參麻益智方對雙側頸動脈結扎大鼠海馬認知功能的影響

曹 宇，刁雪梅2，李澤惠，李 琨3，劉美霞，裴 卉，李 浩

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是指由腦血管病變引起的或與腦血管病變有關的一種獲得性慢性進行性智力損害綜合征，臨床表現(xiàn)為智能障礙，包括認知能力、記憶力、判斷和思維能力、計算能力和社會生活能力的減退[1-2]。VaD是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的第二大導致癡呆的疾病[3]，給社會帶來巨大經濟負擔。VaD發(fā)病機制尚不明確，目前關于VaD發(fā)病機制的假說包括腦能量代謝障礙、氧化應激損傷、炎性反應、膽堿能系統(tǒng)失衡等[4-5]。海馬星形膠質細胞和小膠質細胞增殖、激活引起炎性反應是VaD的重要病理特征[6-7]。參麻益智方是臨床治療VaD的常用方，取得較好療效，該方由人參、天麻、鬼箭羽、川芎組成，具有補虛增智、活血平肝之功效。臨床研究表明，參麻益智方能改善VaD病人的認知功能障礙[8-9]。本研究旨在探討參麻益智方對雙側頸動脈結扎大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質細胞及小膠質細胞活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 參麻益智方由人參、天麻、鬼箭羽、川芎組成(3∶3∶3∶2)，均購自中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院。按照人與大鼠用藥劑量換算方法取各藥共5 200 g，純凈水浸泡30 min，入砂鍋文火煎煮30 min，倒出藥汁，加純凈水兩次煎煮20 min。合并兩次藥汁，過濾后置于100 ℃恒溫水浴箱濃縮至100%，即含生藥1 g，4 ℃避光保存。

1.2 實驗動物及分組 選用雄性SPF級10周齡Wistar大鼠80只，體重(300±20)g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于人工光照明暗各12 h飼養(yǎng)室內，溫度(23±2)℃，濕度(50±10)%，標準飼料和自來水自行取用。經1周適應性喂養(yǎng)后進行實驗。中藥低劑量參麻益智方組(SMYZ-L)、中劑量組(SMYZ-M)、高劑量組(SMYZ-H)，每組10只，分別予3.3 mg/kg、6.6 mg/kg、16.5 mg/kg灌胃；鹽酸多奈哌齊組(Donepezil組，10只)給予0.5 mg/kg藥物灌胃，假手術組(Sham組，10只)及雙側頸動脈結扎組(2-VO組，10只)給予等量蒸餾水灌胃。各組大鼠連續(xù)灌胃4周，大鼠喂養(yǎng)嚴格遵照動物保護協(xié)會相關規(guī)定。本研究獲得中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院倫理委員會批準，批準編號2018XLC008-1。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠一般情況 給藥結束后，觀察大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動度及體質量。

1.3.2 大鼠2-VO模型 大鼠術前禁食，行無菌手術操作。以2%戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰臥固定，刮除頸部被毛，碘消毒頸部，縱行剪開頸部皮膚1.5～2.0 cm，鈍性分離皮下組織及肌肉，暴露雙側頸總動脈，使用手術線于雙側頸總動脈近心端和遠心端分別結扎，之后將兩結扎處之間剪斷?？p合皮膚，保溫回籠飼養(yǎng)。模型組及藥物治療組結扎雙側頸總動脈，假手術組僅分離雙側頸總動脈。術后肌肉注射青霉素預防感染。手術時室溫控制在28 ℃，術后24 h內控制在25 ℃時大鼠狀態(tài)穩(wěn)定。各組大鼠清醒后參照Longa等[10]5級評分法進行神經功能評分：0分，無神經功能缺損體征；1分，對側前肢屈曲、不能伸直、同側霍納征，表現(xiàn)為提頸時左上肢向下、不能上抬；2分，向外側轉圈(大部分向左，小部分向右)；3分，行走時向對側傾倒；4分，不能自發(fā)行走、意識喪失。評分1～3分視為大鼠造模成功，造模失敗大鼠剔除并在后續(xù)實驗不足保證每組10只。

1.3.3 Morris水迷宮評價空間記憶能力 給藥結束后次日進行Morris水迷宮實驗(ZS-001型Morris水迷宮系統(tǒng)，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)。前5 d為定位航行實驗：將大鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機取東、西、南、北4個起始位置之一。記錄動物找到水下平臺時間(s)，若探索時間超過90 s，引導動物到平臺并讓其在平臺上停留10 s。將動物移開、擦干。每只動物每日訓練4次，兩次訓練間隔15～20 min。最后一次定位航行實驗結束后次日將平臺撤除，開始90 s探查訓練。入水點為原先平臺象限的對側，記錄大鼠在原先放置平臺象限花費時間，以此作為空間記憶的檢測指標。

1.3.4 免疫組化檢測小膠質細胞和星形膠質細胞 Morris水迷宮實驗后，以2%戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，大鼠經主動脈灌流后固定，斷頭取腦。各組取5只進行全腦固定、石蠟包埋、切片，冠狀位切片，厚度10 μm。分別滴加抗GFAP(protein tech公司，1∶300)和抗Iba-1抗體(proteintech公司，1∶300)行免疫組織化學染色。每張切片于100倍光鏡下觀察其形態(tài)數(shù)量，并進行拍照。

2 結 果

2.1 實驗動物一般情況 與Sham組比較，2-VO組大鼠精神狀態(tài)明顯萎靡不振，毛色無光澤而枯槁豎毛，活動度及體質量明顯下降。給藥后，各組大鼠狀態(tài)較2-VO組有明顯改善；其中灌胃參麻益智方后大鼠精神狀態(tài)較好，體質量恢復，Sham組輕，毛發(fā)略散亂有光澤，未見毛色枯槁或散亂豎毛，活動增多。

2.2 參麻益智方對雙側頸動脈結扎大鼠行為學的影響 與Sham組比較，2-VO組大鼠在水迷宮實驗到達安全平臺游泳時間(逃避潛伏期，escape latency)明顯延長(P<0.05)，提示雙側頸動脈結扎能明顯降低大鼠空間記憶能力。經過參麻益智方中劑量(6.6 mg/kg)、高劑量(16.5 mg/kg)及多奈哌齊(0.5 mg/kg)干預后，從第3天開始逃避潛伏期均較2-VO組顯著降低(P<0.05)。撤去安全平臺后，SMYZ-M組、SMYZ-H組及Donepezil組大鼠目標象限停留時間百分比明顯提高(P<0.05)，說明參麻益智方和多奈哌齊可恢復大鼠記憶能力。詳見圖1。

與2-VO組比較，*P<0.05

2.3 參麻益智方對星形膠質細胞的影響 100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)星形膠質細胞形態(tài)，2-VO組星形膠質細胞增生，表現(xiàn)為細胞數(shù)量增多，胞體變大，突起增多、變長并交織成網(wǎng)狀；給藥后，Donepezil組與SMYZ-H組、SMYZ-M組GFAP陽性細胞數(shù)量較2-VO組減少，突起變短、變細，胞體變小。詳見圖2。

圖2 大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質細胞(×100)

2.4 參麻益智方對小膠質細胞的影響 100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)小膠質細胞形態(tài)，相較于Sham組，2-VO組小膠質細胞胞體變大，由分支狀變?yōu)橥黄鹕俣痰墓嗄緲蛹毎?，甚至進一步轉化為“阿米巴樣”圓形細胞。Donepezil組與SMYZ-H組、SMYZ-M組均有散在的小膠質細胞激活，較2-VO組數(shù)量減少。詳見圖3。

圖3 大鼠海馬CA1區(qū)小膠質細胞(×100)

3 討 論

星形膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中的豐富細胞，為神經元提供營養(yǎng)支持，促進突觸形成和功能，通過吞噬作用修剪突觸，并實現(xiàn)一系列其他穩(wěn)態(tài)維持功能。星形膠質細胞在腦損傷和疾病后發(fā)生顯著轉化，稱作“反應性星形細胞增生(reactive astrocytosis)”，相關研究表明，反應性星形膠質細胞阻礙CNS恢復[11-12]。

小膠質細胞是CNS中固有的免疫細胞，是促炎細胞因子的主要來源，能調節(jié)大腦發(fā)育，維持神經元網(wǎng)絡和損傷修復[13]。正常情況下小膠質細胞處于相對靜息狀態(tài)，表現(xiàn)為胞體較小，突起細且長滿分支；CNS損傷或衰老過程，小膠質細胞激活，突起回縮變短，胞體變大，呈現(xiàn)阿米巴樣形態(tài)[14]。過度激活的小膠質細胞分泌促炎性因子，產生自由基，引起神經元繼發(fā)性損傷，從而抑制小膠質細胞激活，緩解神經炎癥反應，進而減輕CNS損傷[15-17]。

VaD是導致癡呆疾病的第二種常見類型，僅次于AD，因其具有可防治性，也稱作“可逆性癡呆”，藥物及非藥物療法在改善VaD病人癥狀和減輕家庭照料負擔方面起到積極作用，目前尚缺乏根本有效的早期診斷與防治措施[18-19]。隨著中醫(yī)藥對VaD研究深入，中藥因其多靶點、多途徑作用機制在改善VaD方面有突出優(yōu)勢。中醫(yī)認為癡呆發(fā)生與年老體衰、氣虛血瘀有關。如《千金翼方》曰：“人年五十以上，陽氣日衰，損與日至，心力漸退，忘前失后，興居怠惰，計授皆不稱心?！薄秲冉洝吩弧靶钛谏?，善忘”；王清任亦曰：“瘀血也令人善忘”。卒中后認知障礙(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是臨床VaD的常見亞型[20]。古籍中亦有相關記載，清朝葉天士《臨證指南醫(yī)案》中記載有：“中風初起，神呆遺尿，老人厥中顯然”；《雜病源流犀燭·中風》有“中風后善忘”之論。由此可見肝陽上亢，化火生風，風陽上擾清竅，可發(fā)為癡呆。參麻益智方針對VaD氣虛血瘀、肝風內動病理特點而設，由人參、天麻、鬼箭羽、川芎組成，具有補虛增智、活血平肝之功。方中以人參為君，具有大補元氣、安神增智之效；天麻為臣，具有平肝息風，滋陰潛陽，君臣相合，共奏活血通經之效；鬼箭羽為佐，以行血通絡散瘀，可助推陳致新，恢復水精平衡，并以川芎為使，兼引經藥，載諸藥直入血分達腦竅。諸藥合用，共奏補虛益智，平肝潛陽，化瘀通絡之功。本研究結果顯示，高劑量及中劑量參麻益智方干預2-VO大鼠，4周后可縮短大鼠逃避潛伏期，提高大鼠停留在目標象限時間，說明參麻益智方能提高VaD模型大鼠的空間記憶能力。進一步研究顯示參麻益智方能抑制海馬CA1區(qū)小膠質細胞和星形膠質細胞的激活和增生，這可能是參麻益智方提高慢性低灌注大鼠認知功能的機制之一。