香蕉皮內(nèi)生細(xì)菌的分離純化及初步鑒定

王福彬，雒曉芳,鄭青波,劉傳麗,羅 前,朱 凱

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730030;2.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)部,甘肅 蘭州 730030)

內(nèi)生菌是指存活于植物組織內(nèi),但不引發(fā)宿主植物出現(xiàn)明顯感染癥狀的微生物類群,其與宿主存在著和諧的共生關(guān)系[1-4].存在新鮮果皮中的內(nèi)生菌具有著廣闊的研究前景和利用價(jià)值.香蕉(MusananaLour.)芭蕉科芭蕉屬植物,又指其果實(shí),熱帶地區(qū)廣泛種植.而在我國香蕉已有3000多年的栽培歷史[5],因其氣味芬芳,肉質(zhì)軟而滑膩,爽口甘甜,深受人們的喜愛.香蕉被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)定位為發(fā)展中國家僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物.據(jù)統(tǒng)計(jì)，2009年農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中,香蕉僅次于小麥、大豆和玉米,位居第4位[6].香蕉中香蕉皮占全果質(zhì)量的35%～41%[7].生活中,香蕉皮一般會被使用者直接丟棄,易造成環(huán)境的污染[8].本試驗(yàn)從新鮮香蕉皮中分離純化一株未知細(xì)菌,并對該菌株進(jìn)行細(xì)菌特征觀察、生理生化鑒定及16S rDNA基因序列分析.目前,對香蕉皮的研究主要是對香蕉皮色素的提取、有效活性物質(zhì)提取等[9],而關(guān)于香蕉皮內(nèi)生菌的研究鮮有報(bào)道.而本研究為對一株來源于香蕉皮的內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定,并對其生物活性開展的研究,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和開發(fā)利用的潛力,為香蕉皮內(nèi)生菌種的開發(fā)和利用奠定了研究基礎(chǔ).

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

市售新鮮香蕉:香蕉皮表面含有少量黑斑或無黑斑.

1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g,NaCl 5 g,15 g瓊脂粉,搖動容器直至溶質(zhì)溶解.用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.4,去離子水定容至1 L.加熱溶解,121 ℃高壓滅菌30 min.

1.3 試劑

硫酸雙氫鏈霉素、青霉素G鉀、PCR試劑盒、乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液、5%石炭酸水溶液、75%酒精、0.1%升汞等.

1.4 儀器

生化培養(yǎng)箱(ZHWY-200D)、超凈工作臺、生物顯微鏡等.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌種分離及形態(tài)學(xué)觀察

選取新鮮香蕉皮,用無菌水、75%酒精和0.1%升汞處理后，切成均勻小片,與果肉接觸部分置于含鏈霉素(50～100 mg/L)和青霉素(100～300 mg/L)的LB培養(yǎng)基上.于25～35 ℃黑暗條件下培養(yǎng),待平板上長出肉眼可見的菌落時(shí),采用平板劃線的方法分離細(xì)菌,繼續(xù)培養(yǎng).連續(xù)多代純化,即可獲得生長優(yōu)良的菌種,將所得的純化菌株接種到斜面上,4 ℃冰箱中保存.選擇形態(tài)特征明顯的單一菌落,觀察其形態(tài)特征及其生長情況,并挑取培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢觀察.

2.2 細(xì)菌的生理生化鑒定

將純化后的菌株純培養(yǎng)物進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)等各項(xiàng)生理生化試驗(yàn).置于34 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,根據(jù)東秀珠等人所著的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》判定結(jié)果.

2.3 細(xì)菌的16S rDNA基因序列擴(kuò)增及其序列分析

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,按照革蘭氏陰性細(xì)菌提取基因組的方法,提取需鑒定菌株的基因組.按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取目標(biāo)菌株的基因組DNA,以其為模板,利用16S rDNA序列擴(kuò)增通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物的核酸序列送往蘭州領(lǐng)先生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序.測序結(jié)果與NCBI中的BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對分析,選取與分離菌序列相似性高的序列,利用MEGA5.1軟件手動調(diào)整序列,自展數(shù)(bootstrap)為1 000,模型Kimura 2-parameter model(K2),構(gòu)建鄰接法(Neighbor-joining,NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹.

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)學(xué)特征

經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定表明,該菌株為革蘭氏陰性,球桿狀,不運(yùn)動,單個(gè)或多個(gè)排列,不產(chǎn)芽孢.在LB培養(yǎng)基中34 ℃培養(yǎng)24小時(shí),形成圓形、隆起、邊緣整齊、表面粗糙、干燥粉末狀,初期呈白色,后期中間呈墨綠色，邊緣呈白色的菌落,產(chǎn)黃色素.初步命名為W.

3.2 生理生化特征

該細(xì)菌的生理生化特征符合不動桿菌的基本特征,不能降解硝酸鹽、淀粉、蔗糖、阿拉伯糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露糖,但可以利用甘露糖、尿素(見表1).

表1細(xì)菌W生理生化鑒定結(jié)果

3.3 16S rDNA基因序列測定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

根據(jù)相關(guān)文章表明[10-13],一般16S rDNA序列同源性大于99%,可以認(rèn)為是同一個(gè)種.16S rDNA序列同源性小于98%,可以認(rèn)為不屬于同一個(gè)種.同源性小于95%,可以認(rèn)為不屬于同一個(gè)屬.

經(jīng)鑒定，細(xì)菌W的16S rDNA的1411個(gè)核苷酸得到有效的擴(kuò)增.將細(xì)菌W的16S rDNA基因序列進(jìn)行Blaste比對分析,發(fā)現(xiàn)與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的Acinetobacterguillouiae不同菌株16S rDNA 序列的相似性高達(dá)99%.系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,分離菌W與Acinetobacterguillouiae聚為一簇,親緣關(guān)系最近,而與其他細(xì)菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn).結(jié)合生理生化特征,可判斷分離菌屬于不動桿菌屬.

圖1細(xì)菌W的16SrDNA全序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

不動桿菌是條件致病菌,根據(jù)相關(guān)文章報(bào)導(dǎo)[14-15],其廣泛分布于水、土壤、醫(yī)院環(huán)境和人體皮膚表面,而不同種類的不動桿菌在外界的分布情況，到目前為止還沒有系統(tǒng)的研究.據(jù)相關(guān)報(bào)導(dǎo)[16-17],在43%健康個(gè)體的皮膚上可分離到不動桿菌,也可在健康成年人的口腔及呼吸道分離得到.所以它已成為醫(yī)院獲得性感染的主要致病菌之一,因此如何治療不動桿菌引起的感染已成為臨床關(guān)注的重點(diǎn).近年來,還發(fā)現(xiàn)某些不動桿菌還具有降解多環(huán)芳烴的作用,所以,不動桿菌在石油污染的環(huán)境治理中有著良好的研究價(jià)值，在石油烴降解方面具有良好的應(yīng)用前景.

到目前為止,鮮有關(guān)于從香蕉皮中分離得到不動桿菌屬細(xì)菌的報(bào)導(dǎo),而本研究從新鮮香蕉皮中分離純化獲得一株內(nèi)生菌,并對該菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定試驗(yàn)以及16S rDNA基因序列的分析,確定了該菌為不動桿菌屬細(xì)菌.該菌種在香蕉皮中的發(fā)現(xiàn)豐富了不動桿菌屬細(xì)菌的分布,也為香蕉皮內(nèi)生菌種的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定了研究基礎(chǔ),因此本研究工作具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值.

5 結(jié)論

本研究從新鮮香蕉皮中分離出未知菌W,對其進(jìn)行了13項(xiàng)生理生化試驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)果與不動桿菌屬細(xì)菌生理生化指標(biāo)相似.對該菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行測序分析,通過Blaste與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)比對以及利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析結(jié)果表明，該菌株與Acinetobacterguillouiae的相似性最高,因此判斷該菌株W為不動桿菌屬細(xì)菌.