嚴氏溫陽化瘀利水方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能及腎臟水通道蛋白2表達的影響研究

俞瑞群，喬亮，吳鳳珠，張家美

心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，《中國心血管病報告2016》指出我國心力衰竭患病率約為0.9%［1］，China-HF研究［2］顯示我國住院心力衰竭患者病死率約為4.1%。心力衰竭具有發(fā)病率高、病死率高等特點，已成為威脅我國居民健康的常見病、多發(fā)病。中醫(yī)學理論認為，心力衰竭屬“心悸”“水腫”“胸痹”等范疇，多因外邪反復侵襲、勞累過度、臟腑功能失司導致心氣、心陽不足。嚴氏溫陽化瘀利水方是全國名中醫(yī)嚴世蕓教授研制的心力衰竭經驗方，其治療心力衰竭療效確切［3］，但具體作用機制尚未完全明確。本研究旨在探討嚴氏溫陽化瘀利水方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能及腎臟水通道蛋白2（AQP2）表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2018年6—9月完成實驗。選取14周齡SPF級SD大鼠60只，平均體質量（200±20）g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物合格證號：SCXK（滬2013-0016）。60只大鼠均在上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級適應性飼養(yǎng)1周，人工光照、陰暗各12 h，濕度40%左右。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

1.2.1 主要藥物 嚴氏溫陽化瘀利水方，方劑組成：附子12 g、黃芪30 g、桃仁12 g、川芎10 g、紅花6 g、豬苓12 g、茯苓12 g、白術15 g、白芍15 g、桂枝12 g、地龍12 g、澤瀉12 g、車前子18 g、當歸12 g；坎地沙坦酯片（天津武田藥業(yè)有限公司生產）。

1.2.2 主要試劑 氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、SYBR Green聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司生產），逆轉錄試劑盒（Fermentas公司生產）。

1.2.3 主要儀器 小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司生產），心電圖機（上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司生產），Vevo 707超聲儀（加拿大Visualsonics公司生產），低溫冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司生產），電泳儀（Bio-Rad Laboratories生產，型號：Mini Protean 3 Cell）、Realtime檢測儀（美國應用生物系統公司生產），電動勻漿機（上海FLUKO機械制造有限公司生產），吉爾森P型移液槍（上海艾研生物科技有限公司生產），芬蘭雷勃MK3酶標儀〔通派（上海）生物科技有限公司〕，水浴鍋（萊卡公司生產，型號：HI1210），旋渦振蕩器（青浦瀘西儀器廠生產），電轉儀（大連競邁科技有限公司生產，型號：PS-9）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 將60只大鼠隨機分為A組（制備模型，n=45）和B組（假手術，n=15），之后將心肌梗死后心力衰竭制備成功的28只大鼠隨機分為A1組（n=9）、A2組（n=10）、A3組（n=9）。A2組大鼠給予坎地沙坦酯片1 mg/kg+蒸餾水2 ml灌胃，1次/d；A3組大鼠給予嚴氏溫陽化瘀利水方常規(guī)煎煮后按照人體劑量6.3倍換算后濃縮灌胃，給藥體積2 ml，1次/d；B組和A1組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，1次/d。4組大鼠均連續(xù)灌胃8周。人和大鼠按體表面積折算后的等效劑量比值為0.018。

1.3.2 模型制備 A組大鼠采用冠狀動脈結扎法制備心肌梗死后心力衰竭模型［4］，具體方法如下：給予2.5%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉大鼠后，仰臥并固定在手術臺，行氣管插管，連接小動物呼吸機行正壓通氣，監(jiān)測大鼠心電圖。沿胸骨左側第3～4肋間切開，擴胸器擴開大鼠胸腔，充分暴露心臟，打開心包，在右心室流出道與左心房之間距主動脈根部2～3 mm處用6-0絲線穿過左冠狀動脈主干，連同一小束心肌纖維一起結扎。縫線下方心肌顏色變淺、蒼白，結扎即刻心電圖檢查顯示兩個及以上導聯ST段呈弓背向上抬高＞0.2 mV并持續(xù)＞30 min認為心肌梗死模型制備成功，術后腹腔注射青霉素抗感染治療。心肌梗死模型制備成功后4周行超聲心動圖檢查，若左心室射血分數（1eft ventricular ejection fraction，LVEF）≤45%為心力衰竭模型制備成功。模型制備不成功大鼠棄之不用。B組大鼠在左冠狀動脈前降支相同部位穿線但不結扎。

1.4 標本采集 灌胃8周后，取材前所有大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g麻醉大鼠，采用5 ml促凝管收集腹主動脈血，3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），留取上清液并置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測血漿NT-proBNP水平。腹部正中切口，切開皮膚、肌肉、筋膜、腹膜，將腎組織周圍內臟推向兩側，迅速取腎臟近髓組織并置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測腎髓質AQP2及其mRNA。

1.5 觀察指標

1.5.1 超聲心動圖 4組大鼠麻醉后均仰臥固定于操作臺，胸前區(qū)備皮，采用小動物超聲儀（探頭頻率14MHz）沿胸骨旁左心長軸切面測量左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD），采用Teichholtz公式計算LVEF、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS），檢測3個心動周期取平均值。

1.5.2 血漿NT-proBNP水平 采用ELISA檢測4組大鼠血漿NT-proBNP水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.3 腎髓質AQP2 采用蛋白印記法檢測4組大鼠腎髓質AQP2表達，具體如下：在腎髓質組織中加入裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書檢測蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳，再轉膜至PVDF膜上并封閉，AQP2以1:500稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，4 ℃孵育24 h，以TBST洗膜，加入1:1 000稀釋HRP標記的二抗，37 ℃孵育1 h，采用增強化學發(fā)光法檢測AQP2相對表達量。

1.5.4 腎髓質AQP2 mRNA 采用實時熒光定量PCR檢測腎髓質AQP2 mRNA表達，具體如下：嚴格按照Trizol試劑盒說明書提取腎髓質組織中總RNA，將總RNA中DNA消除后以反轉錄法合成cDNA第一條鏈，再進行實時PCR擴增，采用ABI Prism 7300 SDS Software軟件分析腎髓質AQP2 mRNA相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 超聲心動圖檢查結果及血漿NT-proBNP水平 灌胃8周后，4組大鼠LVEDD、LVEF比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。4組大鼠LVESD、LVFS及血漿NT-proBNP水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組、A2組、A3組大鼠LVESD短于A1組，LVFS高于A1組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A1組、A2組、A3組大鼠血漿NT-proBNP水平高于B組，A2組、A3組大鼠血漿NT-proBNP水平低于A1組，A3組大鼠血漿NT-proBNP水平高于A2組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 4組大鼠灌胃8周后超聲心動圖檢查結果及血漿NT-proBNP水平比較（±s）Table 1 Comparison of echocardiographic findings and plasma NT-proBNP level after 8 weeks of intervention in the four groups

注：LVEDD=左心室舒張末期內徑，LVESD=左心室收縮末期內徑，LVEF=左心室射血分數，LVFS=左心室短軸縮短率，NT-proBNP=氨基末端腦鈉肽前體；與B組比較，aP＜0.05；與A1組比較，bP＜0.05；與A2組比較，cP＜0.05

組別 只數LVEDD（mm）LVESD（mm）LVEF（%）LVFS（%）NT-proBNP（pg/ml）B組 10 7.7±1.2 4.6±0.8b59.3±9.1 39.7±4.2b 127.6±7.3 A1組 9 9.0±1.0 6.7±1.3 46.5±11.8 24.7±7.1 284.4±5.6a A2組 10 8.0±0.8 5.1±0.9b55.0±11.1 37.4±6.4b158.2±13.4ab A3組 9 8.1±1.0 5.5±1.2b53.7±12.4 32.3±8.3b242.2±13.9abc F值 2.85 6.99 2.15 8.96 156.43 P值 0.05 ＜0.01 0.11 ＜0.01 ＜0.01

2.2 腎髓質AQP2、AQP2 mRNA相對表達量 灌胃8周后，4組大鼠腎髓質AQP2、AQP2 mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；A1組、A2組、A3組大鼠AQP2、AQP2 mRNA相對表達量高于B組，A3組大鼠AQP2、AQP2 mRNA相對表達量低于A1組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 4組大鼠灌胃8周后腎髓質AQP2、AQP2 mRNA相對表達量比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of AQP2 and mRNA after 8 weeks of intervention in the four groups

表2 4組大鼠灌胃8周后腎髓質AQP2、AQP2 mRNA相對表達量比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of AQP2 and mRNA after 8 weeks of intervention in the four groups

注：AQP2=水通道蛋白2；與B組比較，aP＜0.05；與A1組比較，bP＜0.05

組別 例數 AQP2 AQP2 mRNA B組 10 2 129.63±1 129.34 0.04±0.04 A1組 9 10 502.71±2 255.90a 0.41±0.12a A2組 10 8 827.67±3 274.54a 0.35±0.11a A3組 9 7 191.62±1 733.23ab 0.28±0.06ab F值 15.66 18.86 P值 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

心力衰竭是心臟收縮功能和/或舒張功能障礙導致靜脈系統血液淤積、動脈系統血液灌注不足引發(fā)的心臟循環(huán)障礙癥候群，是臨床常見心臟病。中醫(yī)學理論認為，心力衰竭其標在心，其本在腎，故其主要治療原則為溫腎陽、益心氣。嚴氏溫陽化瘀利水方是全國名中醫(yī)嚴世蕓教授研制的心力衰竭經驗方，方中附子溫陽化氣以治心氣虛乏、心陽式微之本，為君藥；黃芪、白術益氣利水，地龍、桃仁、紅花、川芎、白芍活血通絡，桂枝瀉肺利水，主要治療氣陽虛乏、絡脈瘀阻、水濕停聚，共為臣藥；豬苓、澤瀉、車前子利水消腫，當歸補血養(yǎng)心陰以防利水傷正，皆為佐藥；全方由真武湯、五苓散和補陽還五湯加減而得，標本兼治，補瀉兼施，兼顧氣血陰陽?？驳厣程篂檠芫o張素Ⅱ AT1受體拮抗劑，其通過與血管平滑肌AT1受體結合而拮抗血管緊張素Ⅱ的血管收縮作用，從而降低末梢血管阻力。既往研究表明，坎地沙坦能有效促進心力衰竭患者心功能恢復，提高患者預后，是輔助治療心力衰竭的較為理想藥物［5］。

LVESD和LVFS可反映左心室收縮功能。腦鈉肽（brain natriuretic neptide，BNP）是鈉尿肽家族成員，心力衰竭時心室壁張力增加可刺激心肌細胞分泌BNP。既往研究表明，血漿BNP水平與心力衰竭嚴重程度呈正相關［6］。NT-proBNP是BNP在蛋白酶作用下的裂解產物，其t1/2較BNP長［7］。既往研究表明，NT-proBNP可用于評估心力衰竭嚴重程度及患者預后［8］。本研究結果顯示，灌胃8周后，B組、A2組、A3組大鼠LVESD短于A1組，LVFS高于A1組；A1組、A2組、A3組大鼠血漿NT-proBNP水平高于B組，A2組、A3組大鼠血漿NT-proBNP水平低于A1組，A3組大鼠血漿NT-proBNP水平高于A2組，提示嚴氏溫陽化瘀利水方與坎地沙坦均能有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠左心室收縮功能，但嚴氏溫陽化瘀利水方較坎地沙坦對心力衰竭嚴重程度的改善效果略差。分析嚴氏溫陽化瘀利水方改善心肌梗死后心力衰竭大鼠左心室收縮功能及減輕心力衰竭嚴重程度的原因主要如下：嚴氏溫陽化瘀利水方中附子主要成分烏頭堿、川烏堿甲、去甲基烏藥堿等具有強心、抗心律失常、提高免疫力等作用［9-11］；黃芪補氣升陽、利水消腫，黃芪皂苷具有明顯強心及保護心肌缺血-再灌注損傷等作用［12］。

水通道蛋白（AQP）是1988年由PETER AGRE教授發(fā)現的存在于細胞膜上具有水通透性的蛋白質，其可參與多種器官組織液體轉運的病理生理過程［13］。AQP2表達在腎臟集合管主細胞管腔側膜和胞質囊泡內，且具有調節(jié)腎臟水重吸收作用［14］。既往研究表明，慢性心力衰竭患者腎臟AQP2基因表達增加［15］，且AQP2過表達在慢性心力衰竭患者水潴留過程中發(fā)揮著重要作用［7］。動物實驗證實，茯苓可增加正常大鼠尿量，減少其尿液中AQP2水平及腎髓質中AQP2 mRNA表達［16］；黃芪可降低肝硬化大鼠腎皮髓質AQP2 mRNA表達［17］。本研究結果顯示，灌胃8周后，A1組、A2組、A3組大鼠AQP2、AQP2 mRNA相對表達量高于B組，A3組大鼠AQP2、AQP2 mRNA相對表達量低于A1組，提示嚴氏溫陽化瘀利水方與坎地沙坦均能有效下調心肌梗死后心力衰竭大鼠AQP2表達。分析嚴氏溫陽化瘀利水方下調心肌梗死后心力衰竭大鼠AQP2表達主要與嚴氏溫陽化瘀利水方中茯苓、黃芪具有利水作用有關。

綜上所述，嚴氏溫陽化瘀利水方能有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠左心室收縮功能，下調腎臟AQP2表達，與坎地沙坦治療效果相似；但其較坎地沙坦對心力衰竭嚴重程度的改善效果略差。

作者貢獻：俞瑞群進行文章的構思與設計，進行結果分析與解釋，負責撰寫論文；張家美進行研究的實施與可行性分析，對文章整體負責，監(jiān)督管理；吳鳳珠進行數據收集、整理、分析；喬亮進行論文的修訂，負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。