1株雛雞致病性肺炎克雷伯菌分離鑒定與系統(tǒng)進化發(fā)育分析

(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室,河北秦皇島 066604)

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科克雷伯菌屬的一種革蘭陰性桿菌,該菌無鞭毛,無動力,有較厚的莢膜,個別菌株具有菌毛結(jié)構(gòu),主要存在人和多種動物腸道、呼吸道、泌尿生殖道內(nèi),為臨床中典型的人獸共患條件性致病菌[1-2]。肺炎克雷伯菌屬包括肺炎克雷伯肺炎亞種、臭鼻亞種及鼻硬結(jié)亞種3 個亞種,其中肺炎克雷伯肺炎亞種分布最為廣泛,是引發(fā)雞、鴨、山羊、梅花鹿、牛等多種動物及人肺炎、腹瀉、泌尿道、膽道感染、敗血癥和化膿性腦膜炎等嚴(yán)重疾病的病原菌之一[3-4]。當(dāng)雞感染肺炎克雷伯菌后,可以引起雞的傷口感染、肺炎、肝膿腫、眼內(nèi)炎甚至全身敗血癥等,對不同日齡的雞均易感,尤其是雛雞的發(fā)病率與死亡率都較高[5-6]。肺炎克雷伯菌可能對養(yǎng)業(yè)雞具有潛在威脅,應(yīng)引起重視。國內(nèi)關(guān)于雞源肺炎克雷伯菌報道較少。本試驗從發(fā)病致死的雛雞體內(nèi)分離1 株肺炎克雷伯菌,并對該菌的16S rRNA 基因序列進行同源性,致病性檢測及耐藥性分析,為臨床中該菌的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 秦皇島地區(qū)某雞場9 日齡病死的雛雞,無菌采集發(fā)病致死雛雞的肝臟、心血等病料組織。

1.2 主要試劑與儀器MIAC 培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯,購自北京陸橋生物技術(shù)股份有限公司;革蘭染色液試劑盒,購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;藥敏紙片,購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司;ID32E 腸桿科菌鑒定試紙條,購自Bio-Merieuxsa 公司;DL-2 000 Marker,購自北京中生瑞泰科技有限公司;2 ×TaqMarker Mix,購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;7%脫纖綿羊血培養(yǎng)基由本實驗自制;梯度PCR 由儀德國Eppendorf 公司生產(chǎn);隔水式恒溫培養(yǎng)箱,購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;ATB 自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)由法國生物梅里埃股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗動物 健康9 日齡海蘭褐雛雞10 只,購自秦皇島市金牧種雞場。

1.4 細菌分離培養(yǎng)與鑒定 無菌采集病死雛雞肝臟、心血等病料組織劃線接種于7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 -18 h,挑取優(yōu)勢單個菌落接種于MIAC 鑒別培養(yǎng)基上37 ℃恒溫培養(yǎng)12 -18 h。挑取單個菌落落接種于營養(yǎng)肉湯中進行純化培養(yǎng),革蘭染色后在顯微鏡下觀察分離菌株形態(tài)。

1.5 生化試驗鑒定 取純化培養(yǎng)的分離菌調(diào)整菌液濃度為0.5 個麥?zhǔn)蠞岫?按照說明書,將分離菌株接種于ID32E 腸桿科菌鑒定試紙條中,37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)12 -24 h,用ATB 自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)進行生化特性鑒定。

1.6 細菌的16S rRNA PCR 鑒定及測序分析 用水煮法提取分離菌株的基因組DNA,用細菌通用引物16S rRNA 基因序列進行檢測。細菌通用16S rRNA 基因序列引物5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 擴增反應(yīng)體系為50 μL:2 ×TaqMix 25 μL,上、下游引物各2 μL,DNA 模板3 μL,ddH2O 18 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性50 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環(huán),72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠進行檢測分離菌株的目的條帶,將PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定,測序結(jié)果與Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進行對比分析,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,分析其同源性。

1.7 致病性試驗 將10 只9 日齡健康雛雞分為2組,每組5 只,試驗組每只雛雞腹腔注射0.25 mL(108CFU/mL),對照組每只雛雞給予等量的生理鹽水,攻毒12 h 后,觀察7 d,記錄每組的發(fā)病情況和死亡情況。

1.8 藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B 紙片法進行試驗操作和結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng) 分離菌株在7%脫纖綿羊血培養(yǎng)基上長出扁平、圓形、灰白色的半透明菌落(見中插彩版圖1);在鑒別MIAC 培養(yǎng)基上為圓形、光滑、大小一致的桃紅色菌落(見中插彩版圖2);革蘭染色鏡檢為兩端鈍圓粗短桿菌狀的陰性菌(見中插彩版圖3)。

圖1 7%脫纖綿羊血培養(yǎng)基上的菌落

圖2 MIAC 培養(yǎng)基上的菌落

圖3 革蘭染色結(jié)果 (1 000 ×)

2.2 生化鑒定結(jié)果 分離菌株甲基紅試驗、V-P 試驗均呈陽性;不產(chǎn)生H2S;L-阿拉伯醇、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、尿素酶為陰性;不發(fā)酵D-麥芽糖、D-葡萄糖、D-纖維二糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-山梨醇、L-鼠李糖等;用ATB自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定為肺炎克雷伯菌,評定結(jié)果合格率為99.9%。

2.3 細菌的16S rRNA 測序結(jié)果與系統(tǒng)進化樹分析 分離菌株用細菌的16S rRNA 的通用引物,擴增出1 492 bp 的目的條帶(圖4);其測序結(jié)果與GenBank 登錄的肺炎克雷伯菌參考株基因序列同源性在98%～99%之間,從而證實了分離菌株為肺炎克雷伯菌;系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明:分離菌株HB-3 與肺炎克雷伯桿菌參考株KP262416.1 聚于一支,與KJ803938.1 聚于一大支,本試驗分離的肺炎克雷伯菌HB-3 株與肺炎克雷伯菌參考株KP262416.1 和KJ803938.1 存在密切的遺傳進化關(guān)系(圖5)。

2.4 致病性試驗結(jié)果 試驗組雛雞攻毒12 -48 h 后,雛雞死亡2 只,至96 h 雛雞全部死亡。剖檢死亡雛雞,無菌采集發(fā)病致死雛雞的肝臟、心血等病料組織,從中分離到了肺炎克雷伯菌,對照組的雛雞無明顯癥狀。表明了從病死雛雞的體內(nèi)分離到的肺炎克雷伯菌具有很強的致病性。

2.5 藥敏試驗 結(jié)果見表1,分離菌株對頭孢曲松、頭孢克肟、頭孢拉啶、恩諾沙星4 種藥物敏感;對環(huán)丙沙星、新霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、大觀霉素、林可霉素6 種藥物中敏;對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、多粘菌素6 種藥物耐藥。

圖4 分離菌株16S rRNA PCR 擴增結(jié)果

圖5 分離菌株16S rRNA 基因序列進化樹發(fā)育樹

表1 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

肺炎克雷伯菌是一種重要的人獸共患病原菌,該菌在臨床中的感染率僅次于大腸桿菌和綠膿桿菌,廣泛存在于人和動物的腸道、呼吸道和泌尿生殖道及水、土壤等環(huán)境中的一種常見條件性致病菌,呈世界性分布,該菌可以導(dǎo)致動物體內(nèi)的菌群失調(diào),引起不同種類的動物感染發(fā)病,嚴(yán)重者造成死亡[7-8]。本試驗從發(fā)病致死的雛雞體內(nèi)分離到了1 株致病性性肺炎克雷伯菌,該菌的16S rRNA 基因序列與GenBank 登錄的12 株肺炎克雷伯菌參考株同源性在98%～99%之間,與肺炎克雷伯桿菌參考株KP262416.1 聚于一支,與KJ803938.1 聚于一大支,且2 株參考株存在密切的遺傳進化關(guān)系。該菌的遺傳進化是否與其他宿主源及人的肺炎克雷伯菌存在遺傳進化有待進一步研究。賈艷等[9]報道了從病死雞體內(nèi)分離5 株雞源肺炎克雷伯菌,該菌對小鼠具有很強的致病性。金天明[10]報道了從死亡的肉雛雞體內(nèi)分離到肺炎克雷伯菌是致病性肺炎克雷伯菌。當(dāng)外界條件改變時,如飼養(yǎng)密度過大、氣候驟變、衛(wèi)生條件差等應(yīng)激因素存在時,常常引發(fā)該病的暴發(fā)與流行[6]。因此,在雛雞養(yǎng)殖的過程中應(yīng)引起重視,加強飼養(yǎng)管理,減少環(huán)境中的應(yīng)激。

目前,對細菌性疾病主要依靠抗菌藥物進行控制,由于不合理的使用,導(dǎo)致了病原菌對藥物耐藥性的產(chǎn)生與擴散,多重耐藥菌株出現(xiàn)的越來越多,降低了治療效果,其中肺炎克雷伯菌對抗菌藥物產(chǎn)生很強的耐藥性[11]。本試驗藥敏試驗表明,分離菌株對頭孢曲松、頭孢克肟、頭孢拉啶、恩諾沙星4 種藥物敏感;對環(huán)丙沙星、新霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、大觀霉素、林可霉素6 種藥物中敏;對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、多粘菌素6 種藥物耐藥。因此,在養(yǎng)殖過程中,當(dāng)雞發(fā)生肺炎克雷伯菌病時,應(yīng)進行藥敏試驗分析其耐藥性,合理使用藥物,減少耐藥性產(chǎn)生,提高治療療效。