乳酸發(fā)酵第2 階段能量釋放生物學(xué)教學(xué)研究

王 希 洪 鯤，2 趙玉丹 楊瑩艷 龔記熠，2 乙 引，2*

（1 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 貴州貴陽(yáng) 550001 2 貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州貴陽(yáng) 550001）

0 前言

普通高中課程標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)教材， 人教版高中生物學(xué)必修1《分子與細(xì)胞》中關(guān)于乳酸發(fā)酵的概念敘述： 無論是分解成酒精和二氧化碳或者是轉(zhuǎn)化成乳酸， 乳酸發(fā)酵都只有在第1 階段釋放出少量的能量，生成少量ATP［1］。 而能量的形式多樣，可以是勢(shì)能、熱能、化學(xué)能、電能等，這里的“能量”是否特指生物體可直接利用的能量則表述不清晰。這就可能會(huì)使學(xué)生在理解該概念時(shí)進(jìn)入誤區(qū)：乳酸發(fā)酵第2 階段沒有除可供生物體生命活動(dòng)需要的能量之外其他能量的釋放。 從已發(fā)表的文獻(xiàn)研究表明， 乳酸發(fā)酵第2 階段的確沒有ATP 產(chǎn)生，但丙酮酸到乳酸的轉(zhuǎn)化過程要能自發(fā)進(jìn)行，需滿足ΔGθ＜0，釋放能量。

1 乳酸脫氫酶催化下H 的轉(zhuǎn)移

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）主要存在于動(dòng)物的肌肉中，L-乳酸脫氫酶使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）作輔酶（氧化型和還原型分別為NAD+、NADH），可逆催化氧化還原反應(yīng)，使L-乳酸和丙酮酸相互轉(zhuǎn)化［2］。 李璟等［3］研究中發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶催化的反應(yīng)為可逆反應(yīng)，丙酮酸和乳酸既是底物又是產(chǎn)物。 在骨骼肌運(yùn)動(dòng)等缺氧環(huán)境中，催化反應(yīng)向釋放乳酸的方向進(jìn)行。Anderson 等［4］證實(shí)丙酮酸被NADH 還原為乳酸的反應(yīng)過程， 是氫原子H 以氫負(fù)離子（H--hydride anion）以含有2 個(gè)電子的狀態(tài)可逆地轉(zhuǎn)移到丙酮酸的2-C 位上。 侯若冰等［2］采用量子化學(xué)ab initio 計(jì)算方法分析頻率，表明反應(yīng)只含一個(gè)頻率。 這與王鏡巖等［5］編著的《生物化學(xué)教程》 “在340 nm 波長(zhǎng)處還原性NADH 有一個(gè)吸收峰，而氧化型NAD+則無”的相關(guān)表述一致。 侯若冰等［2］通過對(duì)反應(yīng)物復(fù)合物、過渡態(tài)及產(chǎn)物復(fù)合物的能量進(jìn)行精確計(jì)算，驗(yàn)證結(jié)果表明反應(yīng)的過渡態(tài)是H-的轉(zhuǎn)移， 即NAD 的氧化型NAD+是H-的電子接納體，NADH 是還原途徑的電子供體。該反應(yīng)過程如下：NADH?NAD++H-；NADH→2e→NAD+（-0.315 V）。

生物體的代謝中，高能物質(zhì)NADH 被氧化，提供2 個(gè)電子進(jìn)入電子傳遞鏈，同時(shí)釋放H+，而H+在線粒體基質(zhì)中可自由移動(dòng)［6］。

2 H 在復(fù)合體Ⅰ中穿梭

復(fù)合體Ⅰ（complex Ⅰ）或稱NADH-Q 還原酶（NADH-Q reductase）， 含 一 個(gè)FMN 輔 基 黃 素 蛋白，L 形；一個(gè)臂位于線粒體內(nèi)膜上，另一個(gè)壁伸向線粒體基質(zhì)。 有氧呼吸和乳酸發(fā)酵第1 階段都在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中發(fā)生糖酵解反應(yīng)，1 分子葡萄糖釋放2 分子丙酮酸、2 分子NADH。 糖酵解中釋放的NADH 不能透過線粒體膜進(jìn)入線粒體，而細(xì)胞中NAD+含量有限， 有氧條件下，NADH 釋放的電子最終被電子傳遞鏈下游復(fù)合體Ⅳ中的分子氧所接收即氧化磷酸化過程［6］。 電子經(jīng)過電子傳遞鏈時(shí)，途中經(jīng)過多個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體。復(fù)合體Ⅰ只為電子傳遞鏈中的第1 個(gè)復(fù)合體， 只有經(jīng)過復(fù)合體Ⅳ時(shí)電子才能傳遞到O2，勢(shì)能足以轉(zhuǎn)化為ATP。 無氧狀態(tài)下， 糖酵解釋放大量的NADH 發(fā)生堆積，則NAD+被大量消耗，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中NADH／NAD+值遠(yuǎn)大于線粒體基質(zhì)中NADH／NAD+值， 此時(shí)NADH可通過甘油-3-磷酸穿梭途徑和蘋果酸-天冬氨酸穿梭等途徑進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，NADH／NAD+回到正常水平，以維持機(jī)體NADH／NAD+平衡［5］。

因此，無氧條件下電子傳遞鏈中斷，電子不能傳遞到O2，不能產(chǎn)生ATP。

3 無氧條件下的丙酮酸-乳酸發(fā)酵

人的骨骼肌在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)處于無氧狀態(tài)下不能進(jìn)行有氧呼吸， 細(xì)胞利用糖酵解釋放少量ATP暫時(shí)緩解能量不足。 糖酵解釋放的NADH 急需被氧化成NAD+，才能使糖酵解途徑中的甘油醛-3-磷酸繼續(xù)被氧化。丙酮酸被乳酸脫氫酶催化，成為NADH 的氫受體，生成乳酸。 反應(yīng)如下：

4 標(biāo)準(zhǔn)還原勢(shì)計(jì)算乳酸發(fā)酵過程自由能變化

根據(jù)能斯特（Walther Nernst）方程，任何濃度下還原勢(shì)和標(biāo)準(zhǔn)還原勢(shì)的關(guān)系如（a）所示：

R為氣體常數(shù)R=8.315 J／（mol·K），T 為熱力學(xué)溫度，n 為每分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移的電子數(shù)，F(xiàn) 為法拉第常數(shù)F=96480 J／（V·mol），Eθ為標(biāo)準(zhǔn)還原勢(shì)。 在25℃的情況下T=298 K，人體或哺乳動(dòng)物體內(nèi)釋放的生物化學(xué)反應(yīng)都是在pH=7 環(huán)境下,標(biāo)準(zhǔn)還原勢(shì)用E′θ表示，代入（b）中即可計(jì)算出E（25℃、pH=7）。 生物體 內(nèi) 一 些E′θ可 查 詢：丙 酮 酸+2H++2e-→乳 酸 的E1′θ=-0.185 V， 丙 酮 酸/乳 酸 的E1′θ=0.185 V；NAD++H++2e-→NADH 的E2′θ=-0.320 V［5］。

根據(jù)熱力學(xué)第二定律標(biāo)準(zhǔn)自由能變化（standard free energy change）ΔGθ=-nFΔE′θ。 當(dāng)ΔGθ＜0，反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行且釋放能量；ΔGθ＞0 時(shí)， 反應(yīng)不能自發(fā)進(jìn)行。 通過計(jì)算乳酸脫氫酶催化丙酮酸生成乳酸時(shí)ΔGθ的大小， 即可判斷反應(yīng)中的能量變化。 由NAD+／NADH 的氧化還原電對(duì)的E′θ=-0.320 V，丙酮酸／乳酸的氧化還原電對(duì)的E′θ=0.185 V，推導(dǎo)出ΔE′θ=-0.135 V，則ΔGθ=-2×［96.5 kJ／（V·mol）］×（0.135 V）=-26.055 kJ／mol，ΔGθ＜0；而在無氧條件下發(fā)生糖酵解釋放的NADH／NAD+值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài),實(shí)際情況下ΔGθ值更小。 因此，該反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行,反應(yīng)過程釋放一定能量（ΔGθ=-26.055 kJ／mol),在賈金堂等［7］的研究文獻(xiàn)和周海夢(mèng)等［8］譯《生物化學(xué)原理》中也得到證實(shí)，但是該放能反應(yīng)無法驅(qū)動(dòng)ATP 的合成。

5 乳酸發(fā)酵第2 階段ATP 的釋放研究進(jìn)展

通過文獻(xiàn)綜述， 發(fā)現(xiàn)明確指出乳酸發(fā)酵第2階段能釋放能量的較少， 很多研究者較為關(guān)注乳酸發(fā)酵機(jī)理。 例如胡曉輝等［9］研究表明氧氣不足時(shí)植物有氧呼吸受到抑制同時(shí)啟動(dòng)乳酸發(fā)酵，以緩解糖酵解中NAD+的不足。 劉明厚等［10］持相同觀點(diǎn)：馬鈴薯塊莖、甜菜塊根、胡蘿卜葉和玉米胚在進(jìn)行乳酸發(fā)酵時(shí),釋放乳酸。 賈金堂等［7］通過研究氧化還原反應(yīng)中自由能變化提出乳酸發(fā)酵第2階釋放能量。 劉學(xué)廷等［11］通過比較有氧呼吸和乳酸發(fā)酵的異同點(diǎn)，得出乳酸發(fā)酵第2 階段丙酮酸在酶的催化下釋放乳酸，釋放少量能量。 胡四新［12］通過分析無氧狀態(tài)下糖酵解釋放的2 個(gè)NADH 全部參與乳酸發(fā)酵第2 階段反應(yīng)， 提出該過程沒有ATP 的釋放。 靳國(guó)禎等［13］則持相反觀點(diǎn)，乳酸發(fā)酵第2 階段不但沒有ATP 的釋放，同樣沒有能量的釋放。對(duì)此，筆者比較認(rèn)同乳酸發(fā)酵第2 階段沒有ATP 的產(chǎn)生，但NADH 攜帶的化學(xué)能一部分儲(chǔ)存到乳酸分子中，另一部分以熱能等形式釋放。此外，張春暉等［14］在研究蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）時(shí)發(fā)現(xiàn)第2 階段的確沒有底物水平磷酸化發(fā)生，但其后續(xù)研究表明, 一些厭氧細(xì)菌在無氧狀態(tài)下可以通過其他途徑獲得ATP， 該類細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育所需的能量主要源于L-蘋果酸攝入和（或）L-乳酸跨膜流出釋放質(zhì)子電動(dòng)勢(shì)（pmf），pmf 驅(qū)動(dòng)F0F1-ATPase 合成ATP。 這表明，雖然MLF 中沒有直接產(chǎn)生ATP，但通過相關(guān)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)間接產(chǎn)生ATP。

綜 上 所 述， 乳 酸 發(fā) 酵 第 2 階 段 ΔGθ=-26.055 kJ／mol，ΔGθ＜0，釋放一定能量；但不能合成ATP， 反應(yīng)所釋放的能量最終以熱能等形式散失，還是用于其他途徑，沒有在文獻(xiàn)中找到相關(guān)論證，期待有后繼研究。