橄欖苦苷對(duì)三氧化二砷致神經(jīng)毒性的保護(hù)作用

王 昱

(隴南師范高等專(zhuān)科學(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開(kāi)發(fā)中心， 甘肅 成縣 742500)

中國(guó)自然資源復(fù)雜，飲水型砷中毒分布范圍廣泛，影響人群眾多，是環(huán)境砷中毒的主要類(lèi)型.目前，我國(guó)砷暴露人群已經(jīng)超過(guò)1 500萬(wàn)[1].砷通過(guò)食物鏈或飲用水進(jìn)入人體，容易蓄積，潛伏期長(zhǎng)，危害大.國(guó)際癌癥研究中心明確將砷及其化合物劃分為人類(lèi)確定的致癌物.大量研究顯示，慢性飲水型高砷暴露影響動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)、記憶能力下降[2]，損傷神經(jīng)元或增加神經(jīng)系統(tǒng)損傷易感性[3]，誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，并引起免疫功能損傷[4].近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注乙酰膽堿、單胺類(lèi)(去甲腎上腺激素、五羥色胺)和氨基酸類(lèi)(γ-氨基酸)在神經(jīng)毒物致學(xué)習(xí)記憶損傷中的作用及其機(jī)制[5-7].慢性砷暴露可影響大鼠腦中多巴胺、去甲腎上腺素等多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成和分泌，從而擾亂神經(jīng)系統(tǒng)的功能[8].對(duì)于慢性砷中毒，臨床上常采用金屬螯合劑(二巰丁二酸及其衍生物二巰丁二酸鈉等)注射治療，但這些藥物的副作用也相對(duì)比較大.橄欖苦苷屬于天然的多酚化合物，是油橄欖中含量最多的最主要的活性成分[9].本課題組前期已經(jīng)研究了橄欖苦苷在降血糖、抗衰老及降血脂等方面的藥理作用[10-12].為了進(jìn)一步研究橄欖苦苷的藥理作用，本研究在 As2O3染毒小鼠的基礎(chǔ)上給予橄欖苦苷干預(yù)，觀察大腦組織部分神經(jīng)遞質(zhì)基因表達(dá)的變化，探討其拮抗神經(jīng)毒性的保護(hù)作用.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立與給藥

健康昆明小鼠30只(購(gòu)于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證編號(hào)14-006，體質(zhì)量 18～20 g，雌雄各半)，同條件飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為3組，每組10只：正常對(duì)照組、模型組和橄欖苦苷組.模型組每天灌胃4 mg /kg·bw劑量的As2O3溶液，橄欖苦苷組灌胃4 mg /kg·bw劑量的As2O3溶液[13]，同時(shí)灌胃100 mg/kg·bw的橄欖苦苷[9](隴南田園油橄欖科技開(kāi)發(fā)有限公司提供)，正常對(duì)照組每天灌胃等量的0.9% 生理鹽水，連續(xù)處理5周后，斷頭處死小鼠，立即取大腦儲(chǔ)存于RNA保存液中，備用.

1.2 總RNA 的提取和基因芯片雜交

分別研磨各實(shí)驗(yàn)組小鼠大腦，按照TRIzol 試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司)操作說(shuō)明從中抽提總RNA，用RNeasy Mini Kit(美國(guó)Oiagen公司)進(jìn)行純化.用UV-1800紫外分光光度儀(日本Tokyo)測(cè)定RNA的濃度和純度，變性膠電泳(美國(guó)Sigma公司DEPC水和溴酚藍(lán)，Bocherigmer公司MOPs緩沖液)檢測(cè)RNA有無(wú)降解，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA、體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA 探針，同時(shí)用生物素標(biāo)記探針，片段化處理探針，45 ℃下在雜交箱640 (美國(guó)Affymetrix 公司)中與Mouse Genome 4302.0 Araay 基因芯片雜交16 h，全自動(dòng)芯片洗滌工作站450(美國(guó)Affymetrix 公司)中洗脫、染色；最后用GeneArrayTM掃描儀3000(美國(guó)Affymetrix 公司)掃描雜交信號(hào).

1.3 芯片數(shù)據(jù)處理和生物學(xué)信息分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microarray Suite Version 5.0軟件(美國(guó)Affymetrix 公司)進(jìn)行分析，在對(duì)單個(gè)樣本表達(dá)分析的前提下，建立正常對(duì)照組、模型組和橄欖苦苷組基因表達(dá)譜，其中p>0.06 為不表達(dá)，p<0.04為表達(dá)，0.04～0.06 為臨界.然后將各實(shí)驗(yàn)組的基因表達(dá)譜進(jìn)行組間比較，再根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度比值的對(duì)數(shù)(signal log ratio，SLR)判斷.如果SLR>1(即表達(dá)倍數(shù)>2)為表達(dá)上調(diào)，SLR < -1(即表達(dá)倍數(shù)<2)為表達(dá)下調(diào)，建立各組差異表達(dá)的數(shù)據(jù)庫(kù).

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組大腦組織神經(jīng)遞質(zhì)基因表達(dá)的變化

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠大腦組織神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶相關(guān)基因Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha和Pck1的表達(dá)均下調(diào).與模型組比較，橄欖苦苷組小鼠大腦組織基因Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha和Pck1的表達(dá)均上調(diào).與正常對(duì)照組比較，除了基因Pck1、Chat外，其他基因在橄欖苦苷組小鼠大腦組織的表達(dá)變化不顯著，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1).

表1橄欖苦苷對(duì)小鼠大腦組織神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2 橄欖苦苷對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)受體基因的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠大腦組織基因Chrm1、Drd3、Drd4、Htr1d、Htr5b、Adra1a、Adra2a、Adra2b、Adrb3、Grin2d和Gria2的表達(dá)均下調(diào)，基因Drd1a、Htr1f、Htr4、Htr7和Grin3b的表達(dá)上調(diào).與模型組比較，橄欖苦苷組小鼠大腦組織基因Chrm1、Drd3、Drd4、Htr1d、Htr5b、Adra1a、Adra2a、Adra2b、Adrb3、Grin2d和Gria2的表達(dá)均上調(diào)，基因Drd1a、Htr1f、Htr4、Htr7和Grin3b的表達(dá)下調(diào).除了基因Adra2a、Adra2b 和Adrb3外，其他基因在正常對(duì)照組與橄欖苦苷組小鼠大腦組織的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2).

表2橄欖苦苷對(duì)小鼠大腦組織神經(jīng)遞質(zhì)受體相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

砷可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化[2]，導(dǎo)致腦功能失調(diào)，學(xué)習(xí)記憶能力減退[14].本實(shí)驗(yàn)利用基因芯片技術(shù)分析結(jié)果顯示，模型組小鼠大腦中乙酰膽堿、單胺類(lèi)(去甲腎上腺激素、五羥色胺)和氨基酸類(lèi)(γ-氨基酸)神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶基因(Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha、Pck1)的表達(dá)均低于正常對(duì)照組，這與[2]的研究結(jié)果一致.經(jīng)橄欖苦苷干預(yù)后，小鼠大腦中神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶基因Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha、Pck1的表達(dá)顯著升高，提示橄欖苦苷可能通過(guò)升高大腦中神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶基因Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha、Pck1的表達(dá)而提高大腦中相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度.

受體相互作用是共同表達(dá)在突觸區(qū)的受體之間的緊密聯(lián)系，在受體功能的調(diào)節(jié)、突觸的傳導(dǎo)、神經(jīng)可塑性等方面發(fā)揮著重要的作用.多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)屬于兒茶酚胺類(lèi)，在大腦中含量最豐富，能調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能.多巴胺受體(dopamine receptor，DR)可以激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，DR為7個(gè)跨膜區(qū)域組成的G蛋白耦聯(lián)受體蛋白家族，目前發(fā)現(xiàn)有五種DR亞型(D1～D5)[6].王艷艷等[2]研究表明，多巴胺受體存在于大腦皮層和海馬，砷導(dǎo)致多巴胺受體基因(Drd3、Drd4)表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響了γ-氨基丁酸的傳遞.五羥色胺受體調(diào)節(jié)許多神經(jīng)遞質(zhì)(包括谷氨酸、γ-氨基丁酸、多巴胺、腎上腺素/去甲腎上腺素和乙酰膽堿等)，影響焦慮、認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶、情緒和體溫調(diào)節(jié)等生物學(xué)和神經(jīng)學(xué)過(guò)程.大量腦與行為的研究提示，五羥色胺能系統(tǒng)與多巴胺能系統(tǒng)在多個(gè)層面上存在交互作用，從細(xì)胞放電、神經(jīng)遞質(zhì)釋放到行為都有體現(xiàn)[7].本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，砷中毒小鼠經(jīng)橄欖苦苷干預(yù)后，大腦組織基因Chrm1、Drd3、Drd4、Htr1d、Htr5b、Adra1a、Adra2a、Adra2b、Adrb3、Grin2d和Gria2的表達(dá)均上調(diào)，基因Drd1a、Htr1f、Htr4、Htr7和Grin3b的表達(dá)下調(diào)，這表明橄欖苦苷影響了小鼠大腦組織內(nèi)部分神經(jīng)遞質(zhì)基因的表達(dá)，從而影響其受體基因之間的交互作用及表達(dá)水平，這可能是其提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的分子機(jī)制之一.但還需進(jìn)一步驗(yàn)證這些受體基因之間的交互作用及異常表達(dá)，基因在蛋白水平的表達(dá)，以及與改善砷暴露人群神經(jīng)行為之間的關(guān)系.