基于青蒿素結(jié)構(gòu)單元的二聚體及其抗耐藥瘧疾活性

楊麗君，解小兵，于志，郭新樂 編寫，馮連順，趙峰 審校

（武漢藥明康德新藥開發(fā)有限公司，武漢 430073）

1 前言

瘧原蟲是一類單細(xì)胞、寄生性生物，可通過受感染蚊子的叮咬傳播，在人體的肝臟中繁殖，然后感染血紅細(xì)胞。其中，惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和諾氏瘧原蟲等五種瘧原蟲可使人類感染瘧疾。惡性瘧原蟲(占非洲發(fā)病率的99.5%以上)和間日瘧原蟲(占美洲發(fā)病率約70%)最為常見，而惡性瘧原蟲(占瘧疾死亡總數(shù)的95%以上)最為致命。目前，瘧疾廣泛流行于熱帶亞熱帶發(fā)展中國家，是危害最嚴(yán)重的傳染性疾病之一，與艾滋病、結(jié)核病被認(rèn)為是全球最重要的三大公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，僅2017年一年，全球共新增2.19億瘧疾病例，43.5萬人因此喪命?？汞懠菜幬飳?duì)瘧疾的防控不可或缺。然而，隨著抗瘧疾藥物的長期、廣泛使用，瘧原蟲對(duì)幾乎所有現(xiàn)有藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。因此，亟需研發(fā)新型尤其是對(duì)耐藥瘧疾有良好療效的抗瘧疾藥物。

青蒿素是從復(fù)合花序植物黃花蒿莖葉中提取的有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯類藥物，青蒿素及其半合成衍生物如二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯具有抗菌、抗腫瘤、抗真菌、抗病毒和抗瘧疾等多種藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素的過氧基團(tuán)可在瘧原蟲體內(nèi)二價(jià)鐵離子的作用下裂解產(chǎn)生各種自由基，所產(chǎn)生的自由基再與瘧原蟲蛋白發(fā)生絡(luò)合形成共價(jià)鍵，最終導(dǎo)致瘧原蟲因瘧原蟲蛋白失去功能而死亡。青蒿素具有起效快、療效高(總治愈率高達(dá)95%)和毒性低等特點(diǎn)，被WHO譽(yù)為“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”。目前，WHO推薦基于青蒿素的聯(lián)合療法(ACTs)作為治療瘧疾包括耐喹啉類藥物瘧疾的標(biāo)準(zhǔn)療法，但青蒿素及其半合成衍生物存在著生物利用度低、溶解性差、復(fù)發(fā)率高和半衰期短等諸多缺點(diǎn)。更為嚴(yán)峻的是，耐青蒿素瘧疾已然出現(xiàn)。由于耐藥性問題，目前WHO已不推薦單獨(dú)使用青蒿素。

與單核化合物相比，二聚體往往具有更高的活性、更低的毒副作用和更為優(yōu)秀的理化性質(zhì)。近年來，藥物化學(xué)家設(shè)計(jì)合成并評(píng)價(jià)了多種基于青蒿素結(jié)構(gòu)單元的二聚體(圖1)的抗瘧疾活性，發(fā)現(xiàn)這類二聚體的活性普遍優(yōu)于相應(yīng)的單核化合物。因此，基于青蒿素結(jié)構(gòu)單元的二聚體在近年來引起了科學(xué)家的普遍關(guān)注。

圖1 各種連接子連接的基于青蒿素結(jié)構(gòu)單元的二聚體

構(gòu)-效關(guān)系(SAR)研究結(jié)果表明，連接子的種類(對(duì)稱或不對(duì)稱的烷基、酯基和醚等)和長度與抗瘧疾活性息息相關(guān)。顯然，合理的優(yōu)化連接子可能會(huì)獲得抗瘧疾活性更高的候選物?；诖?，本文將按連接子分類重點(diǎn)介紹基于青蒿素結(jié)構(gòu)單元的二聚體在抗瘧疾領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，并探討SAR，以啟迪藥物化學(xué)家更合理的設(shè)計(jì)此類化合物。

2 烷基連接的青蒿素二聚體

C-10位異丁酸連接的青蒿素二聚體1a和異煙酸氮氧化物連接的二聚體1b(圖2)對(duì)氯喹敏感型(CQS) NF54惡性瘧原蟲的半最大效應(yīng)濃度(EC50)分別為2.4和0.53nmol/L，優(yōu)于母藥青蒿素(EC50:8.8nmol/L)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，醇、酯和酮衍生物1c～e(EC50:0.87, 2.0和0.91nmol/L; 青蒿素的EC50為9.0nmol/L)也具有極高的體外抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性，且在感染伯氏鼠瘧原蟲的小鼠模型中，含酯二聚體1f,g(口服6mg/kg的二聚體1f,g與18mg/kg的甲氟喹時(shí)可延長小鼠23d壽命, 且寄生蟲血癥在檢測(cè)限以下)和含砜二聚體1h,i(口服給藥54mg/kg時(shí)分別減少99.8%和99.5%寄生蟲血癥)也具有良好的體內(nèi)活性，但磺酸結(jié)構(gòu)片段對(duì)活性不利。向烷基鏈引入羥基也可耐受，如二聚體2a,b(EC50:0.59和3.0nmol/L)也具有良好的體外活性，但繼續(xù)引入芳基、硫醚或砜則對(duì)活性不利。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，醚鍵(2c)對(duì)體內(nèi)活性有利。在感染伯氏鼠瘧原蟲的小鼠模型中，二聚體1a,b(半數(shù)有效劑量/ED50:1.5和0.8mg/kg，口服給藥；4.5和2.0mg/kg，靜脈注射給藥)優(yōu)于青蒿琥酯(口服給藥和靜脈注射給藥的EC50分別為5.5mg/kg和8.0mg/kg)。在感染伯氏鼠瘧原蟲GFP ANKA的小鼠模型中，所有靜脈注射二聚體3a～g(3×30mg/kg)的小鼠均存活30d以上，且寄生蟲血癥在檢測(cè)限以下。當(dāng)單次口服給藥1×30mg/kg時(shí)，所有二聚體3a～g給藥組的小鼠存活期均不次于arterolane馬來酸鹽。在體內(nèi)毒性研究中，腹腔注射單劑量的青蒿素二聚體1a(在給藥劑量為250mg/kg時(shí)未見小鼠死亡，且對(duì)小鼠體重?zé)o影響)的安全性優(yōu)于青蒿琥酯和二聚體1b(在給藥劑量為250mg/kg時(shí)三分之一的小鼠死亡，且小鼠體重有所降低)。二聚體1a,b和青蒿琥酯的治療指數(shù)(最大耐受劑量/ED50)分別為167，156和23，顯然這類二聚體極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

在感染伯氏鼠瘧原蟲ANKA的C57BL/6J雄性小鼠模型中，5個(gè)碳原子相連的青蒿素二聚體4(單次口服6mg/kg的二聚體4與18mg/kg的甲氟喹鹽酸鹽)和5 (單次口服7.1mg/kg的二聚體5與21mg/kg的甲氟喹鹽酸鹽)可抑制＞99.5%的寄生蟲血癥，且未見明顯毒性和小鼠行為的改變，說明這類化合物不僅活性高，而且毒副作用低。

進(jìn)一步研究顯示，在感染伯氏鼠瘧原蟲ANKA的C57BL/6J雄性小鼠模型中，2個(gè)碳原子連接的二聚體6及其衍生物7(單次口服5mg/kg的二聚體6或7與15mg/kg的甲氟喹鹽酸鹽)可快速抑制寄生蟲血癥，且抑制率高達(dá)＞99.9%。二聚體6a的活性與其光學(xué)異構(gòu)體6b相當(dāng)，提示手性中心的構(gòu)型對(duì)活性影響較小。對(duì)二聚體7而言，苯環(huán)間位上的鹵素為高活性所必需，且用甲基代替鹵素將導(dǎo)致活性大幅下降。其中，二聚體6a,b和7a～c具有良好的體內(nèi)活性，其可延長25～30d感染小鼠壽命，優(yōu)于蒿甲醚和甲氟喹鹽酸鹽聯(lián)合給藥(延長20.3d)或單獨(dú)給藥甲氟喹(延長20.3d)。向側(cè)鏈引入碳酸基、硫代碳酸基(8)或羰基、肟基(9)也可耐受，且含硫代碳酸基二聚體(X=S)和含肟基二聚體的活性優(yōu)于相應(yīng)的含碳酸基或羰基(X = O)二聚體。對(duì)二聚體8而言，烷基在R位比芳基更優(yōu)。在感染伯氏鼠瘧原蟲ANKA的C57BL/6J雄性小鼠模型中，與甲氟喹鹽酸鹽組(18mg/kg，存活17.8d)和蒿甲醚與甲氟喹鹽酸鹽聯(lián)合給藥組(6mg/kg蒿甲醚和18mg/kg甲氟喹鹽酸鹽聯(lián)合給藥，存活21.5d)相比，二聚體8a組(6mg/kg二聚體8a和18mg/kg甲氟喹鹽酸鹽聯(lián)合給藥，存活30d)小鼠的存活時(shí)間明顯延長，而二聚體9a,b組(6mg/kg二聚體9a,b和18mg/kg甲氟喹鹽酸鹽聯(lián)合給藥，存活60d)不僅存活期進(jìn)一步延長，而且可完全治愈感染小鼠。值得一提的是，二聚體9b不僅可與甲氟喹鹽酸鹽聯(lián)合使用，與苯芴醇聯(lián)合給藥時(shí)也可完全治愈感染小鼠。顯然，該化合物值得深入研究。

青蒿素二聚體10～12(EC50:0.91～10.5nmol/L)抗耐多藥(MDR) K1惡性瘧原蟲的活性極高，優(yōu)于母藥青蒿素(EC50:11.7nmol/L)。SAR研究結(jié)果表明，連接子與活性息息相關(guān)，且長鏈連接子對(duì)活性有利。對(duì)二聚體10而言，在R位為芳環(huán)的化合物10a,b(EC50:2.1和2.3nmol/L)的活性優(yōu)于相應(yīng)的烷基衍生物(EC50:3.4～5.0nmol/L)。二聚體11b(EC50:0.91nmol/L)的活性略優(yōu)于其差向異構(gòu)體12b(EC50:1.1nmol/L)，提示手性對(duì)活性影響不大。進(jìn)一步研究表明，青蒿素三聚體或四聚體(EC50:2.4～＞20nmol/L)也具有一定的抗MDR K1惡性瘧原蟲活性，但活性弱于二聚體。

3 醚鍵連接的青蒿素二聚體

圖2 烷基連接的青蒿素二聚體1～12的化學(xué)結(jié)構(gòu)

醚鍵連接的二聚體13(圖3，IC50:0.3～31.9nmol/L)抗CQS D6和耐氯喹(CQR)W2惡性瘧原蟲SAR研究結(jié)果表明，兩個(gè)氧原子之間為直鏈或支鏈烷基連接子時(shí)優(yōu)于環(huán)烷基連接子。這類二聚體(半數(shù)毒性濃度/TC50:＞78nmol/L)對(duì)VERO細(xì)胞的毒性較低，SI≥21。其中，二聚體13a,b(IC50:0.3～1.3nmol/L)的抗CQS D6和CQR W2惡性瘧原蟲活性是青蒿素(IC50:9.9和15.9nmol/L)和氯喹(IC50:29.7和744.1nmol/L)的9～53和27～2480倍，SI＞6432。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二聚體13a,b的差向異構(gòu)體14a,b(IC50:3.8～11.2nmol/L)也具有潛在的抗CQS D6和CQR W2惡性瘧原蟲活性。SAR顯示醚結(jié)構(gòu)片段并非高活性所必需結(jié)構(gòu)單元，將氧原子換做氮原子，二聚體仍具有良好的活性?；衔?4c(IC50:3.0和4.2nmol/L)的抗CQS D6和CQR W2惡性瘧原蟲活性是氯喹(IC50:41.6和378.3nmol/L)的13.8和90.0倍，對(duì)VERO細(xì)胞的TC50＞7075nmol/L。顯然，二聚體13a,b和14c可作為先導(dǎo)物進(jìn)一步優(yōu)化。

含有7-氯喹啉藥效團(tuán)的二聚體15(IC50:5.31～205.4nmol/L)也具有潛在的抗CQS D6和CQR Dd2惡性瘧原蟲活性，但抗CQR Dd2惡性瘧原蟲活性均弱于二氫青蒿素(IC50:2.09nmol/L)。SAR顯示連接子的碳鏈長度對(duì)活性有顯著影響，且短鏈連接子優(yōu)于長鏈連接子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用三嗪(16，抗CQS D6和CQR Dd2惡性瘧原蟲的IC50為5.5～35.9nmol/L)代替7-氯喹啉并不能明顯提高活性。代表物15b(IC50:8.70, 5.31和28.43nmol/L)具有優(yōu)秀的抗CQS 3D7, D6和CQR Dd2惡性瘧原蟲活性，活性是氯喹(IC50:20.00, 21.54和157.9nmol/L)的2.2～5.5倍，且抗CQS D6惡性瘧原蟲活性與二氫青蒿素(IC50:5.11nmol/L)相當(dāng)。在感染文氏鼠瘧原蟲的小鼠模型中，二聚體15b(靜脈注射和口服給藥的ED50分別為1.4和20mg/kg)靜脈注射給藥的ED50與青蒿琥酯(靜脈注射和口服給藥的ED50分別為＜1和1.8mg/kg)處于同一水平，但口服給藥ED50遠(yuǎn)遜于青蒿琥酯。作用機(jī)制研究結(jié)果顯示，這類二聚體可能通過其活性代謝產(chǎn)物如單青蒿素-喹啉雜合體或無喹啉結(jié)構(gòu)單元的青蒿素二聚體發(fā)揮抗惡性瘧原蟲活性。

圖3 醚鍵相連的青蒿素二聚體13～20的化學(xué)結(jié)構(gòu)

含有1,2,3-三氮唑的青蒿素二聚體17～19(IC50:＞1μmol/L)的抗CQS 3D7和CQR PKL-2惡性瘧原蟲活性較弱，提示向兩個(gè)青蒿素核之間引入1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)單元對(duì)活性不利。

三氧雜環(huán)己烷二聚體20具有良好的抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性，且IC50在納摩爾級(jí)。SAR顯示，與無取代衍生物相比，向R位引入甲基或芐基對(duì)活性不利。代表物20a(IC50:1.9nmol/L)的抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性是青蒿素(IC50:10nmol/L)的5.2倍，值得進(jìn)一步開發(fā)。

4 酯基連接的青蒿素二聚體

酯基連接的青蒿素二聚體21a,b(圖4, IC50:2.6nmol/L)具有優(yōu)秀的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性，其活性與二氫青蒿素(IC50:2.5nmol/L)相當(dāng)，而是青蒿琥酯和氯喹(IC50:9.0和9.8nmol/L)的4倍左右。SAR顯示，連接子的長度與活性正相關(guān)，如長鏈連接子二聚體21c(IC50:1.4nmol/L)具有最高的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性。向兩個(gè)酯基之間嵌入酰胺仍可保持優(yōu)良的活性，如二聚體22a,b(IC50:0.32和0.30nmol/L)的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性在亞納摩爾級(jí)，且二者的活性約為青蒿琥酯(IC50:0.82nmol/L)的3倍。

磷酸酯連接的青蒿素二聚體23抗惡性瘧原蟲SAR顯示，磷酸酯結(jié)構(gòu)片段對(duì)活性至關(guān)重要，用烷基酯或芳基酯代替磷酸酯將導(dǎo)致活性降低。二聚體23a,b(IC50:0.09～0.5nmol/L)的抗CQS HB3和CQR K1惡性瘧原蟲活性極高，且化合物23a(IC50:0.09和0.2nmol/L)對(duì)所測(cè)惡性瘧原蟲活性是青蒿素(IC50:14.5和12.3nmol/L)和氯喹(IC50:20和190nmol/L)的61.5～950倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素與磷酸酯之間烷基連接子的長度也與活性息息相關(guān)，且2個(gè)碳最優(yōu)，延長或縮短碳鏈均會(huì)導(dǎo)致活性下降。過氧結(jié)構(gòu)片段是高活性所必需結(jié)構(gòu)單元，去除該結(jié)構(gòu)將導(dǎo)致二聚體失活。二聚體23c(IC50:0.04nmol/L)的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性明顯高于其衍生物23a,b(IC50:0.2和0.5nmol/L)，提示磷酸酯比亞磷酸酯對(duì)活性更有利。二聚體23c即使在濃度高達(dá)＞250μmol/L時(shí)對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞仍未顯示出明顯毒性，治療指數(shù)＞6250000。

圖4 酯基連接的青蒿素二聚體21～23的化學(xué)結(jié)構(gòu)

5 其它連接子連接的青蒿素二聚體

含有二茂鐵結(jié)構(gòu)片段的青蒿素二聚體24a(圖5, IC50:7.2nmol/L)的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性略優(yōu)于氯喹(IC50:9.8nmol/L)，但向二茂鐵和青蒿素之間引入烷基鏈(24b, IC50:29.6nmol/L)將導(dǎo)致活性降低。含有碳酸胺結(jié)構(gòu)單元的二聚體25a(ARB-89)及碳酸酯衍生物25b(ARB-92)不僅對(duì)惡性瘧原蟲感染的人血紅細(xì)胞具有良好的活性(IC50≤0.50nmol/L)，二者(給藥劑量3.3mg/kg, 寄生蟲血癥的抑制率分別為＞96%和＞99%)在感染伯氏鼠瘧原蟲的CD1小鼠模型中也顯示出優(yōu)秀的體內(nèi)活性，優(yōu)于青蒿琥酯(給藥劑量3.3mg/kg，寄生蟲血癥的抑制率為94%)。毒性研究結(jié)果表明，二者無明顯毒性。藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，ARB-89清除較快(CL:92.8L/h·kg)、半衰期較短(t1/2:1.2h)、口服生物利用度不高(23.4%)，而ARB-92清除較慢(CL:2.9L/h·kg)且半衰期較長(t1/2:2.3h)。ARB-92的口服生物利用度為34%，高于雙氫青蒿素(19.3%)、蒿甲醚(19.7%)和青蒿琥酯(29.5%)，且ARB-92(Cmax:1457ng/mL)的藥峰濃度是ARB-89(Cmax:40.3ng/mL)的36.2倍。總之，ARB-92具有優(yōu)秀的體內(nèi)外活性和良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，可作為先導(dǎo)物進(jìn)一步研究。

圖5 青蒿素二聚體24～27的化學(xué)結(jié)構(gòu)

含有苯基的青蒿素二聚體如26a,b也具有潛在的抗惡性瘧原蟲活性，且二者(IC50:1.9和1.7nmol/L)的抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性是青蒿素(IC50:7.6nmol/L)的4倍。SAR顯示，用二氟烷基或炔基代替酮將導(dǎo)致活性降低，將對(duì)位苯二酮用間位苯二酮(26c, IC50:1.9nmol/L)替代對(duì)活性影響不大。移除羰基似乎對(duì)活性影響不大，如二聚體27a～c(IC50:1.3, 1.6和0.77nmol/L)也具有良好的抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性。

5 結(jié)束語

青蒿素及其半合成衍生物對(duì)于瘧疾的防控至關(guān)重要，但這類抗瘧疾藥物普遍存在著生物利用度低、溶解性差、復(fù)發(fā)率高和半衰期短等諸多缺點(diǎn)。更為嚴(yán)峻的是，耐青蒿素瘧疾已然出現(xiàn)，使得這類藥物的療效呈逐年下降之勢(shì)。

與單核化合物相比，青蒿素二聚體往往具有更高體內(nèi)外抗瘧疾的活性、更低的毒副作用和更為優(yōu)秀的理化性質(zhì)。SAR顯示，連接子的種類和長度與抗瘧疾活性息息相關(guān)，合理的優(yōu)化連接子可能會(huì)獲得抗瘧疾活性更高的候選物。本文重點(diǎn)介紹了不同連接子連接的的青蒿素二聚體在抗瘧疾領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，并探討SAR，以啟迪藥物化學(xué)家更合理的設(shè)計(jì)此類化合物。