激活毒蕈堿乙酰膽堿受體調控下頜下腺分泌的機制研究

叢 馨，閔賽南，吳立玲，蔡志剛，俞光巖△

(1. 北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院，唾液腺疾病研究中心， 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室，北京 100081； 2. 北京大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，北京 100191； 3. 北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院口腔頜面外科，北京 100081)

下頜下腺作為三大唾液腺之一，其所分泌的唾液占靜止性唾液的60%～65%，對維持攝食、味覺、抑制或殺滅病菌、保護口腔軟組織及牙齒等起重要作用。全身性疾病如舍格倫綜合征[又稱干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome, SS)]、IgG4相關性疾病等，以及局部疾病如慢性下頜下腺炎、下頜下腺放射性損傷等，可引起腺體的分泌功能低下，嚴重者不僅有明顯的口腔黏膜干燥，還可繼發(fā)猖獗齲和念珠菌感染等。

2018年一項流行病學研究顯示，唾液低分泌與日本社區(qū)老年男性10年死亡率呈正相關，可作為一個潛在的健康預測指標[1]。全面、深入地認識下頜下腺分泌的調控機制對探索有效的干預措施和防治唾液腺分泌功能低下具有重要的意義。

下頜下腺的分泌受交感和副交感神經共同調控，其中副交感神經纖維通過釋放乙酰膽堿與腺泡細胞上的毒蕈堿乙酰膽堿受體(muscarinic acetylcholine receptor，mAChR)結合，在調控水、離子和小分子物質的分泌中發(fā)揮著重要作用[2]，因此，以mAChR為靶點人工調控下頜下腺的分泌是一個非常有應用前景的研究領域。近些年來，北京大學口腔醫(yī)學院俞光巖教授課題組從mAChR在下頜下腺的表達、功能、調控下頜下腺分泌的分子機制以及失副交感神經支配對腺體分泌的影響等方面進行了一系列的研究，本文就課題組已取得的研究進展做一工作綜述。

1 mAChR在下頜下腺中的表達和功能

mAChR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，包括M1～M5五個亞型[3]。根據(jù)受體結構和生物學效應的不同，人們把mAChR分成兩大類：(1)M1、M3和M5型受體主要與Gq/11蛋白偶聯(lián)，作用于磷脂酰肌醇系統(tǒng)激活磷脂酶C，生成1,4,5-三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)和甘油二酯(diacylglycerol，DAG)，IP3可引起內質網釋放Ca2+，DAG可激活蛋白激酶C；(2)M2和M4型受體主要與Gi蛋白偶聯(lián)，抑制腺苷酸環(huán)化酶，延長K+通道、非選擇性陽離子通道和瞬時感受器電位通道等的開放[4]。

mAChR廣泛分布于中樞及外周神經、心臟、平滑肌和各種腺體中，參與調控呼吸、循環(huán)、運動、體溫調節(jié)和腺體分泌等多種重要生理功能[5]。研究表明，在人、大鼠/小鼠及家兔等不同種屬的下頜下腺中，M1～M5型受體幾乎都有分布，其中M3型受體是表達最豐富的mAChR亞型，主要分布在腺泡細胞和血管內皮細胞上[6-8]。Matsui等[9]在M3型受體基因敲除小鼠上發(fā)現(xiàn)，斷乳后小鼠生長遲緩，腹腔注射mAChR激動劑匹魯卡品(pilocarpine)幾乎不引起刺激性唾液分泌。有研究發(fā)現(xiàn)，M3型受體基因敲除小鼠的唾液分泌量比野生型小鼠減少約90%，并且該敲除小鼠在進食時需不斷飲水以補充唾液的不足，而M1型受體基因敲除小鼠則無該表型[10-11]，這提示M3型受體是參與調控唾液分泌的主要mAChR亞型。

目前，治療重癥干眼癥最有效的手段之一是血管化自體下頜下腺移植術，即將患者的下頜下腺移植到顳部，下頜下腺導管轉移到穹窿部結膜，以下頜下腺分泌液替代淚液[12-13]。然而，移植后的腺體因失去神經支配，其分泌功能發(fā)生明顯改變：術后5 d至3個月內，腺體分泌量明顯減少，進入“休眠期”，易導致導管阻塞，影響手術的成功率；術后6個月起，約40%患者的腺體分泌過多，進入“淚溢期”，嚴重影響生活質量[14-15]。因此，如果能人工調控移植腺體的分泌將有助于全面提高下頜下腺移植治療重癥干眼癥的近、遠期療效。為此，本課題組制備了血管化自體下頜下腺移植的家兔模型，發(fā)現(xiàn)在移植術后的“休眠期”(1～7 d)腺體中，M1和M3型受體的mRNA和蛋白表達降低，經導管逆向給予mAChR激動劑卡巴膽堿可使腺體的分泌量顯著增加，M1和M3型受體表達上調[8]。在家兔下頜下腺移植術后的遠期“淚溢”(30～180 d)腺體中，盡管M1和M3型受體mRNA和蛋白的表達水平與對照組無差異，但參與介導G蛋白偶聯(lián)受體激活后內化脫敏的重要分子β-抑制蛋白2(β-arrestin 2)的蛋白表達顯著降低，提示此時的mAChR可能處于高敏狀態(tài)。進一步在移植術后遠期移植腺體的皮膚表面涂抹mAChR拮抗劑阿托品凝膠可顯著降低腺體的分泌量[16]。此外，我們收集了臨床上行血管化自體下頜下腺移植術后遠期因淚溢進行移植腺體減量切除手術的標本，發(fā)現(xiàn)M1和M3型受體mRNA和蛋白表達均顯著高于對照腺體，而M5型受體的表達未見明顯變化；減量切除標本中IP3的含量高于對照組，且卡巴膽堿刺激引起的細胞內Ca2+反應性更強，提示移植遠期淚溢患者移植腺體的mAChR處于高敏狀態(tài)[17]。

A型肉毒毒素是一種能與膽堿神經元突觸前膜結合從而抑制乙酰膽堿釋放的藥物，我們發(fā)現(xiàn)腺體內注射A型肉毒毒素可減輕家兔移植下頜下腺遠期的唾液分泌增多現(xiàn)象，還能緩解下頜下腺移植術后患者遠期淚溢的發(fā)生。這些結果提示，mAChR，特別是M1和M3型受體在調控下頜下腺移植術后早期低分泌和遠期高分泌中發(fā)揮了重要的作用。我們將基礎研究的結果應用于臨床，提出了一套個性化的術后調控移植下頜下腺分泌的新體系[18-21]，即對于“休眠期”的腺體，由醫(yī)生間斷注射卡巴膽堿起到導管內沖洗的作用，而對于術后遠期季節(jié)性和機會性淚溢者采用阿托品凝膠或A型肉毒毒素局部注射以阻斷mAChR的激活，目前該治療體系已寫進《血管化自體頜下腺移植治療重癥角結膜干燥癥指南》中[22]。

2 激活mAChR促進下頜下腺分泌的分子機制

2.1 調控水通道蛋白介導的跨細胞轉運

唾液的成分以水為主，占99%以上。在腺泡細胞中，水分泌有兩條主要的途徑，即經水通道蛋白直接穿過基底膜和頂膜的跨細胞途徑和經細胞間緊密連接調控的旁細胞途徑[23]。

水通道蛋白5(aquaporin 5，AQP5)是介導唾液腺細胞水的快速跨細胞轉運的重要蛋白。激活mAChR可引起大鼠腮腺中AQP5從細胞漿向頂膜的轉位，同時增加了唾液的分泌。在放射性損傷的唾液腺以及舍格倫綜合征患者活檢的唇腺標本中均可檢測到AQP5的表達量降低和/或分布異常，在糖尿病患者的下頜下腺中AQP5蛋白表達較對照者減少，且在腺泡頂側膜的分布降低[24-26]，這些結果表明，AQP5的分布和含量是決定水的跨細胞轉運的重要因素。

我們在原代培養(yǎng)的乳兔下頜下腺細胞中給予卡巴膽堿刺激可以上調AQP5mRNA的表達，還可增加細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)的磷酸化。只有在非脂筏區(qū)(non-lipid raft)內表達的AQP5才具有水通道的功能，我們對AQP5在人腺泡細胞頂膜上的分布進行了深入探討，發(fā)現(xiàn)卡巴膽堿刺激新鮮的人下頜下腺組織塊可引起AQP5從脂筏區(qū)向非脂筏區(qū)的快速轉位[17]。在家兔自體下頜下腺移植術后早期低分泌的腺體中，AQP5mRNA和蛋白的含量顯著降低，且AQP5由頂膜向細胞漿中彌散分布，而導管逆向給予卡巴膽堿可增加移植腺體AQP5的表達、引起AQP5重新分布在頂膜上，并且增加ERK1/2的磷酸化水平[8]。此外，大鼠下頜下腺腺體內注射A型肉毒毒素可引起AQP5的含量降低和分布異常。在大鼠下頜下腺腺泡細胞系SMG-C6中，A型肉毒毒素可呈時間依賴性地降低AQP5在細胞膜組分上的表達,增加其在細胞漿內的含量[27]。

以上結果提示，mAChR可通過改變AQP5的表達和分布進而調控下頜下腺腺泡細胞的水轉運，而ERK1/2可能是激活mAChR調控AQP5表達和分布的重要細胞內蛋白激酶(圖1A)。

2.2 調控緊密連接蛋白介導的旁細胞轉運

緊密連接(tight junction)是位于相鄰上皮和內皮細胞間連接最頂端的一種特化結構，通過封閉細胞旁間隙發(fā)揮屏障功能。目前已知的構成緊密連接復合物的分子包括跨膜蛋白[如claudin家族(claudin-1～27)、閉合素(occludin)和黏附連接分子家族(junctional adhesion molecules，JAMs)]以及胞漿蛋白[如閉鎖小帶蛋白家族(zonula occluden-1～3、ZO-1～3)]等[28]，其中，同種或異種緊密連接跨膜蛋白的胞外環(huán)相互結合，形成一定大小的孔隙可對透過物質的大小和所帶電荷進行選擇，而胞漿蛋白則作為支架連接跨膜蛋白和細胞骨架蛋白中的纖維狀微絲蛋白(filamentous actin，F(xiàn)-actin)，由此形成一個完整的緊密連接跨膜蛋白-胞漿蛋白-細胞骨架蛋白網狀結構。多種生理性或病理性因素可通過影響緊密連接復合物的表達、分布或結構，進而改變緊密連接的功能[29]。

以往文獻報道，人下頜下腺中存在claudin-1～5、7、11、16、occludin和ZO-1的表達；小鼠胚胎下頜下腺中存在claudin-1、3～8、10～12和ZO-1的表達，但成年小鼠下頜下腺中缺少claudin-6和11的表達；大鼠下頜下腺中存在claudin-1、3、5、occludin和ZO-1的表達[30]。我們在家兔下頜下腺中檢測到claudin-1～5、7、11、16、occludin和ZO-1的表達[31]。此外，由于嚙齒類動物與人的唾液腺差異較大，我們還檢測了小型豬下頜下腺中緊密連接分子的表達和分布特征。小型豬的下頜下腺中存在claudin-1～5、7、11、16、occludin和ZO-1的表達，與人下頜下腺中表達的緊密連接分子一致。免疫熒光染色顯示，小型豬除了腺泡細胞不表達claudin-7外，其余各分子在漿液和黏液腺泡細胞以及導管細胞中均有表達，且分布與人類似，而小鼠下頜下腺中claudin-1和3主要表達在腺泡細胞，claudin-4主要表達在導管細胞，與人有較明顯的差異[32]。提示當采用不同實驗動物進行下頜下腺緊密連接分子的相關研究時，應注意種屬間的差異，小型豬下頜下腺的組織學結構、緊密連接分子的表達特點與人非常接近，是理想的實驗動物之一。

1994年有研究利用新鮮的大鼠下頜下腺組織在激光共聚焦顯微鏡下觀察到卡巴膽堿能夠增加只經旁細胞途徑轉運的熒光示蹤分子——異硫氰熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的右旋糖酐(FITC-dextran)從腺泡基底側向腺泡腔內轉運，提示激活mAChR可增加下頜下腺腺泡細胞的旁細胞途徑的通透性。2009年有研究報道在離體灌流的大鼠下頜下腺上使用冰凍蝕刻技術，發(fā)現(xiàn)卡巴膽堿可破壞腺泡細胞頂側膜上緊密連接分布的連續(xù)性，提示激活mAChR可能通過改變緊密連接的結構影響旁細胞途徑的通透性，從而發(fā)揮促分泌的作用，但是，受mAChR調控的具體緊密連接分子及相關機制尚未見報道。

我們在SMG-C6細胞中發(fā)現(xiàn)，給予卡巴膽堿或選擇性M3型受體激動劑西維美林可降低跨上皮細胞電阻(transepithelial electrical resistance，TER)、增加相對分子質量為4 000的FITC-dextran的透過率，而這一作用可被M3型受體抑制劑4-DAMP所消除，提示激活mAChR主要經由M3型受體增加旁細胞途徑的通透性?？ò湍憠A可選擇性下調claudin-4蛋白的表達、降低細胞膜上claudin-4的含量，但不影響其他緊密連接蛋白(如claudin-1、occludin及ZO-1等)的表達。特異性敲低claudin-4可使卡巴膽堿降低TER值的作用消失，而在過表達claudin-4的細胞中，卡巴膽堿仍可降低TER值并下調claudin-4的表達，表明claudin-4是受mAChR特異性調控的緊密連接靶分子。在機制方面，卡巴膽堿可促進claudin-4絲氨酸位點的磷酸化和ERK1/2的活化，ERK1/2激酶抑制劑可消除卡巴膽堿降低TER值、抑制claudin-4的磷酸化和表達以及誘導claudin-4重分布的作用。點突變實驗進一步顯示，激活mAChR選擇性調控claudin-4第195位絲氨酸的磷酸化，claudin-4被磷酸化后可與β-arrestin 2結合，繼而通過β-arrestin 2的招募引起claudin-4以clathrin依賴的方式發(fā)生內化，內化后的claudin-4在細胞漿中發(fā)生泛素化降解，最終導致claudin-4的表達降低和旁細胞途徑的通透性增加[33]。以上研究從細胞和分子水平揭示了claudin-4在介導mAChR調控下頜下腺旁細胞途徑通透性中的作用，提出了對激活mAChR調控下頜下腺分泌機制的新見解(圖1A)。

此外，在卡巴膽堿灌流的家兔離體下頜下腺以及移植術后遠期淚溢的腺體中均可觀察到與緊密連接結構相連的F-actin發(fā)生了重排，電子顯微鏡下測定相鄰腺泡細胞間緊密連接的寬度顯著增加，而這些現(xiàn)象可被阿托品預處理所阻斷[16]。在人下頜下腺移植遠期因淚溢行減量切除的組織標本中，同樣觀察到F-actin的重排、緊密連接寬度的增加。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，occludin和ZO-1的表達增加，在腺泡細胞頂側膜上的熒光強度增強，但是occludin和ZO-1的相互作用減弱，這與酪蛋白激酶2(casein kinase 2，CK2)的表達增加有關。在離體培養(yǎng)的人正常下頜下腺組織中，卡巴膽堿刺激可降低occludin和ZO-1的相互作用、增加緊密連接的寬度，使用CK2抑制劑預處理可阻斷卡巴膽堿的作用[34-35]。上述這些結果表明，緊密連接表達、結構或功能的改變參與了移植下頜下腺的分泌，以緊密連接為靶點治療下頜下腺異常分泌具有一定的可行性。

2.3 調控血管內皮緊密連接的開放

下頜下腺的血液供應為原始唾液的生成提供了來源。以往研究發(fā)現(xiàn)，激活副交感神經在引起分泌增加的同時，下頜下腺的血流量增加。血管內皮細胞間的緊密連接是決定血管通透性的重要結構，但其在分泌增加時的功能變化尚不清楚。為探討下頜下腺血管內皮緊密連接在調控唾液分泌中的作用及機制，我們建立了活體觀察小鼠下頜下腺旁細胞通透性的方法，發(fā)現(xiàn)非刺激狀態(tài)下的下頜下腺血管內皮細胞對相對分子質量為4 000的FTIC-dextran通透，而對相對分子質量為40 000和70 000的FTIC-dextran不通透；腹腔注射匹魯卡品可增加相對分子質量為4 000和40 000的FITC-dextran從下頜下腺血管內向腺泡基底側的流動，但對相對分子質量為70 000的FITC-dextran無影響。

claudin-5是特異性表達在下頜下腺血管內皮細胞上的緊密連接蛋白，腹腔注射匹魯卡品后，claudin-5發(fā)生從頂側膜向基底側膜以及細胞漿中的重分布，在培養(yǎng)的人正常下頜下腺組織中給予卡巴膽堿刺激以及淚溢患者減量組織標本中也均觀察到claudin-5的重分布。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，與調控緊密連接分布相關的重要信號分子肌球蛋白輕鏈2(myosin light chain 2，MLC2)的磷酸化在匹魯卡品刺激的小鼠下頜下腺以及淚溢患者減量切除組織標本的血管中均增加，受MLC2調控的下游分子F-actin也發(fā)生從靠近頂側膜向細胞漿的重排。這些研究結果提示，下頜下腺血管內皮緊密連接的開放以及claudin-5的重分布參與了激活mAChR引起的促分泌作用，MLC2/F-actin可能是調控下頜下腺血管內皮緊密連接功能的重要信號分子[36](圖1B)。我們后續(xù)的研究還發(fā)現(xiàn)，claudin-5表達和分布的改變可引起血管內皮屏障功能損傷，進而參與了舍格倫綜合征唾液分泌功能降低的發(fā)生[37]，激活mAChR能否通過調控下頜下腺血管內皮claudin-5來干預口干癥的發(fā)生發(fā)展值得進一步研究。

3 失副交感神經支配對下頜下腺分泌的影響

既往研究表明，下頜下腺失副交感神經支配后短期內(4周內)會發(fā)生腺體萎縮和分泌量降低，然而，對下頜下腺失副交感神經支配遠期的變化尚缺乏研究。由于在進行自體血管化下頜下腺移植術時，支配下頜下腺的神經被完全離斷，未與受植區(qū)的任何神經進行吻合，這為我們提供了觀察下頜下腺失副交感神經支配遠期變化的模型。與失神經支配近期的結果不同，在術后3個月和6個月，家兔及大鼠下頜下腺的靜息性唾液分泌均顯著增加，而刺激性唾液分泌顯著低于對照組，提示靜息性分泌的增加并不是由于神經再支配的結果[38]。我們又在與人唾液腺更為接近的小型豬上建立了下頜下腺單純失副交感神經支配的模型，同樣發(fā)現(xiàn)失副交感神經支配后遠期，下頜下腺靜息性唾液分泌增加，且干細胞標志分子SOX2(SRY-related HMG-box 2)等在腺體高表達，提示失副交感神經支配的下頜下腺可自發(fā)性進行修復再生。小型豬失副交感神經支配遠期的腺體中，M3型受體表達水平增加，AQP5，claudin-1、3和4的蛋白表達也顯著上調，提示mAChR及其調控的跨細胞轉運和旁細胞轉運均增強[39]，這為治療下頜下腺分泌異常類疾病提供了新思路。

A, the effect of mAChR activation on transcellular and paracellular transport in acinar epithelial cells of submandibular gland; B, the effect of mAChR activation on the opening of endothelial tight junctions in submandibular gland. mAChR, muscarinic acetylcholine receptor; Pilo, pilocarpine; Cch, carbachol; Cevi, cevimeline; AQP5, aquaporin 5; ERK1/2, extracellular signal-regulated kinase 1/2; βARR2, β-arrestin 2; MLC2, myosin light chain 2; F-actin, filamentous actin.圖1 激活毒蕈堿乙酰膽堿受體對下頜下腺上皮和內皮細胞物質轉運的影響Figure 1 The effect of mAChR activation on material transport in submandibular gland epithelium and endothelium

4 存在問題及今后工作的展望

緊密連接是由多種分子構成的大分子復合物，我們目前只對下頜下腺上皮細胞和血管內皮細胞上的緊密連接分子表達、分布和功能進行了探討，但對同樣存在緊密連接表達的導管上皮細胞尚未關注。由于下頜下腺導管系統(tǒng)對于原始唾液的重吸收和離子成分的調節(jié)作用非常重要，因此緊密連接在導管上皮中的表達種類和具體功能尚需要研究。

據(jù)2012年全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)(GLOBOCAN 2012)顯示，頭頸部鱗狀細胞癌在全身常見惡性腫瘤中位列第7，放療是頭頸部鱗狀細胞癌重要的治療手段之一[40]，而放射損傷造成的唾液腺功能減退是放療最常見的并發(fā)癥之一。有研究表明，患者放療期間口腔干燥癥的發(fā)病率為93.0%，放療后2年以上的發(fā)病率仍高居85.3%[41]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，失副交感神經支配對大鼠和小型豬下頜下腺遠期在靜息狀態(tài)下的分泌均有促進作用，那么該方法是否可以應用于防治放射性損傷造成的腺體分泌功能低下值得嘗試和深入研究。

(志謝：感謝北京大學口腔醫(yī)學院、北京大學基礎醫(yī)學院、首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院參與本課題研究的全體同道的辛勤工作！)