荒漠肉蓯蓉總苷大孔吸附樹脂純化工藝

余逸凡，石秋慧，譚金晶，阿巧生，康淑荷

(西北民族大學(xué) 化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730106)

列當(dāng)科(Orobanchaccae)肉蓯蓉屬(Cistanche)植物荒漠肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)為西部沙漠地區(qū)的特產(chǎn)，有“沙漠人參”之稱，具有補(bǔ)精血、益腎壯陽、潤腸通便之功效[1].富含苯乙醇苷類、木脂素及其苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、黃酮類等化學(xué)成分[2-4 ]，具有抗輻射、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)記憶、肝保護(hù)、提高性功能及抗衰老等作用[5-7].目前,徐常永等[8]對肉蓯蓉(產(chǎn)地不明)總黃酮采用大孔樹脂進(jìn)行了研究，王秀海等[9]優(yōu)化了AB-8大孔吸附樹脂純化新疆和田產(chǎn)管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa( Schrenk) Wight總苷的工藝.甘肅荒漠肉蓯蓉資源豐富，種植面積超過13.3 km2.鑒于產(chǎn)地、植物種類及采集時間等對植物化學(xué)成分及含量均有影響，本實驗以甘肅武威產(chǎn)的荒漠肉蓯蓉為原料，以松果菊苷為標(biāo)準(zhǔn)對照品，從六種大孔吸附樹脂(AB-8、 HPD-100、 D-101、HPD-826、 DM-130、 NAK-9)中，優(yōu)選出純化該植物總苷的較佳樹脂D-101.對D-101分離純化荒漠肉蓯蓉總苷的工藝，采用L9(34)正交設(shè)計優(yōu)化，為進(jìn)一步開發(fā)利用荒漠肉蓯蓉提供實驗依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 材料

荒漠肉蓯蓉2017年2月采集于甘肅省武威市甘肅蓉寶生物科技有限公司種植基地，經(jīng)康淑荷副教授鑒定為列當(dāng)科(Orobanchaccae)肉蓯蓉屬Cistanche植物荒漠肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma，切片速冷風(fēng)干，粉碎，過40目篩，備用.

松果菊苷對照品(批號：20180218，純度>99%，天津市北辰方正集團(tuán))；大孔吸附樹脂AB-8、HPD100、D101、HPD826、DM130、NAK-9(安徽三星樹脂有限公司)；超純水；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器

Heλiosβ紫外可見光譜儀：美國熱電；Advanced-I-24L艾柯實驗室超純水機(jī)：成都艾柯水處理設(shè)備公司；YQ-620C超聲儀：上海易凈超聲波儀器公司；ZA100R3電子天平；上海贊維衡儀器公司；6210立式真空干燥箱:上海東麓儀器設(shè)備公司.

2 方法

2.1 荒漠肉蓯蓉溶液制備

稱量500 g預(yù)先處理好的荒漠肉蓯蓉粉末，加入10倍70%乙醇，超聲(溫度45 ℃、功率540 W)30 min后，再加熱回流30 min，離心(4 000 r·min-1)分離，上清液真空抽濾，收集濾液.同法重復(fù)提取3次，真空濃縮(溫度45 ℃)濾液，45 ℃真空干燥至恒重，得棕褐色荒漠肉蓯蓉總浸膏144 g.

精密稱定浸膏0.4 g，超純水為溶劑，定容至200 mL棕色容量瓶中(總苷含量為0.044 mg·mL-1)，備用.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱量松果菊苷對照品10 mg，加入50%甲醇，定容至100 mL容量瓶內(nèi).分別量取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度.配制不同濃度(以C表示)的標(biāo)準(zhǔn)溶液[9]，以紫外可見光譜儀全波長掃描，得到λmax=378 nm，在此λmax波長處測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度A.標(biāo)準(zhǔn)曲線以A為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)，回歸線方程為A=10.185C-0.0009，R2=0.9999，線性范圍為0.018 7～0.105 0.

2.3 靜態(tài)吸附

分別準(zhǔn)確稱量六種大孔樹脂100 g，按文獻(xiàn)方法[10-11]處理，用超純水洗至無醇味后，加入濃度為1.5 mg·mL-1的樣品溶液200 mL，按文獻(xiàn)[12-13]的方法，充分振蕩后，靜置24 h，真空抽濾，分別收集濾液和濾渣.測定濾液的吸光度A，計算荒漠肉蓯蓉總皂苷的含量，計算吸附率=(C1V1-C2V2)/C1V1×100%，C1(mg·mL-1)為吸附前樣品溶液中總皂苷的濃度；V1(mL)為吸附前樣品溶液的體積；C2(mg·mL-1)為吸附后的流出液總皂苷的濃度；V2(mL)為吸附后的流出液體積.濾渣(過濾后的樹脂)加入70%乙醇，充分振蕩，靜置12 h，過濾.測定濾液的吸光度，計算荒漠肉蓯蓉總皂苷的含量，計算解吸率=C3V3/(C1V1-C2V2)×100%，C3(mg·mL-1)為解吸液中總皂苷的濃度；V3(mL)為解吸液的體積.計算回收率=吸附率×解吸率.

2.4 動態(tài)吸附

將2.3中優(yōu)選出的較佳樹脂D-101，稱量5份，每份100 g，預(yù)處理后，分別進(jìn)行濕法裝柱，層析柱均為35 mm×500 mm.用超純水洗至無醇味后[10-11]，選擇D-101對總苷的吸附率為考察指標(biāo)，70%乙醇為洗脫劑，考察上樣濃度(0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1)、洗脫液流速(1.0 mL·min-1、2.0 mL·min-1、4.0 mL·min-1、6.0 mL·min-1)和洗脫液體積(2、4、6、8、10 BV)的影響.

2.5 正交實驗

在2.4實驗基礎(chǔ)上，以A洗脫液流速(mL/min)、B洗脫液體積(BV)、C上樣液濃度(mg·mL-1)為因素，荒漠肉蓯蓉總皂苷吸附率為指標(biāo)，正交設(shè)計助手IIV3.1中L9(34)進(jìn)行正交實驗(見表1).

表1正交實驗設(shè)計

3 結(jié)果與分析

3.1 靜態(tài)吸附

靜態(tài)吸附結(jié)果(見圖1),顯示六種樹脂吸附率由高到低的順序為NAK-9>DM-130>HPD-826>HPD100>D-101>AB-8；解析率由高到低的順序為AB-8>D101>HPD-826>HPD-100>DM-130>NAK-9；回收率由高到低的順序為D-101>HPD-826>AB-8>DM-130>HPD-100>NAK-9.以回收率為主要參考指標(biāo)，綜合考慮吸附率及解吸率，選擇D-101樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附實驗.

圖1 六種樹脂對總皂苷的吸附、解吸和回收率

3.2 動態(tài)吸附

3.2.1 上樣濃度

當(dāng)洗脫液流速為1.5 mL·min-1，洗脫液體積為5 BV時，不同上樣濃度對吸附率的影響結(jié)果(見圖2)表明：吸附率隨著上樣液濃度的增加依次遞增.當(dāng)上樣液濃度達(dá)到1.5 mg·mL-1時吸附率達(dá)到最大，當(dāng)上樣液濃度繼續(xù)增加時吸附率下降，故選擇1.5 mg·mL-1為較佳上樣濃度.

圖2上樣濃度的影響

3.2.2 洗脫液流速

當(dāng)洗脫液體積為5 BV，上樣濃度為1.5 mg·mL-1時，洗脫液流速的影響結(jié)果(見圖3)顯示：吸附率隨著洗脫液流速的增大而增大，當(dāng)洗脫液流速為2 mL·min-1時吸附率最大，達(dá)到了89.70%，此后，隨洗脫液流速增大，吸附率迅速減小.選擇2 mL·min-1為較佳洗脫液流速.

圖3 洗脫液流速的影響

3.2.3 洗脫液體積

當(dāng)洗脫液流速為2 mL·min-1，上樣濃度為1.5 mg·mL-1時，洗脫液體積對總苷吸附率的影響結(jié)果表明：隨著洗脫液體積的增加，吸附率也逐步增加.當(dāng)洗脫液體積達(dá)到8 BV時吸附率達(dá)到最大，為79.15%.當(dāng)洗脫液體積繼續(xù)增加到10 BV時，吸附率不再增大，選擇8 BV為洗脫較佳體積.

圖4洗脫液體積的影響

表2以吸附率為考察指標(biāo)的正交實驗結(jié)果

3.3 正交實驗結(jié)果與分析

以總苷吸附率為考察指標(biāo)的L9(34)正交實驗結(jié)果及直觀分析見表2，(使用軟件為正交設(shè)計助手IIV3.1)，方差分析見表3.

表3方差分析

表2中k1、k2和k3分別表示相應(yīng)水平所得總苷吸附率的平均值，極差R=kmax-kmin，直觀分析顯示洗脫液流速(A)k2>k3>k1，洗脫液體積(B)k1>k2>k3，上樣液濃度(C)k3>k1>k2，各因素R大小順序為RA>RC>RB，表明各因素對總苷吸附率的影響依次為A>C>B.

由表3可知，洗脫液流速對總苷吸附率的影響具有顯著性意義(P<0.05).

綜上所述，確定D-101樹脂分離純化荒漠肉蓯蓉總苷的較佳工藝條件為A2B1C3，即上樣液流速2 mL·min-1，洗脫液體積6 BV，上樣液濃度2 mg·mL-1.

3.4 工藝參數(shù)驗證

以D-101樹脂對荒漠肉蓯蓉總苷的吸附率、解吸率和純化前后總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，按照3.3得到的較佳實驗條件，重復(fù)3次,結(jié)果如表4顯示.荒漠肉蓯蓉總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由分離純化前2.23%提高到了純化后的64.38%，且實驗RSD<2%.驗證實驗表明，D-101純化荒漠肉蓯蓉總苷的產(chǎn)率和含量穩(wěn)定，表明實驗優(yōu)選的工藝分離效果好.

表4驗證實驗結(jié)果

4 結(jié)論

大孔吸附樹脂具有環(huán)保、再生簡單，且易于工業(yè)連續(xù)生產(chǎn)的優(yōu)點.在6種樹脂中，D-101樹脂吸附及解析后的回收率最高，為純化荒漠肉蓯蓉總苷的理想樹脂.純化后的肉蓯蓉總苷體外活性(抗自由基氧化的能力)明顯高于純化前，有關(guān)研究將在另一篇論文中報道.該研究結(jié)果可進(jìn)一步進(jìn)行放大實驗，為工業(yè)生產(chǎn)提供參考.