清毒湯對重癥肝損傷大鼠腸上皮細胞自噬的影響

趙夢培 李愛紅 崔 穎 車念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文 高連印*

(1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學系 中醫(yī)絡(luò)病研究北京重點實驗室，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學臨床檢驗中心，北京 100069)

慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis，CSH)是在慢性肝炎、肝硬化的基礎(chǔ)上由于多種因素導致肝細胞廣泛變形、壞死而出現(xiàn)肝衰竭的嚴重疾病，包括慢加急性、亞急性及慢性肝衰竭[1]。其發(fā)病機制復(fù)雜，合并癥多，預(yù)后極差，病死率為50%～55%[2]。腸源性內(nèi)毒素是CSH發(fā)生和病情加重的重要因素，CSH患者多伴腸道黏膜屏障功能受損使腸道黏膜通透性增加，進而誘發(fā)腸源性內(nèi)毒素血癥[3]。自噬是細胞通過膜囊泡結(jié)構(gòu)降解胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)和受損細胞器維持機體穩(wěn)態(tài)的生物學過程。自噬是真核細胞通過溶酶體降解胞內(nèi)受損的細胞器和大分子物質(zhì)維持自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定的病理生理過程。研究[4]顯示，自噬參與保護腸黏膜機械屏障，修復(fù)受損的腸上皮細胞，降低腸道通透性。清毒湯是首都國醫(yī)名師王融冰等[5]治療肝病腸源性內(nèi)毒素癥的經(jīng)驗方，前期研究[6-7]顯示清毒湯臨床治療CSH安全有效，對模型大鼠有保肝，降低腸道通透性的作用。本研究擬建立硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)致實驗性大鼠重癥肝損傷模型，通過觀察清毒湯對模型大鼠內(nèi)毒素、白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、白細胞介素-23(interleukin-23，IL-23)腸上皮細胞自噬及相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1的影響，進一步研究清毒湯通過誘導腸道上皮細胞自噬保護腸道黏膜屏障減輕重癥肝損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號: SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房，室溫(22.0±2.0) ℃，相對濕度40%～70%，光照明暗交替12 h/12 h。實驗動物使用及實驗方案均已經(jīng)首都醫(yī)科大學倫理委員會審核批準。

1.2 實驗試劑及儀器

清毒湯由大黃10 g、枳實10 g、厚樸10 g、茜草9 g、生地黃12 g組成，飲片均購自北京同仁堂，由首都醫(yī)科大學實驗室煎制，根據(jù)課題組前期實驗[6-7]得出有效劑量，濃縮成生藥含量1.6 g/mL 的水煎劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ虼阴０?貨號：V900086，德國Sigma-Aldrich公司)；乳果糖(貨號：346940，荷蘭蘇威制藥有限公司)；內(nèi)毒素(南京建成生物工程研究所)；IL-17、IL-23試劑盒(美國eBioscience，公司)；LC3抗體(貨號：12741，美國Cell Signaling Technology公司)；Beclin-1抗體(貨號：3495s，美國Cell Signaling Technology公司)。高速冷凍離心機(XIANGYI)，Image Pro 6.0(美國Media Cybernetics公司)，日立7600生化儀，Multiskan MK3酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子/JEOL)。

1.3 造模及給藥

本實驗采用TAA誘導大鼠重度肝損傷模型[8]，24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用數(shù)字表法隨機選取6只分為正常組，給予0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液灌胃；其余18只為造模組，每日予以12 mg/kg的TAA進行灌胃，持續(xù)12周。第8周末將造模組采用數(shù)字表法隨機分為模型組、乳果糖組、中藥組，每組6只。乳果糖組給予1.6 g/kg的乳果糖；中藥組給予為5.95 g/kg的清毒湯濃縮液；模型組給予等量的0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液，持續(xù)4周。造模及治療期間，各組大鼠自由攝食飲水，在造模第12周末夜間禁食。

1.4 標本制備

所有大鼠在第12周末禁食10～12 h后，按0.035 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射的水合氯醛進行麻醉。打開腹腔，腹主動脈取血，緩慢注射于無菌真空采血管內(nèi)，3 000 r/min，4 ℃，離心15 min后取其上清液分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。動物處死后立即取少許結(jié)腸組織于戊二醛中固定。取相同部位的部分肝臟及結(jié)腸組織置于4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛中，置-4 ℃冰箱保存，其余結(jié)腸組織分裝于凍存管內(nèi)，液氮中快速凍存，隨后移至-80 ℃冰箱存放。

1.5 指標檢測

石蠟包埋腸組織，制備切片，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)染色，光鏡下觀察組織病理變化。將固定液中的結(jié)腸組織進行漂洗、鋨酸固定、脫水、包埋、切片，透射電鏡下觀察腸上皮細胞自噬體變化。內(nèi)毒素及IL-17、IL-23采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，嚴格按照試劑盒說明執(zhí)行。Western blotting法檢測腸組織中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1蛋白相對表達量：取適量腸組織經(jīng)裂解處理，離心后取上清液，經(jīng)封閉、一抗孵育、二抗孵育后，膠片定影，用Image Pro Plus進行灰度統(tǒng)計，目的蛋白表達量以目的蛋白/β-actin的灰度比值表示。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝、腸組織病理改變

為了觀察清毒湯對重度肝損傷模型大鼠的組織病理學影響，對肝和結(jié)腸組織進行了HE染色。光鏡下可見正常組大鼠組織結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則，細胞質(zhì)與細胞核分明，沒有明顯的炎性細胞浸潤，肝臟細胞以中央靜脈為中心， 呈放射狀排列，腸道黏膜上皮無脫落及壞死；模型組大鼠存在大量炎性細胞浸潤，炎性反應(yīng)面積增加，肝臟結(jié)構(gòu)破壞，有假小葉形成，肝細胞排列紊亂、變性及壞死，腸道黏膜上皮的斷裂，腸黏膜上皮細胞排列相對較紊亂；乳果糖組和中藥組大鼠組織的炎性浸潤較模型組均有所改善，且中藥組改善作用最顯著，詳見圖1。

2.2 各組大鼠腸黏膜自噬泡電鏡檢測

電鏡下可見正常組大鼠腸上皮細胞結(jié)構(gòu)基本正常，細胞連接緊密，可見少量的自噬體；模型組大鼠腸上皮細胞連接疏松，甚至消失，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，自噬體極少；乳果糖組腸上皮細胞連接依然疏松，但自噬體較模型組增多，出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體；中藥組腸上皮細胞連接較為緊密，自噬體增多最為明顯，詳見圖2。

圖1 各組大鼠肝(200×)和結(jié)腸(100×)組織切片HE染色Fig.1 Result of HE staining of liver (200×)and colon (100×) tissue in each group of rats

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠腸上皮細胞的自噬體結(jié)構(gòu)Fig.2 Transmission electron microscopy observation of autophagosome structure of intestinal epithelial cells in each group of rats (3 000×)

2.3 各組大鼠內(nèi)毒素及 IL-17、IL-23的表達水平比較

與正常組比較，模型組大鼠內(nèi)毒素及IL-17、IL-23質(zhì)量濃度升高(P<0.01)；與模型組比較，乳果糖組及中藥組大鼠內(nèi)毒素及IL-17、IL-23質(zhì)量濃度均明顯下降(P<0.01)，其中，中藥組較乳果糖組的IL-17表達有所減少，IL-23表達下降更為顯著(P<0.01)，詳見表1。

表1 各組大鼠內(nèi)毒素、IL-17、IL-23表達情況Tab.1 Expression of endotoxin， IL-17 and IL-23 in each group of rats

2.4 各組大鼠腸組織中LC3、Beclin-1蛋白表達水平比較

各組任取6只大鼠檢測腸組織中LC3、Beclin-1蛋白表達量見圖3，表2。與正常組相比較，模型組大鼠的LC3Ⅱ/LC3I及Beclin-1蛋白顯著下降(P<0.05或P<0.01)。經(jīng)干預(yù)治療后，LC3Ⅱ/LC3I均顯著升高(P<0.01)，乳果糖組Beclin-1含量有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中藥組的Beclin-1含量則顯著升高(P<0.01)。

圖3 各組大鼠腸組織中LC3、Beclin-1蛋白表達Fig.3 Expression of LC3 and Beclin-1 in intestinal tissues of rats in each group

A: normal control group;B: model group;C: lactulose group;D: Qingdu Decoction group.

表2 各組大鼠腸組織LC3、Beclin-1蛋白表達比較Tab.2 Comparison of protein expression of LC3， Beclin-1 in intestinal tissues of rats in each group

##P<0.01vsnormal control group;**P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vslactulose group.QDD: Qingdu Decoction group.

3 討論

腸源性內(nèi)毒素是CSH加重的重要因素，大量研究[9-10]證實CSH伴有腸源性內(nèi)毒素血癥。CSH患者肝臟結(jié)構(gòu)遭到破壞，血液循環(huán)失調(diào)，門靜脈回流受阻，腸道黏膜充血水腫，通透性增加，致使內(nèi)毒素的吸收增加。過量的內(nèi)毒素進入血液，可誘導相關(guān)細胞炎性因子如IL-17、IL-23等的大量分泌，從而造成肝臟的“二次打擊”，加劇肝臟損傷。IL-17是炎性反應(yīng)的早期啟動因子，由Th17細胞分泌，可以通過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎性反應(yīng)，IL-23能促進Th17細胞產(chǎn)生IL-17，與重癥肝損傷密切相關(guān)[11-12]。

如何通過修復(fù)腸黏膜屏障來改善CSH肝損傷也成為疾病治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腸黏膜屏障的損傷因素主要是缺血、缺氧，炎性因子，病原入侵等，而腸上皮細胞作為腸黏膜屏障的重要組成部分，在抵抗微生物、毒素的入侵方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。關(guān)于自噬與腸黏膜屏障功能障礙的研究[13-14]已有報道，在腸黏膜屏障功能發(fā)生障礙過程中，自噬對于維持腸上皮細胞的存活起關(guān)鍵性作用。自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1在自噬過程中起著非常重要的作用。LC3定位與自噬泡內(nèi)膜，為自噬是否發(fā)生的重要標志物。LC3-I參與自噬起始環(huán)節(jié)，自噬發(fā)生時，經(jīng)泛素樣加工修飾與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，經(jīng)修飾形成LC3-Ⅱ。Beclin-1 是參與自噬的重要基因，與酵母自噬基因Atg6 同源，其編碼的Beclin-1蛋白可參與自噬前提復(fù)合物和自噬小體的形成。目前，電鏡觀察自噬體是較為可靠的自噬檢測手段。LC3含量與自噬泡數(shù)成正比例關(guān)系，是自噬標志物，LC3-Ⅱ/LC3-I可作為檢測自噬水平的生物學指標[15]。作為自噬的標志性分子，Beclin-1作為自噬活性的輔助指標，已廣泛應(yīng)用于自噬活性的檢測[16]。

清毒湯是在“通腸治肝”法的指導下創(chuàng)制治療CSH內(nèi)毒素血癥的新方。該方化裁自增液承氣湯，由大黃、枳實、厚樸、生地、茜草組成，具有滋陰通下、涼血解毒之效，通過清除腸道毒濁邪氣，以排出肝臟中濁氣，從而治療肝病。本實驗建立TAA致重癥肝損傷模型，對清毒湯的機制進一步探討，結(jié)果顯示，清毒湯可明顯減輕肝腸組織炎性浸潤，降低實驗大鼠內(nèi)毒素及IL-17、IL-23表達，提高自噬體數(shù)量及LC3、Beclin-1蛋白含量。

綜上，TAA致重癥肝損傷大鼠內(nèi)毒素升高，IL-17、IL-23釋放增多，自噬體少見，并且LC3及Beclin-1蛋白含量降低，表明肝臟嚴重損傷時炎性反應(yīng)因子及內(nèi)毒素增多且腸上皮細胞自噬水平較低。清毒湯干預(yù)后可降低實驗大鼠血清內(nèi)毒素及IL-17、IL-23含量，并提高自噬水平，這說明清毒湯可能通過激活重癥肝損傷大鼠的腸上皮細胞自噬，減少炎性反應(yīng)因子的釋放，來降低內(nèi)毒素的產(chǎn)生，從而減輕肝臟損傷。