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    晝夜節(jié)律鐘基因及TTFL 模型的發(fā)現(xiàn)歷程

    2019-06-15 03:34:58任衍鋼白冠軍宋玉奇路彥文
    生物學(xué)通報(bào) 2019年3期
    關(guān)鍵詞:生物鐘果蠅科學(xué)家

    任衍鋼 白冠軍 宋玉奇 路彥文

    (陽(yáng)泉師范高等專(zhuān)科學(xué)校 山西平定 045200)

    生物鐘的研究源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。據(jù)記載,早在公元前4 世紀(jì), 亞歷山大大帝時(shí)期就有一位船長(zhǎng)記錄羅望子樹(shù)葉晝夜開(kāi)合的現(xiàn)象。 首次提到生物節(jié)律具有內(nèi)源性(endogenous)的文獻(xiàn)是在1729 年,法國(guó)天文學(xué)家梅朗(Mairan J.O.)發(fā)現(xiàn)含羞草的羽狀復(fù)葉在完全黑暗的環(huán)境下仍然能保持24h 的開(kāi)合周期, 這表明了生物的晝夜節(jié)律鐘是并不依賴于環(huán) 境 中 的 光 照 等 外 界 環(huán) 境 條 件[1]。 1918 年,希 曼斯基(Szymansid J.S.)發(fā)現(xiàn),沒(méi)有外界光和溫度的變化,動(dòng)物仍然保持24h 的周期活動(dòng)。 20 世紀(jì)50年代前對(duì)生物鐘的研究是零星的、碎片化的,沒(méi)有進(jìn)行概念層次上的探討。 1959 年, 時(shí)間生物學(xué)(chronobiology)創(chuàng)始人哈爾伯格(Halberg F.)首先引入“晝夜節(jié)律鐘(circadian rhythm)”術(shù)語(yǔ)。 circadian 這個(gè)詞來(lái)自拉丁語(yǔ),由circa(大約)和diem(一天)合成,即晝夜的意思[2]。晝夜節(jié)律鐘內(nèi)源性機(jī)制的揭示是從模式生物果蠅開(kāi)始的。

    1 per 基因的發(fā)現(xiàn)及TTFL 模型的提出

    早在1935 年,德國(guó)生物學(xué)家漢斯(Hans K.)和歐文(Erwin B.)首次各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅晝夜節(jié)律的存在。 1954 年,“生物鐘之父”英裔美籍科學(xué)家培騰德瑞(Pittendrigh C.)在觀察野生果蠅活動(dòng)時(shí)發(fā)現(xiàn), 果蠅在發(fā)育期總是在一天中特定的時(shí)間羽化。他通過(guò)觀察果蠅發(fā)育的一系列行為,認(rèn)為生物鐘具有內(nèi)源性且受遺傳物質(zhì)控制, 而不是由外界環(huán)境主導(dǎo)[3]。 正是這些初始的研究啟迪后續(xù)學(xué)者在研究果蠅晝夜節(jié)律方面取得了劃時(shí)代的突破。 果蠅作為模式生物研究的優(yōu)點(diǎn)是: 個(gè)體小、繁殖快、易在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),染色體數(shù)目少,后代數(shù)量大,較容易發(fā)現(xiàn)突變類(lèi)型,這就為發(fā)現(xiàn)控制晝夜節(jié)律鐘的基因提供了有利條件。首先是美國(guó)遺傳 學(xué) 家 康 諾 普 卡(Konopka R.)和 本 澤(Benzer S,康諾普卡是本澤的首位研究生)用甲基磺酸乙酯(EMS)處理黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)誘導(dǎo)其基因組點(diǎn)突變,并在羽化期將其分離出來(lái),然后調(diào)查2 000 只果蠅的晝夜節(jié)律鐘。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這2 000 只果蠅中,大多數(shù)是12 h 活動(dòng),12 h 休息;但有3 種突變體具有異常節(jié)律,一種(perS)是9 h的周期,一種(perL)是8 h 的周期,還有一種(per0)似乎沒(méi)有周期, 活動(dòng)和休息的時(shí)間表現(xiàn)出隨機(jī)交替。他們用傳統(tǒng)的方法繪制出染色體圖,發(fā)現(xiàn)這些晝夜節(jié)律鐘突變型都處于X 染色體相同的位置,距白眼基因小于1 cM 的位點(diǎn)上,屬于等位基因,因與晝夜節(jié)律鐘有關(guān),故命名為period(中文:周期;英文縮寫(xiě)per)基因。 1971 年,他們公布了研究結(jié)果,首次證實(shí)生物鐘基因的存在[4]。這一發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是步入生物鐘研究新時(shí)代的里程碑。

    per 如何為生物鐘定時(shí)?1984 年,霍爾(Hall J.)和羅斯巴什(Rosbash M.)、楊(Young M.)2 個(gè)團(tuán)隊(duì)成功地分離了per 基因。 他們發(fā)現(xiàn),perS和perL都是點(diǎn)突變,導(dǎo)致一個(gè)氨基酸發(fā)生改變(甲基磺酸乙酯的作用機(jī)制是使DNA 上的一個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換,即A—G);per0則引入了一個(gè)終止密碼子,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的翻譯提前終止。 1988 年,霍爾和羅斯巴什發(fā)現(xiàn)per 基因編碼的蛋白質(zhì)——PER 蛋白, 此蛋白呈現(xiàn)出夜間累積而白天降解的晝夜節(jié)律變化。1990 年, 在羅斯巴什實(shí)驗(yàn)室工作的哈?。℉ardin P.E.)等,通過(guò)檢測(cè)果蠅腦內(nèi)的mRNA 發(fā)現(xiàn)per基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 也呈現(xiàn)晝夜變化, 而且per mRNA 峰值出現(xiàn)的時(shí)間要比PER 蛋白峰值出現(xiàn)時(shí)間早幾個(gè)小時(shí)。 他們依據(jù)per mRNA 和PER 蛋白都呈現(xiàn)的節(jié)律性變化,PER 過(guò)表達(dá)會(huì)抑制體內(nèi)per mRNA 的翻譯,并且此抑制作用表現(xiàn)出細(xì)胞負(fù)反饋調(diào)節(jié)[5],提出了果蠅生物鐘的TTFL(Transcription-Translation Feedback Loop, 即轉(zhuǎn)錄–翻譯反饋環(huán)路)模型[1](圖1)。

    圖1 1990 年提出的果蠅晝夜節(jié)律TTFL 模型

    2 per 基因的調(diào)控及TTFL 模型的深化

    PER 蛋白如何進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)起作用? 1992年, 羅斯巴什實(shí)驗(yàn)室利用免疫電鏡技術(shù)對(duì)per 基因的表達(dá)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)PER 蛋白是定位 在 細(xì) 胞 核 內(nèi) 影 響 生 物 節(jié) 律 的[6]。 1994 年,楊 實(shí)驗(yàn)室的普萊斯(Price J.L.)發(fā)現(xiàn),位于果蠅2 號(hào)染色體上的一個(gè)基因也與晝夜節(jié)律鐘有關(guān), 這是繼per 基因后,發(fā)現(xiàn)的第2 個(gè)生物鐘基因——timeless基因(中文:永久;英文縮寫(xiě)tim),其編碼正常晝夜節(jié)律鐘所需的TIM 蛋白。 他們發(fā)現(xiàn),per 基因與tim 基因表達(dá)的時(shí)間基本一致, 并發(fā)現(xiàn)當(dāng)TIM 蛋白結(jié)合PER 蛋白之后,2 種蛋白質(zhì)才能進(jìn)入細(xì)胞核,在那里抑制per 基因的活性,這樣圖1 的模型更清晰(圖2)。

    圖2 基于1994 年發(fā)現(xiàn)的tim 基因而深化的TTFL 示意圖

    這種調(diào)控機(jī)制雖然解釋了細(xì)胞中PER 蛋白質(zhì)水平與晝夜節(jié)律鐘同步的變化, 但蛋白質(zhì)水平變化的頻率如何控制? 1997—1998 年,楊和他在洛克菲勒大學(xué)的團(tuán)隊(duì)在果蠅3 號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)基因——doubletime 基因(中文:雙重時(shí)間或快步;英文縮寫(xiě)dbt)也參與了晝夜節(jié)律鐘的活動(dòng),它所編碼的DBT 蛋白可延緩PER 蛋白的累積。DBT 是一種蛋白激酶,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)對(duì)PER 進(jìn)行磷酸化,使其穩(wěn)定性降低,從而易于與TIM 結(jié)合。 兩者結(jié)為異二聚體后性能穩(wěn)定,進(jìn)入細(xì)胞核[7]。 當(dāng)TIM 被降解后,PER 會(huì)從復(fù)合物中暴露出來(lái),被DBT 磷 酸 化, 促 使PER 蛋 白 在 細(xì) 胞 核 內(nèi) 降 解[8]。這就進(jìn)一步解釋了PER 蛋白的水平變化如何與24 h 周期相匹配(圖3)。

    圖3 基于1997 年發(fā)現(xiàn)的dbt 基因而深化的TTFL 示意圖

    激活per 和tim 基因的起始點(diǎn)是什么?這個(gè)秘密首先是在模式生物小鼠身上揭開(kāi)的。 1994 年,日本出生的美籍神經(jīng)科學(xué)家高橋(Takahashi J.)和他的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),在數(shù)周持續(xù)的光照下,一種失去晝夜節(jié)律鐘的純合突變小鼠會(huì)轉(zhuǎn)錄一種mRNA,翻譯成CLOCK(時(shí)鐘)蛋白,并與另一個(gè)基因DNA鏈結(jié)合,激活per 基因。 1998 年,霍爾和羅斯巴什等通過(guò)遺傳基因篩選, 在果蠅3 號(hào)染色體上也找到了與小鼠clock 基因同源的dClock 基因(中文:鐘,縮寫(xiě)為Clk 或jrk 基因)。 他們發(fā)現(xiàn),dClock 基因突變會(huì)延長(zhǎng)TTFL 環(huán)路的周期, 并且這些突變導(dǎo)致果蠅PER 和TIM 蛋白含量降低,這在果蠅中不僅激活per 基因,而且激活tim 基因[9]。此外,研究人員還在3 號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了一種被稱(chēng)作cycle(中文:循環(huán),縮寫(xiě)為cyc)的基因(與小鼠的bmal基因同源),它翻譯成的蛋白能與CLOCK 蛋白結(jié)合形成二聚體激活per 和tim 基因。

    幸運(yùn)的是另一個(gè)一直困惑科學(xué)家的問(wèn)題也幾乎同時(shí)得到解釋?zhuān)?這就是環(huán)境光強(qiáng)度對(duì)晝夜節(jié)律鐘的影響。 1996 年,塞加爾(Sehgal A.)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)果蠅TIM 蛋白可被光降解, 在光照之后PERTIM 蛋白復(fù)合體的數(shù)量很快地下降。 1997—1998年, 霍爾實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家在對(duì)果蠅的研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),CRY 蛋白(Cryptochrome,亦叫隱花色素,發(fā)現(xiàn)于20 世紀(jì)50 年代,由于含量低,直到1993年科學(xué)家才用遺傳學(xué)克隆的方法在擬南芥中證實(shí))能與PER/TIM 復(fù)合體中的TIM 作用, 促進(jìn)TIM 蛋白的降解,這樣可以防止TIM 蛋白與PER 蛋白結(jié)合抑制tim 和per 基因,從而減少抑制蛋白的數(shù)量[10]。 由此可見(jiàn),DBT 蛋白和CRY 蛋白起到了相反的調(diào)控TIM-PER 異二聚體的作用,隱花色素被認(rèn)為具有起搏器的作用。 這樣也很好地解釋晝夜節(jié)律鐘內(nèi)因與外因的關(guān)系, 即生物鐘在外界環(huán)境影響下如何調(diào)控晝夜節(jié)律鐘的自行運(yùn)轉(zhuǎn)(圖4)。

    圖4 基于1998 年發(fā)現(xiàn)的cyc 和cry 基因而深化的TTFL 示意圖

    在發(fā)現(xiàn)上述果蠅生物鐘反饋調(diào)控的同時(shí),還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)生物鐘反饋環(huán)路, 這是基于一對(duì)等位基因vrille(中文:旋轉(zhuǎn),縮寫(xiě)為vri)的發(fā)現(xiàn)。1997 年, 喬治 (George H) 和泰拉科爾(Terracol R.) 在用甲基磺酸乙酯誘變技術(shù)分析果蠅胚胎發(fā)育時(shí), 發(fā)現(xiàn)有一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子涉及晝夜節(jié)律鐘的活動(dòng)。 1999 年,伯勞(Justin Blau)發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子影響CLK/CYC 復(fù)合體的功能, 這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子就是VRI 蛋白。 這其中還涉及到另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是PDP(Pyruvate dehydrogenase phosphatase 的 縮 寫(xiě),即丙酮酸脫氫酶磷酸酶)。 PDP 對(duì)clk 基因轉(zhuǎn)錄有正向的激活作用, 而VRI 對(duì)dClk 有負(fù)向的抑制作用,當(dāng)然也對(duì)CLK/CYC 復(fù)合體起到抑制作用。 這樣,由于CLK/CYC 的抑制,PER/TIM 降低了CLK/CYC 的抑制作用, 除per-tim 回路外, 還有一個(gè)dClk 回路(這里d 是表示英文果蠅的第1 個(gè)字母)(圖5)。

    圖5 果蠅per-tim 和dCLK 回路簡(jiǎn)圖[11]

    3 果蠅與其他模式生物晝夜節(jié)律鐘研究的相互促進(jìn)

    需要指出的是,TTFL 模型的揭示決不是僅限于對(duì)果蠅的研究, 而是與其他模式生物的研究相互印證的。 哈丁等在1990 年提出的TTFL 模型并沒(méi)有解決是mRNA 翻譯的蛋白質(zhì)直接作用還是通過(guò)其他生化信號(hào)間接影響的問(wèn)題。 1994 年,阿倫森(Aronson B.D.)等通過(guò)對(duì)面包霉(Neurospora crassa)的研究才確定是PER 蛋白能自動(dòng)調(diào)節(jié)自己的轉(zhuǎn)錄[12]。 在晝夜節(jié)律鐘的研究中,除果蠅外,模式生物小鼠的貢獻(xiàn)同樣顯著。 1994 年,科學(xué)家用類(lèi)似研究果蠅節(jié)律基因突變的篩選方法首先描述了小鼠晝夜節(jié)律基因的突變。 1997 年,受此影響突變的基因成為第1 個(gè)被克隆的哺乳動(dòng)物生物鐘基因。隨后,小鼠晝夜節(jié)律基因的研究獲得迅速的進(jìn)展, 這些基因與晝夜節(jié)律基因果蠅基因的相似性(指核苷酸序列)也被鑒定出來(lái)。 科學(xué)家發(fā)現(xiàn),它們之間一些功能是相同的,但亦存在一些差異[13]。例如在小鼠中,CRY 蛋白是與PER 蛋白結(jié)合,形成PER/CRY 復(fù)合體,而不是像果蠅那樣,與TIM蛋白結(jié)合,形成TIM/CRY 復(fù)合體。 故果蠅是間接激活per 基因的轉(zhuǎn)錄, 但在小鼠中則是抑制該基因的表達(dá),兩者作用相反。圖6 是從20 世紀(jì)70 年代始至20 世紀(jì)末果蠅和小鼠在晝夜節(jié)律鐘研究中的比較圖。從圖中可見(jiàn),生物鐘的研究主要體現(xiàn)在表型和生理學(xué)、基因克隆2 個(gè)方面。 在表型、生理學(xué)方面,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了果蠅一系列的突變體、外側(cè)神經(jīng)元起搏點(diǎn)和外部振蕩器; 而在小鼠中則發(fā)現(xiàn)了視交叉上核的中心作用、 獨(dú)立的視網(wǎng)膜時(shí)鐘和外部振蕩器等; 在基因克隆方面則是克隆了一系列的突變基因, 果蠅與小鼠晝夜節(jié)律鐘的基因克隆幾乎都集中在20 世紀(jì)90 年代下半期, 基因克隆技術(shù)的應(yīng)用, 成為了揭開(kāi)生物鐘分子機(jī)制的關(guān)鍵[14](圖6)。

    圖6 1970—2000 年果蠅與哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律基因研究中的重要事件[14]

    表1 是有關(guān)學(xué)者對(duì)小鼠與果蠅中其他涉及到晝夜節(jié)律鐘基因突變的表型作出的相互比較,這也證明了TTFL 模型具有共性。

    表1 果蠅與小鼠晝夜節(jié)律鐘基因突變基因和表型的相互比較[13]

    需要補(bǔ)充的是,進(jìn)入21 世紀(jì)以后,科學(xué)家的興趣逐漸從對(duì)模式生物果蠅晝夜節(jié)律鐘的研究轉(zhuǎn)移到模式生物小鼠上, 主要成果在Bmal 基因研究方面:2000 年,邦杰(Bunger M.K.)通過(guò)第1 個(gè)Bmal1基因敲除發(fā)現(xiàn),BMAL1 蛋白對(duì)節(jié)律維持必不可少;2006 年,孔德拉托夫(Kondratov R.V.)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),Bmal1 基因敲除會(huì)使小鼠生命縮短;2015年,利普頓(Lipton J.O.)發(fā)現(xiàn)BMAL1 蛋白S42 位點(diǎn)被S6k1 周期磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)合成。 此外,2006 年,正 雄(Masao D.)和 平 山(Hirayama J.)在發(fā) 現(xiàn)CLOCK 蛋 白 是 一 種 組 蛋 白 乙 酰 酶[15]。 2008年,阿舍(Asher G.)發(fā)現(xiàn)SIRT1 通過(guò)去乙?;瘏⑴c對(duì)per2 基因的調(diào)控[16]。 可見(jiàn),模式生物小鼠對(duì)TTFL 模型的貢獻(xiàn)并不亞于果蠅。

    綜上所述, 生物鐘研究有利于準(zhǔn)確地揭示生命現(xiàn)象的規(guī)律及內(nèi)在機(jī)制,通過(guò)研究生物鐘,如今已產(chǎn)生了時(shí)辰生物學(xué)、 時(shí)辰藥理學(xué)和時(shí)辰治療學(xué)等新學(xué)科,這不僅在醫(yī)學(xué)上有著重要的意義,而且對(duì)生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究起著巨大的促進(jìn)作用。果蠅晝夜節(jié)律鐘分子機(jī)制及負(fù)反饋機(jī)制的發(fā)現(xiàn),為科學(xué)家研究其他生物和人類(lèi)生物鐘起到了先導(dǎo)作用。TTFL 模型的揭示主要是運(yùn)用了基因克隆技術(shù)和基因與蛋白質(zhì)晝夜間的振蕩表達(dá)的量化分析及各種模式生物之間的相互印證。霍爾、羅斯巴什和楊因發(fā)現(xiàn)控制晝夜節(jié)奏的分子機(jī)制分享了2017 年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 當(dāng)然,生物鐘中還有許多秘密有待進(jìn)一步揭開(kāi), 期待科學(xué)家的下一個(gè)研究成果。

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