珍貴束絲放線菌產(chǎn)生的新代謝產(chǎn)物1-羥基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯

王靜，胡笑文，白利平，張苗青，張靖溥，江冰婭，孫桂芝，黎林麗，李書芬，張玉琴，劉紅宇，余利巖，武臨專

放線菌具有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力。珍貴束絲放線菌 ATCC 31565（簡(jiǎn)稱 ATCC 31565）是抗腫瘤抗生素——安絲菌素（ansamitocin）生產(chǎn)菌株[1]。該菌株還產(chǎn)生四氫異喹啉類生物堿化合物 dnacins、環(huán)肽類化合物 actinosynneptides 和含色氨酸的二酮哌嗪類化合物等[2-4]。

在優(yōu)化培養(yǎng)條件提高安絲菌素發(fā)酵效價(jià)的研究中，對(duì) ATCC 31565 產(chǎn)生的脂溶性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了挖掘，發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個(gè)新化合物，經(jīng) NMR 解析等確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)為鼠李糖苷化的 1,4-二羥 基-2-萘甲酸甲酯，并將其命名為珍貴酚，并對(duì)其生物合成途徑進(jìn)行了推測(cè)。

自噬是真核細(xì)胞維持自身生理穩(wěn)態(tài)的一種機(jī)制，是不被使用的細(xì)胞組分和受損細(xì)胞器被降解與再利用的一種基本過(guò)程。由于越來(lái)越多的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)（激活或抑制）自噬活性，對(duì)珍貴酚是否具有調(diào)節(jié)自噬活性進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 珍貴束絲放線菌 ATCC 31565（CPCC 203294），由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：酵母提取物 4.0 g/L、麥芽提取物 10.0 g/L、葡萄糖 4.0 g/L、瓊脂粉 15.0 g/L，pH 自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精 50.0 g/L、麥芽糖 20.0 g/L、棉籽餅粉 25.0 g/L、玉米漿 1.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、NaCl 2.0 g/L、瓊脂粉 20.0 g/L，pH 7.0。

1.1.3 化學(xué)試劑和色譜柱 高效薄層色譜層析板（HSGF254）為煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所產(chǎn)品；MCI 色譜柱填料為日本三菱化學(xué)公司產(chǎn)品；分析型色譜柱 Diamonsil C18(2)（150 mm × 4.6 mm，5 μm）為北京迪科馬科技有限公司產(chǎn)品；半制備型 HPLC 色譜柱 YMC-Pack ODS-AQ（250 mm × 10.0 mm，S-5 μm）為日本 YMC 公司產(chǎn)品；甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯等分析純?cè)噭楸本┗S產(chǎn)品；色譜純甲醇和乙腈為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；純凈水為深圳屈臣氏蒸餾水有限公司產(chǎn)品；抗 ATG5 抗體 NB110-53818 為美國(guó)Novus Biologicals 公司產(chǎn)品；抗 ATG7 抗體 8558S 為美國(guó) Cell Signaling Technology 公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器 HPLC-20A 高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品；Eyelan-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為日本 Eyela 公司產(chǎn)品；Agilent Ultivo 三重四極桿 LC/MS 質(zhì)譜儀購(gòu)自安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；AVIIIHD 600 核磁共振儀為德國(guó) Bruker 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ATCC 31565 培養(yǎng)與發(fā)酵 將冷凍保藏的 ATCC 31565 孢子懸液均勻涂布于種子培養(yǎng)基平板，28 ℃ 培養(yǎng) 5 d。將種子培養(yǎng)基平板上的孢子用無(wú)菌水洗下，振蕩后得孢子懸液。將該孢子懸液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基平板（約 1000 個(gè)，50.0 L），28 ℃ 培養(yǎng) 8～10 d，收集發(fā)酵培養(yǎng)物，用于目標(biāo)化合物分離純化。

1.2.2 TLC 和 HPLC 發(fā)現(xiàn)珍貴酚 將 ATCC 31565 發(fā)酵培養(yǎng)物（45～55 ml）切成小塊，用二倍體積乙酸乙酯提取 2 次，每次 24 h；合并提取液并減壓旋蒸得到粗提物，用 0.5 ml 乙酸乙酯復(fù)溶，取 10 μl 進(jìn)行硅膠板 TLC 分析，展開(kāi)系統(tǒng)為二氯甲烷-甲醇（10:1）；將目標(biāo)條帶刮下后用乙酸乙酯提取，提取液經(jīng)真空濃縮干燥后復(fù)溶于甲醇，進(jìn) 行 HPLC 分析，流動(dòng)相為 25%～50% 乙腈-水 （30 min），檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm。

1.2.3 珍貴酚的分離純化 ATCC 31565 發(fā)酵培養(yǎng)物 50 L，用約 2 倍體積乙酸乙酯萃取2 次，減壓旋蒸后得到粗提物 185 g；粗提物上 MCI 色譜柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相為 45%、55%、65%、100% 乙醇，階式梯度洗脫，將 65% 洗脫餾分合并旋蒸得到粗品 427 mg；粗品用甲醇復(fù)溶后采用半制備 HPLC（流動(dòng)相為水和甲醇，洗脫條件為 65% 甲醇等度，流速 1.5 ml/min，出峰時(shí)間為 45 min）純化，得到珍貴酚純品 8.7 mg。

1.2.4 珍貴酚的 NMR 測(cè)定 取珍貴酚純品約 1.0 mg，溶于甲醇中，在室溫條件下進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析。取珍貴酚純品約 5.0 mg，溶于氘代 DMSO 中，在室溫條件下進(jìn)行 1D 和 2D NMR 測(cè)定。

1.2.5 珍貴酚中的鼠李糖鑒定 稱取純化的珍貴 酚樣品，用甲醇配制成 1.0 mg/ml 溶液，取 20 μl 點(diǎn)樣于玻璃片上，平放于裝有濃鹽酸的密閉玻璃缸中，60 ℃ 水浴鍋中加熱 1 h，取出玻璃片，用水將樣品輕輕洗下，點(diǎn)樣于硅膠板上，同時(shí)點(diǎn)樣珍貴酚、L-鼠李糖和L-巖藻糖，作為對(duì)照。正丁醇-丙酮-水（4:3:1）為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)結(jié)束后用 10 % 硫酸溶液噴霧，85 ℃ 加熱顯色[5-6]。

1.2.6 調(diào)節(jié)自噬活性測(cè)定[7]將培養(yǎng)于含 10% FBS、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的 HepG2 細(xì)胞，用不同終濃度（1、5、10 和 20 μmol/L）的珍貴酚處理 24 h 后，在含有蛋白酶抑制劑的 RIPA 細(xì)胞裂解緩沖液中進(jìn)行裂解。裂解得到的蛋白用 12% SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移到硝 酸纖維素膜上后，用抗 ATG5 和抗 ATG7 抗體進(jìn)行孵浴。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)化合物的發(fā)現(xiàn)

ATCC 31565 的乙酸乙酯提取物在 TLC 分析時(shí)，在紫外 254 nm 下出現(xiàn)一條藍(lán)色熒光條帶。將該條帶刮下，提取其中的化合物并進(jìn)行 HPLC 分析，發(fā)現(xiàn)在 215、254 和 356 nm 處有吸收峰 （圖1）。質(zhì)譜分析提示其中的化合物分子量為 364（m/z 365 [M+H]+）。

ATCC 31565 的發(fā)酵培養(yǎng)物約 50 L，經(jīng)乙酸乙酯提取后，采用 MCI 色譜柱和半制備 HPLC 分離純化，得到該目標(biāo)化合物純品 8.7 mg。

圖1 ATCC 31565 產(chǎn)生的珍貴酚的 HPLC 圖 Figure 1 HPLC chromatogram of pretiphenol from ATCC 31565

2.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)確定

目標(biāo)化合物為淡黃色無(wú)定形粉末。根據(jù) HRESIMS 數(shù)據(jù)（m/z 365.1227，[M+H]+），推測(cè)其分子式為 C18H20O8（理論分子質(zhì)量 364.1231，誤差 -1.08 ppm）。

在1H NMR 譜中，包含屬于 1 個(gè)鄰二取代苯環(huán)上的 4 個(gè)偶合質(zhì)子共振信號(hào)δH8.11（1Hd，J= 8.4，H-6）、7.77（1H，t，J = 7.2 Hz，H-7）、7.66（1H，t，J = 7.2 Hz，H-8）和 8.32（1H，d，J = 8.4 Hz，H-9），1 個(gè)苯環(huán)上質(zhì)子單峰信號(hào)δH7.33（1H，s），1 個(gè)甲氧基質(zhì)子信號(hào)δH3.98（3H，s），以及 1 個(gè)活潑氫的質(zhì)子信號(hào)δH11.58（1H，s）；此外，1H NMR 譜中的δH5.47、δH1.13 d（6.0）和δH3.52～5.12 之間的質(zhì)子共振信號(hào)表明存在 1 個(gè)脫氧己糖基（表1）。

表1 目標(biāo)化合物的 NMR 數(shù)據(jù) Table 1 The NMR data of target compound

在13C NMR 譜中，一共有 18 個(gè)碳信號(hào)、 10 個(gè)芳香碳、1 個(gè)羰基碳、1 個(gè)氧甲基碳、1 個(gè)甲基碳、4 個(gè)含氧次甲基碳信號(hào)和 1 個(gè)端基碳信號(hào)。根據(jù) HMBC 和1H-1H COSY 信號(hào)，10 個(gè)芳香碳來(lái)自一個(gè)萘環(huán)結(jié)構(gòu)，而 4 個(gè)含氧次甲基、1 個(gè)甲基和 1 個(gè)端基質(zhì)子的1H-1H COSY 關(guān)聯(lián)進(jìn)一步證實(shí)含有 1 個(gè)脫氧己糖基（表1）。因此，推測(cè)珍貴酚可能屬于糖苷化的萘酚類化合物。

圖2 目標(biāo)化合物(珍貴酚)的結(jié)構(gòu)及其 1H-1H COSY 相關(guān)和主要的 HMBC 相關(guān)信號(hào) Figure 2 The structure and key 1H-1H COSY and HMBC correlations of target compound (pretiphenol)

圖3 TLC 鑒定目標(biāo)化合物中的L-鼠李糖 Figure 3 The identification of L-rhamnose from target compound by TLC

目標(biāo)化合物的羥基活潑氫δH11.58 與 C-2 和 C-10 有關(guān)聯(lián)（圖2），來(lái)自萘環(huán)上 sp2雜化的次甲基氫（H-9，δH8.32）與 C-1 有關(guān)聯(lián)，證明該羥基連接在 C-1 上。來(lái)自氧甲基的氫（H3-12，δH3.98）與羰基碳（C-11，δC170.2）有關(guān)聯(lián)，表明是一個(gè)甲酯基團(tuán)，C-3 位的芳香氫（H-3，δH7.37）與甲酯的羰基碳（C-11，δC170.2）和芳香碳（C-4，δC143.5） 有關(guān)聯(lián)，表明 C-2 位連接了甲酯基團(tuán)。C-6 位的氫（H-6，δH8.11）與脫氧己糖的端基質(zhì)子信號(hào) （H-1'）有關(guān)聯(lián)，并同時(shí)與一個(gè)低場(chǎng)區(qū)烯烴碳（C-4，δC143.5）有關(guān)聯(lián)，提示 C-4 位連接了糖苷。根據(jù)天然產(chǎn)物中出現(xiàn)的脫氧己糖種類，推測(cè) C-4 連接的脫氧己糖為 L-鼠李糖（L-rhamnose）或 L-巖藻糖（L-fucose，即6-脫氧-L-半乳糖），且前者的可能性更大，因?yàn)橛袌?bào)道 ATCC 31565 產(chǎn)生含鼠李糖的代謝產(chǎn)物[8]。對(duì)珍貴酚進(jìn)行酸解反應(yīng)，TLC 分析鑒定所釋放出來(lái)的糖基，證明是 L-鼠李糖（圖3）。

因此，目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)確定為 1-羥 基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯（methyl 1-hydroxy-4-O-rhamnosyl-2-naphthoate，圖2）。考慮到該化合物為珍貴束絲放線菌產(chǎn)生的萘酚類新化合物，所以將其命名為珍貴酚。

圖4 推測(cè)的珍貴酚生物合成途徑 Figure 4 The plausible biosynthetic pathway for pretiphenol

2.3 生物合成途徑推測(cè)

珍貴酚由 1,4-二羥基-2-萘甲酸甲酯和鼠李糖兩部分組成。其中的結(jié)構(gòu)單元 1,4-二羥基-2-萘甲酸是甲萘醌（menaquinone，細(xì)菌細(xì)胞膜成分）生物合成途徑中的一個(gè)中間產(chǎn)物，據(jù)此推測(cè)其生物合成源于分支酸（chorismate）；L-鼠李糖也是細(xì)菌中常見(jiàn)的一種 6-脫氧己糖，其生物合成源于葡萄糖。因此，推測(cè)珍貴酚是 1,4-二羥基-2-萘甲酸和L-鼠李糖的脫水縮合產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)甲酯化形成的（圖4）。通過(guò)對(duì) ATCC 31565 基因組 DNA 序列的生物信息學(xué)分析，確定了負(fù)責(zé) 1,4-二羥基-2-萘甲酸和 L-鼠李糖生物合成的基因，以及可能負(fù)責(zé)催化二者脫水縮合的糖基轉(zhuǎn)移酶。

2.5 珍貴酚的生物活性

經(jīng)珍貴酚處理的 HepG2 細(xì)胞，雖然細(xì)胞中的部分自噬相關(guān)蛋白例如 ATG5 和 ATG7 的表達(dá)水平顯著下降，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活性的作用。

3 討論

經(jīng) SciFinder 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定珍貴酚為新化合物。珍貴酚屬于在 1,4-二羥基-2-萘甲酸骨架基礎(chǔ)上首次發(fā)現(xiàn)的 L-鼠李糖苷化的天然產(chǎn)物。同時(shí)，它也是從珍貴束絲放線菌 ATCC 31565 中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新代謝產(chǎn)物。

已知植物產(chǎn)生 1,4-二羥基-2-萘甲酸的葡萄糖苷化衍生物。例如，從小紅參（Rubia yunnanensis）中分離得到 1-羥基-4-O-葡萄糖-2-萘甲酸及其甲 酯[9]，從胡桃楸（Juglans mandshurica）中分離得到 4,8-二羥基-1-O-葡萄糖-3-萘甲酸乙酯[10]。這些天然產(chǎn)物均與珍貴酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，但未見(jiàn)報(bào)道這些化合物的生物活性。

1,4-二羥基-2-萘甲酸來(lái)自費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii），具有抑制骨重吸收作用[11]；該化合物也是一種感光材料和染料中間體，可通過(guò)化學(xué)合成[12]。1-羥基-2-萘甲酸甲酯具有抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥響應(yīng)作用[13]，珍貴酚與該化合物具有一定的結(jié)構(gòu)相似性（都含有萘酚結(jié)構(gòu)單元），因此本文作者也測(cè)定了珍貴酚對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7 細(xì)胞系）的效應(yīng)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它具有抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥響應(yīng)活性。因此，今后還需要進(jìn)一步探索或研究珍貴酚的生物活性。