遺傳性耳聾易感基因及新生兒聽力聯(lián)合篩查的結(jié)果分析

謝文光 關(guān)建宏 司徒尤發(fā) 梁偉敏

廣東省陽江市婦幼保健院，廣東陽江 529500

耳聾是由環(huán)境和遺傳因素引起的常見疾病之一[1]，我國(guó)新生兒聽力損害的發(fā)生率較高，其中由遺傳因素導(dǎo)致的耳聾患者達(dá)到60%以上[2]。新生兒早期聽力的喪失會(huì)影響到聽覺神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，因此早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)警是獲得最佳治療和康復(fù)的關(guān)鍵。盡管聽力篩查已得到普及，但由于遲發(fā)性耳聾患者和一些癥狀較輕的聽力損失者在出生數(shù)月或數(shù)年才表現(xiàn)為耳聾，往往會(huì)出現(xiàn)漏診現(xiàn)象[3]。遺傳性耳聾易感基因檢測(cè)可彌補(bǔ)聽力篩查的不足，在一定程度上可以降低耳聾高?；純旱某錾?。本院對(duì)新生兒進(jìn)行聽力篩查，同時(shí)對(duì)常見的耳聾易感基因進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行匯總和分析，以了解本院新生兒遺傳性耳聾易感基因攜帶情況及致病基因，并對(duì)患兒家屬進(jìn)行遺傳指導(dǎo)，預(yù)防或減少聽障患兒的出生。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月～2018年6月在本院出生的3068例新生兒作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）新生兒家屬同意參加本次研究；（2）均為在我院出生新生兒；（3）無先天性疾病的新生兒。其中男嬰1610例，女嬰1458例，男女比例為1.1∶1，胎齡1～3d，平均（2.0±0.3）d。

1.2 方法

1.2.1 聽力篩查 采用GSI耳聲發(fā)射儀對(duì)出生2～3d的新生兒進(jìn)行聽力初篩。聽力初篩未通過者，在出生42d后采用篩查型DPOAE或自動(dòng)聽性腦干反應(yīng)復(fù)篩；復(fù)篩仍未通過者，應(yīng)用聲導(dǎo)抗、聽性腦干反應(yīng)、多頻穩(wěn)態(tài)反應(yīng)進(jìn)行聽力學(xué)評(píng)估。

1.2.2 基因篩查的血樣收集 家屬簽訂知情同意書并填寫了新生兒基本信息表后，采集新生兒出生72h之后的足跟血。斜針法進(jìn)針，先要按摩或熱敷嬰兒足跟，使其充血，酒精消毒后用一次性采血針穿刺，棄去第一滴血后將擠出的血液滴在特定的濾紙上，使其充分滲透至濾紙背面。要求每個(gè)嬰兒采集3個(gè)血斑，每個(gè)血斑的直徑應(yīng)≥10mm。待血片晾干后，和新生兒基本信息卡片一起裝入封口袋中，由專人送至本院檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測(cè)，全程采取冷鏈轉(zhuǎn)運(yùn)及保存，以免血片因?yàn)楦邷囟l(fā)生變質(zhì)。

1.2.3 基因篩查方法 本實(shí)驗(yàn)采用凱普生物公司自主研發(fā)的耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法）來檢測(cè)遺傳性耳聾相關(guān)基因GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA這4個(gè)基因中的13個(gè)突變位點(diǎn)。

1.2.3.1 低密度基因芯片檢測(cè) （1）PCR擴(kuò)增。在模板加樣區(qū)內(nèi)，向?qū)?yīng)的A、B系列試劑中分別加入2μL同一樣本核酸溶液，反應(yīng)體系均為20μL；將離心管或八聯(lián)管置于PCR擴(kuò)增儀中，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，時(shí)間為2h。（2）導(dǎo)流雜交與結(jié)果判讀。將上述PCR反應(yīng)液中的模板DNA加熱解鏈，然后按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行導(dǎo)流雜交與判讀，總反應(yīng)時(shí)間約為1h。

1.2.3.2 測(cè)序驗(yàn)證 對(duì)較為嚴(yán)重的純合突變或均質(zhì)突變樣本寄送至廣州凱普醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。共擴(kuò)增8個(gè)片段以覆蓋耳聾易感基因的13個(gè)突變位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：在20μL的反應(yīng)體系（所有引物的擴(kuò)增體系均相同）中加入40ng的基因組DNA，10×Buffer（含MgCl225mmol/L） 緩沖液 2μL，10×dNTP（4 mmol/L）2μL，引物（2μmol/L）各 1μL，加 Taq酶（羅氏，2.5U/μL）0.5μL。PCR反應(yīng)在 2700熱循環(huán)儀上完成。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃復(fù)性 30s，72℃延伸 30s（反應(yīng) 30 個(gè)循環(huán)），反應(yīng)終止后72℃再延伸7min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行Sanger測(cè)序，然后在ABI3500 AvantGenetic Analyzer測(cè)序儀（ABI，美國(guó)）上完成序列分析，測(cè)序結(jié)果通過BioEdit軟件與參考序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）分析3068例新生兒聽力篩查結(jié)果；（2）分析3068例新生兒遺傳性耳聾易感基因篩查結(jié)果；（3）對(duì)3068例新生兒聽力篩查與基因檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較；（4）分析3068例新生兒基因突變的分布情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聽力篩查及聽力學(xué)評(píng)估結(jié)果

3068例新生兒中，聽力初篩未通過317例，初篩未通過率10.33%，其中男嬰174例，初篩未通過率10.81%；女嬰143例，占未通過總數(shù)的9.81%。經(jīng)聽力復(fù)篩、聽力學(xué)評(píng)估最終確診聽力損失15例，其中男嬰8例，女嬰7例。男女嬰之間聽力初篩未通過率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.825，P＞0.05）。見表1。

表1 3068例新生兒聽力篩查結(jié)果（例）

2.2 遺傳性耳聾易感基因篩查結(jié)果

3068例新生兒中，檢出耳聾基因突變132例，陽性率4.30%，其中男嬰76例，陽性率為4.72%，女嬰56例，陽性率為3.70%，男女嬰之間陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.437，P＞0.05）。見表2。

2.3 聽力初篩及易感基因聯(lián)合篩查結(jié)果分析

3068例新生兒通過聽力篩查和聾病易感基因檢測(cè)，共篩出突變/聽力損失445例，總陽性率為14.50%，明顯高于單純通過聽力篩查發(fā)現(xiàn)的聽力損失發(fā)生率10.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.938，P＜ 0.05）。見表3。

表2 3068例新生兒遺傳性耳聾易感基因篩查結(jié)果

表3 3068例新生兒聽力篩查與基因檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 耳聾基因突變的分布

3068例新生兒中，耳聾易感基因變異132例，陽性率43.02‰，其中GJB2突變79例，陽性率25.75‰；GJB3突變12例，陽性率3.91‰；SLC26A4突變38例，陽性率12.39‰，線粒體12SrRNA突變3例，陽性率1.10‰。見表4。

表4 3068例新生兒基因突變的分布

3 討論

耳聾是由遺傳和多種環(huán)境因素導(dǎo)致的常見感覺性疾病，其中由遺傳因素所致耳聾約占50%～60%[1，4]。盡管新生兒聽力篩查已經(jīng)普及，并在先天性耳聾患者的早期診斷、發(fā)現(xiàn)與干預(yù)過程中發(fā)揮著重要作用，但單純的聽力篩查并不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)遲發(fā)型耳聾等出生時(shí)未出現(xiàn)聽力下降的新生兒[5]。遺傳性耳聾易感基因檢測(cè)有助于發(fā)現(xiàn)遺傳性耳聾高危人群，從而實(shí)施有效的干預(yù)和預(yù)防。在本研究中，通過對(duì)3068例新生兒進(jìn)行聽力篩查和聾病易感基因檢測(cè)，篩查出聽力初篩不通過和基因突變者445例，總陽性率為14.44%，較單純聽力篩查的檢出率高，說明聽力篩查和基因檢測(cè)的聯(lián)合使用能夠提高耳聾疾病的檢出率。

目前，已克隆的與耳聾相關(guān)的基因有很多，包括常染色體隱性基因、常染色體顯性基因和線粒體基因[6]。很大部分的遺傳性耳聾是由單一基因突變引起[7]，且耳聾易感基因的變異具有地域差異[8]。GJB2[9]、SLC26A4[10]和線粒體12S rRNA基因[11]是最常見的遺傳性耳聾易感基因。GJB2是導(dǎo)致遺傳性非綜合征型耳聾最常見的基因，約有20%的先天性耳聾患者與該基因相關(guān)[12]。GJB2基因中235位點(diǎn)C堿基純合性缺失，會(huì)導(dǎo)致移碼突變，造成感音神經(jīng)性耳聾[13]。SLC26A4基因編碼的Pendrin蛋白能夠介導(dǎo)氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，與大前庭水管綜合癥有關(guān)。Pendrin蛋白的異常可引起前庭水管及耳蝸結(jié)構(gòu)改變。線粒體DNA（mtDNA）12S rRNA基因與氨基糖甙類藥物導(dǎo)致的藥物性聾有關(guān)[14]。mtDNA12S rRNA基因的突變使得患者對(duì)此類藥物的敏感性增加。本研究3068例新生兒中，遺傳性耳聾易感基因變異132例，陽性率達(dá)到43.02‰，其中GJB2和SLC26A4的陽性率分別為25.75‰和12.39‰，提示正常新生兒中GJB2基因、SLC26A4基因突變占有一定的比率。因此，在新生兒聽力篩查的基礎(chǔ)上，開展耳聾基因篩查，明確遺傳性耳聾高危人群，對(duì)降低耳聾發(fā)病率有著重要意義。

盡管基因篩查技術(shù)得到快速發(fā)展，但聽力篩查在早期發(fā)現(xiàn)新生兒聽力損失中仍具有不可替代的作用[15]。因此，結(jié)合新生兒聽力篩查與遺傳性耳聾易感基因檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合篩查，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)與遺傳相關(guān)的遲發(fā)性耳聾患者和藥物性聾高?；颊哂兄浅Ｖ匾囊饬x[16]。