 通過靶向 BID 和抑制 tBID-線粒體凋亡途徑來促進肝細胞癌的發(fā)展，表明 miR-1297 可能是一個新的肝癌治療靶點。