一株沙雷氏菌的分離鑒定及其對德國小蠊的毒力測定*

劉九榕 邵博文 周宇石 劉慧敏 闞 碩 薄鵬飛 張 凡**

（1 東營市第一中學(xué) 山東東營 257091 2 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東濟南 250014）

德國小蠊（Blattella germanica）是常見的世界性室內(nèi)衛(wèi)生害蟲之一，能攜帶多種病原微生物，其死亡蟲體和分泌物還是引發(fā)人類哮喘、 鼻炎的重要過敏原［1-2］。 目前，德國小蠊的防治仍以化學(xué)防治為主，但化學(xué)殺蟲劑存在危害人體健康、環(huán)境污染和抗藥性頻發(fā)等諸多問題，相比于化學(xué)防治，生物防治發(fā)展前景更為廣闊， 研究和開發(fā)新型德國小蠊生防制劑迫在眉睫。

粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陰性菌， 在害蟲防治方面具有極大潛力，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于鱗翅目、直翅目、同翅目和鞘翅目昆蟲的防治中［3-6］。 馮書亮等［7］分離得到的粘質(zhì)沙雷氏菌HBZBS21 菌株對黃脛小車蝗（Oedaleus infernalis）有很高的殺蟲毒力，6.2×106CFU/mL 濃度菌懸液4 d 殺滅率可達(dá)80%以上。 粘質(zhì)沙雷氏菌能有效地控制昆蟲種群數(shù)量增長，ps-1 菌株處理過的甜菜夜蛾存活率和產(chǎn)卵率明顯低于對照組， 種群的增長比對照降低了74.4%～100%［8］。

本研究自中華真地鱉蟲尸上分離得到一株粘質(zhì)沙雷氏菌， 并進(jìn)一步評估了該菌株對各齡期德國小蠊的殺蟲效果， 為研究開發(fā)新型德國小蠊生防制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

生物材料： 德國小蠊均來自山東師范大學(xué)動物抗性重點實驗室，未接觸任何化學(xué)和生物藥物，遺傳背景單一；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（28±2）℃，相對濕度（60±5）%，光照時間為12 L∶12 D，采用小鼠全價飼料飼喂，飲水為自來水；粘質(zhì)沙雷氏菌（EB0732）分離自患病死亡的中華真地鱉（Eupolyphaga sinensis Walker）蟲尸，現(xiàn)保藏于山東師范大學(xué)動物抗性重點實驗室。

試劑： 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen公司）；生化反應(yīng)管（青島海博生物技術(shù)有限公司）。

儀器： MLR-351H 型昆蟲培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；YXQ-LS-50S11 型高壓滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；MyGeneTM 系列精品型PCR 儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；Hitachi冷場發(fā)射掃描電鏡Regulus8100（天美中國科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 形態(tài)觀察

菌落形態(tài)觀察： 將分離的菌株接種到LB 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h 后觀察生長情況及菌落特征。

細(xì)胞顯微形態(tài)觀察：掃描電鏡標(biāo)本采用臨界點干燥標(biāo)本，制備方法參照林加涵等［9］。 采用Hitachi RS8100 掃描電鏡在1.0 kV 加速電壓下觀察。

1.3 菌株理化性質(zhì)測定 將分離的菌株接種至LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h 后， 接種至單個生化反應(yīng)管，生理生化實驗結(jié)果參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行比對。

1.4 菌株16S rDNA 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將供試菌株接種至LB 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后， 參照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒步驟提取DNA。 使用細(xì)菌16S rDNA 通用引物（1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）進(jìn)行PCR 擴增。 隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物回收委托華大基因公司測序。運用ClustalW 對所測得的16S rDNA 序列與從GenBank 中通過BLAST 檢索獲得的參考序列進(jìn)行多重對位排比，MEGA5.0 分析對比結(jié)果，運用N-J Tree 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株毒力測定 選取德國小蠊1～3 齡若蟲，4～5 齡若蟲，6～7 齡雌、雄若蟲和雌、雄成蟲各60 只，每組20 只試蟲，設(shè)置3 個平行實驗組，饑餓24 h 供試。 配制5 個濃度（1×105CFU／mL、1×106CFU／mL、1×107CFU／mL、1×108CFU／mL、1×109CFU／mL）的EB0732 菌懸液。 實驗組飼喂2 μL 菌懸液，對照組飼喂2 μL 無菌水，記錄20 d 累計死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察 EB0732 菌株在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，菌落呈紫紅色，光滑、濕潤，表面呈金屬光澤，邊緣整齊或不整齊，有輕微異味（圖1A）。鏡檢結(jié)果可以看出菌體兩端鈍圓，桿狀，無芽孢，邊緣整齊光滑，長0.81～1.56 μm，直徑0.48～0.69 μm（圖1B）。

德國小蠊感染后表現(xiàn)為行動遲緩， 少食甚至不食，糞便呈現(xiàn)紅色。 蟲體死亡后呈暗紅色，逐漸變軟、變成紅色或發(fā)黑，伸直或皺縮，蟲體破壞后有紅色菌膿流出，分離到大量EB0732 菌株，證實德國小蠊因EB0732 菌株感染致死， 正常蟲體與死亡蟲體對比見圖1C。

圖1 EB0732 菌體的形態(tài)及德國小蠊正常與死亡蟲體對比

2.2 菌株鑒定 根據(jù)菌體形態(tài)特征、部分生理生化特征（表1）參考伯杰氏手冊，將EB0732 初步鑒定為沙雷氏菌屬。

表1 EB0732 菌株生理生化指標(biāo)

EB0732 菌株的16S rDNA 序列PCR 擴增片段為1 230 bp，選取質(zhì)量較高的700 bp 片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建， 該片段在GenBank 中的登錄號為MH780739。 根據(jù)序列同源性比對結(jié)果，在NCBI 中選取6 個同源性較高的模式菌， 選取肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae R6）作為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明EB0732 與粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens N2、Serratia marcescens VGH107 和Serratia marcescens LCT-SM166） 形成一個簇群，同源性為100。 結(jié)合生理生化指標(biāo)，將EB0732 菌株鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（圖2）。

圖2 基于16S rDNA 序列粘質(zhì)沙雷氏菌EB0732 的系統(tǒng)發(fā)育樹（N-J Tree）

2.3 菌株的毒力測定 試毒實驗結(jié)果顯示該菌株毒力較強，菌懸液濃度與德國小蠊的死亡率成正相關(guān)，蟲齡與死亡率呈負(fù)相關(guān)，但該菌株對雌、雄蟲的毒力不存在顯著差異（具體結(jié)果可見表2，P＞0.05）。

3 討論

EB0732 菌株侵染德國小蠊后，蟲體呈現(xiàn)相似癥狀， 死亡蟲體中可再次分離獲得該菌株， 證實EB0732 為德國小蠊致病菌株，是潛在的生防菌。

生理生化指標(biāo)結(jié)果常存在偏差， 但運用16S rDNA 序列同源性分析的方法能準(zhǔn)確地將未知菌鑒定到種水平，彌補傳統(tǒng)方法的不足。本研究通過生理生化實驗結(jié)合16S rDNA 序列同源性分析，將病原菌株EB0732 鑒定為腸桿菌科， 沙雷氏菌屬的粘質(zhì)沙雷氏菌。據(jù)報道，粘質(zhì)沙雷氏菌對棉鈴蟲、 菜青蟲和甜菜夜蛾等常見鱗翅目害蟲有較強致病力，田間噴灑菌液24 h 后，昆蟲會出現(xiàn)不同程度的行動遲緩，停食和蟲口明顯減退等現(xiàn)象［10］，但該菌在蜚蠊目中的應(yīng)用尚未有報道，本實驗首次自中華真地鱉蟲尸分離出該菌，并評估了它對德國小蠊的殺滅效果，為德國小蠊的防治提供了新思路。

表2 粘質(zhì)沙雷氏菌EB0732 菌株20 d 累積死亡率（%）

毒力測定顯示EB0732 菌株對德國小蠊有較強毒力，1×109CFU/mL 的EB0732 菌株作用于1～3齡德國小蠊若蟲時，20 d 累計殺滅率達(dá)87.50%。該菌株對于不同蟲齡的德國小蠊毒力差異顯著，死亡率隨蟲齡增長遞減。一方面，這可能與若蟲存在蛻皮期有關(guān)，在宿主昆蟲若蟲蛻皮期，腸管壁較薄弱，昆蟲病原菌更易侵入昆蟲血腔，引起昆蟲患敗血癥死亡；另一方面，不同發(fā)育階段雖具有相似的免疫基因組成， 但蟲齡小的昆蟲免疫基因的表達(dá)不完善，如微粒體多功能氧化酶（MFO）、細(xì)胞色素P450 氧化酶、乙酰膽堿酯酶和酚氧化酶等解毒酶的選擇性表達(dá)［11-12］，這暗示了該菌株用以防治德國小蠊的最佳時期為若蟲期。 此外，總體來看，該菌株對雌、雄蟲的毒力沒有顯著性差異，但雄性略高于雌性，這可能與雌性體重更大，免疫防御機制更完善有關(guān)［12-13］。

粘質(zhì)沙雷氏菌可通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、 磷脂酶、靈菌紅素等次級代謝產(chǎn)物，水解昆蟲幼蟲體表和圍食膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道微絨毛變形甚至脫落，影響昆蟲腸道對病原微生物的抵御和營養(yǎng)攝取等正常生命活動［14-16］。經(jīng)初步試驗發(fā)現(xiàn)，該沙雷氏菌株單劑毒力相對較弱， 下一步可采用該菌株與化學(xué)殺蟲劑、病原真菌等科學(xué)復(fù)配以增強其生防效果。 各組分殺蟲機理和作用方式均不相同， 可從破壞蟲體免疫、神經(jīng)系統(tǒng)以及營養(yǎng)消耗等多方面產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而加速蟲體的死亡，產(chǎn)生更好的殺滅效果。