G蛋白偶聯(lián)受體MAS對肝臟糖脂代謝的影響

張怡塵 曹 曦 楊金奎

(首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內分泌科 糖尿病防治研究北京市重點實驗室 北京市糖尿病研究所，北京 100730)

糖尿病作為醫(yī)療緊急事件之一，已經成為全球公共衛(wèi)生的巨大挑戰(zhàn)。根據國際糖尿病聯(lián)合會的報告，成人糖尿病的總患病率為9.1%，而中國是全球糖尿病患病人數最多的國家[1]。糖尿病是一種因胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗導致的疾病。肝臟作為胰島素作用的重要靶器官之一，對維持機體的糖脂代謝平衡起重要作用，而肝臟胰島素抵抗(insulin resistance，IR)主要表現(xiàn)為肝糖生成增多、脂代謝紊亂和肝臟脂肪沉積，在2型糖尿病和非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。

腎素-血管緊張素系統(tǒng) (rennin angiotensin system， RAS) 是控制血壓和水電解質平衡的關鍵因素，也是機體內重要的內分泌調節(jié)系統(tǒng)[3]。近年來研究[4]表明RAS在糖尿病以及代謝紊亂綜合征的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的調節(jié)作用，而新發(fā)現(xiàn)的ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸，可以拮抗經典軸ACE-AngⅡ-AT1的生物效應，從而發(fā)揮其保護作用。MAS蛋白由325個氨基酸組成，屬于G蛋白超偶聯(lián)受體亞家族。2003年Santos等[5]的研究證明G蛋白偶聯(lián)受體MAS是Ang-(1-7)的功能性結合位點，MAS受體在人和小鼠的腦、腎、睪丸、心臟和血管等組織中均有表達[6-9]。現(xiàn)有研究[3]證明，MAS受體在許多疾病模型的治療中發(fā)揮了積極作用，例如心血管疾病、代謝相關疾病、腎病和類風濕性關節(jié)炎。

本課題組的前期研究[10-11]表明，ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸可以抑制肝臟胰島素抵抗及肝臟脂肪變性，但MAS受體在肝臟糖脂代謝過程中的具體作用機制還鮮有報道。本文將在細胞水平初步探索MAS對肝臟糖脂代謝的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 病毒構建

將小鼠MAS基因(975 bp)重組到腺病毒載體質粒PDC316-mCMV-ZsGreen上，用攜帶目的基因的重組質粒PDC316-mCMV-ZsGreen-MAS和PDC316-mCMV-ZsGreen以及骨架質粒共轉染HEK293細胞，獲得攜帶目的基因的腺病毒，通過擴增最終得到1×1010pfu/mL滴度的綠色熒光蛋白-腺病毒(adenovirus of a green florescent protein，Ad-GFP)和1.5×1010pfu/mL滴度的鼠MAS-綠色熒光蛋白-腺病毒(adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein，Ad-mMAS-GFP)(Sino-GenoMax公司， 中國)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞系HepG2購自中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞資源中心，用MEM(Gibco 公司，美國)進行培養(yǎng)，加入10%(體積分數)胎牛血清(Gibco公司，美國)、100 U/mL 青霉素和0.1 g/L鏈霉素(Solarbio公司，中國)，置于37 ℃，5%(體積分數)CO2孵箱中培養(yǎng)，每2天用0.25%(質量分數)胰酶(Solarbio公司，中國)消化傳代。調整細胞密度為 2×105個細胞/mL，分別接種于6孔板、12孔板。對照組以1.0×108pfu/mL滴度的Ad-GFP 病毒，實驗組以1.5×108pfu/mL滴度的Ad-mMAS-GFP，病毒孵育HepG2細胞24 h后，熒光顯微鏡觀察病毒感染效率。

1.3 毒胡蘿卜素(thapsigargin,Tg)誘導內質網應激細胞模型的構建

以不同濃度(0、2、5、8 μmol/L)的毒胡蘿卜素(Sigma公司，美國)處理HepG2細胞24 h，以0 μmol/L作為對照；設0、8、12、24 h 4個刺激時間，以刺激0 h為對照。根據內質網應激相關mRNA表達水平選取Tg最佳處理濃度和時間，構建HepG2細胞內質網應激模型。

1.4 酶法檢測細胞內三酰甘油及總膽固醇含量

采用組織三酰甘油酶法測定(組織、細胞)試劑盒 (普利萊公司， 中國) 測定細胞內三酰甘油含量， 以每毫克蛋白濃度校正三酰甘油含量。采用組織總膽固醇含量測定(組織、細胞)試劑盒(中國普利萊公司)測定細胞內總膽固醇含量，以每毫克蛋白濃度校正膽固醇含量。

1.5 細胞糖原含量測定

將各組細胞用預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3遍，置于-20 ℃冰箱中冰凍后取出，每瓶細胞使用強堿性提取液裂解，其中一部分用于蛋白定量，一部分用于糖原測定。采用蒽酮法測定糖原的含量，利用強堿性提取液提取糖原，在強酸性條件下利用蒽酮顯色劑測定糖原含量，試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.6 RNA的提取和實時定量熒光PCR

采用培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒(Tiangen公司，中國)提取RNA，以RNA為模板利用Fastking一步法RT-PCR試劑盒(天根公司，中國)合成cDNA。采用 Light Cycler 96儀器(Roche公司，美國)檢測RNA的表達情況， 經分析系統(tǒng)進行相關表達的定量。引物序列詳見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7 Western blotting檢測

收集細胞，加入預冷的含有蛋白酶抑制劑混合物(thermo Scientific公司，美國)和磷酸酶抑制劑混合物(thermo Scientific公司，美國)的RIPA緩沖液中裂解提取HepG2細胞蛋白。用BCA蛋白分析試劑盒(碧云天公司)測定樣品蛋白濃度。每個樣本取60 μg總蛋白進行10%(質量分數)的SDS-PAGE電泳，并濕轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride， PVDF)上，用含5%(質量分數)脫脂奶粉的TBST[TBS+0.1%(體積分數)Tween-20]溶液封閉1.5 h，按照1∶1 000用封閉液將一抗稀釋，將孵育了一抗的膜4 ℃搖床過夜。次日TBST漂洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，以肌動蛋白(β-actin) 作為內參，使用增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence， ECL)法和Chemi-Doc Touch凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)顯影成像，并用Image Lab軟件對圖像進行灰度分析。分別計算出葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase， G6pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase， PEPCK)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、乙酰輔酶A羧化酶α(acetyl CoA carboxylase α， ACCα)、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶α(phosphorylated acetyl CoA carboxylase α， p-ACCα)與內參β-actin的吸光度積分值之比分別作為其相對含量值?？笹RP78、CHOP、PEPCK、FAS、β-actin抗體均購自美國Cell signaling technology公司，抗MAS、G6Pase抗體購自美國Abcam公司，抗ACCα、P-ACCα抗體購自美國Santa公司。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 Tg誘導HepG2細胞內質網應激，且上調MAS的表達

用不同濃度的Tg和不同的刺激時間處理HepG2細胞，Real-time PCR檢測內質網應激相關基因和MAS的表達水平。結果顯示，Tg可顯著上調 GRP78和CHOP的表達，同時MAS的表達也顯著增加，在Tg為5 μmol/L，處理12 h，GRP78、CHOP和MAS的表達量達到最大值，且與對照組比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01，P<0.001，P<0.000 1，圖1A， B)。提示5 μmol/L Tg孵育12 h后，可成功構建HepG2細胞內質網應激模型，因而選擇此條件進行后續(xù)實驗。同時，MAS的mRNA表達上調，提示MAS可能參與了內質網應激相關作用。

2.2 MAS腺病毒感染HepG2細胞

經質粒NheⅠ+HindⅢ雙酶切鑒定(圖2A)，陽性克隆可切出975 bp的條帶，將重組質粒進行擴增測序，所得結果與合成序列比對后結果無誤，說明MAS定向插入真核表達載體中。以Ad-mMAS-GFP和Ad-GFP分別感染HepG2細胞，24 h后熒光顯微鏡觀察HepG2細胞熒光強度(圖2B)。采用Real-time PCR及Western blotting分別檢測MAS在HepG2細胞中mRNA及蛋白的表達水平，結果顯示，Ad-mMAS-GFP組MAS的mRNA及蛋白水平與對照組相比明顯上調差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01，圖2C、D)。

2.3 過表達MAS改善Tg誘導的內質網應激及凋亡

為進一步研究MAS對內質網應激和凋亡的保護作用，將HepG2細胞在感染Ad-mMAS-GFP和Ad-GFP后以5 μmol/L Tg處理12 h，以空白細胞為對照。結果顯示，Ad-mMAS-GFP組與Ad-GFP組相比，內質網應激凋亡通路相關基因如葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)、活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)、X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)和肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme-1, IRE1);生長抑制DNA損傷基因34(growth arrest and DNA damage inducible 34， GADD34)和蛋白激酶樣內質網激酶(protein-kinase-like ER kinase，PERK)的mRNA有下調趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(圖3A)；同時促凋亡基因Bax、Caspase-12的mRNA均顯著降低，而抗凋亡基因Bcl-2的mRNA無明顯變化(圖3B)。提示MAS對Tg誘導的HepG2細胞的內質網應激及凋亡有保護作用，并且MAS可能是通過改善細胞內質網應激水平從而減少了HepG2細胞的凋亡。

2.4 過表達MAS改善了Tg誘導的 HepG2細胞的糖脂代謝

為了觀察過表達MAS對肝內糖脂代謝的影響，檢測了HepG2細胞內三酰甘油、總膽固醇及糖原含量。實驗結果顯示，與Ad-GFP組相比，感染Ad-mMAS-GFP組的三酰甘油含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖4A)，而細胞內總膽固醇含量無明顯變化(圖4B)。同時，MAS過表達組細胞內糖原含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖4C)。MAS可能通過改善內質網應激從而減少HepG2細胞內三酰甘油的積累，并且升高細胞內糖原含量。

圖1 毒胡蘿卜素處理HepG2細胞后，細胞中GRP78、CHOP、MAS基因的表達Fig.1 Expression of GRP78， CHOP and MAS genes in cells after treatment with HepG2 cells by thapsigargin

A：relative GRP78,CHOP,MAS mRNA levels following treatment with 0， 2， 5， 8 μmol/L thapsigargin for 0,8,12,24 h;B:relative GRP78、CHOP、MAS mRNA levels following treatment with 5 μmol/L thapsigargin for 0， 8， 12， 24 h.GRP78: glucose regulated protein 78;CHOP: C/EBP-homologous protein;Tg:thapsigargin;**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1vscontrol group，n=4.

圖2 MAS過表達腺病毒轉染HepG2細胞Fig.2 HepG2 cells transfected by MAS overexpressing adenovirus

A：double enzyme digestion identification;1：control;2：PDC316-mCMV-ZsGreen-MASKpnI-EcoRIdouble enzyme digestion identification results;M: Trans2K plus marker；B: HepG2 cells transfected by MAS over-expression plasmid (upper) and Ad-GFP vector (lower);Bar: 100 μm;C： expression of MAS protein in HepG2 cells;*P<0.05vsAd-GFP group，n=3；D: expression levels of MAS gene in HepG2 cells;**P<0.01vsAd-GFP vector group，n=4;Ad-GFP:adenovirus green fluorescent protein;Ad-mMAS-GFP:adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein.

圖3 MAS對HepG2細胞內質網應激及細胞凋亡相關基因的影響Fig.3 Effect of MAS on endoplasmic reticulum stress and apoptosis-related genes in HepG2 cells

A:effect of MAS on endoplasmic reticulum stress genes expression in HepG2 cells;B:effect of MAS on apoptosis genes expression in HepG2 cells;*P<0.05，**P<0.01vsAd-GFP+Tg vector group，n=4;Ad-GFP: adenovirus green fluorescent protein;Ad-mMAS-GFP:adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein;GRP78: glucose regulated protein 78;CHOP: C/EBP-homologous protein;ATF6: activating transcription factor 6;Xbp1: X box-binding protein 1;IRE1: inositol requiring protein 1;GADD34: growth arrest and DNA damage inducible 34;PERK: protein-kinase-like endoplasmic reticulum kinase;Tg:thapsigargin;Bcl-2: B cell lymphoma/lewkmia-2;Caspase-3: cysteine aspartyl protease-3;Caspase-12: cysteine aspartyl protease-12.

2.5 MAS對糖脂代謝相關基因及蛋白表達的影響

為了進一步研究過表達MAS對HepG2細胞的糖脂代謝的影響，在分子水平分別檢測對照組與實驗組糖脂代謝相關基因及蛋白的表達情況。結果顯示，過表達MAS之后，糖異生關鍵酶G6pase、PEPCK和脂質合成相關的FAS、ACCα在蛋白水平表達均下調。同樣，在mRNA水平，過表達MAS組的糖脂代謝相關基因G6pase、PEPCK、FAS、ACCα、肝X受體α(liver X receptor alpha,XLXRα)的表達下調，且差異均有統(tǒng)計學意義。而脂代謝相關的膽固醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol-regulatory element-binding protein 1c， SREBP1c)的表達雖有下調趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。葡萄糖轉運蛋白2(glucose transport 2, Glut 2)及脂肪酸β氧化關鍵酶肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1(carnitine palmitoyl transferase 1 α， CPT1α) 在mRNA水平表達無明顯變化。以上結果表明，MAS可以通過改善內質網應激從而調節(jié)HepG2細胞內糖脂代謝(P<0.05，P<0.01，圖5)。

圖4 MAS對HepG2細胞內的三酰甘油、總膽固醇和糖原含量的影響Fig.4 Effect of MAS on triglyceride， total cholesterol and glycogen content in HepG2 Cells

A:triglyceride content;B: total cholesterol content;C: glycogen content;**P<0.01vsAd-GFP+Tg vector group，n=3;Ad-GFP: adenovirus green fluorescent protein;Ad-mMAS-GFP:adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein;Tg:thapsigargin.

圖5 MAS對HepG2細胞糖脂代謝相關分子表達的影響Fig.5 Effect of MAS on the expression of molecules related to glycolipid metabolism in HepG2 cells

A：relative protein expression levels of p-ACCα， ACCα， FAS， G6pase， PEPCK in HepG2 cells following overexpression of MAS;B： relative mRNA expression levels of G6pase， PEPCK， Glut2 in HepG2 cells following overexpression of MAS;C: relative mRNA expression levels of FAS， ACCα， LXRα， SREBP1c，CPT1α in HepG2 cells following overexpression of MAS;*P<0.05，**P<0.01，n=4;Ad-GFP: adenovirus green fluorescent protein;Ad-mMAS-GFP:adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein;G6pase: glucose-6-phosphatase;PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase;FAS:fatty acid synthase;p-ACCα: phosphorylated-acetyl CoA carboxylase α;Glut2:glucose transporter 2;LXRα: liver X receptor alpha;CPT1α: carnitine palmitoyl transferase 1 α;SREBP1c: sterol-regulatory element-binding protein 1c;Tg:thapsigargin.

3 討論

內質網廣泛存在于真核細胞中，它不僅為細胞內蛋白質的合成、翻譯后的修飾以及折疊提供特定的環(huán)境，還是鈣離子儲存的主要場所，調節(jié)細胞內鈣平衡和鈣介導的信號通路，同時內質網還與膽固醇和磷脂等的代謝直接相關[12]。最近的研究[13]表明，內質網應激參與糖尿病、高血壓、心肌肥厚、動脈粥樣硬化和缺血性心臟病。內質網應激誘導劑通過不同機制誘導內質網應激的發(fā)生，其中，毒胡蘿卜素應用較廣泛。Tg是肌漿網/內質網鈣泵(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase， SERCA)的抑制劑，可抑制鈣離子由細胞質泵入內質網，從而參與鈣離子平衡的調節(jié)和凋亡的發(fā)生[14]。多項研究[15-18]顯示，內質網應激介導的肝細胞凋亡與肝臟損傷以及糖脂代謝異常相關。而2012年，Arumugam等[19]的研究表明坎地沙坦可能是通過激活ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸來調節(jié)內質網應激和其介導的心臟細胞凋亡來阻止擴張型心肌病的進展；2013年，Uhal等[20]報道Ang-(1-7)抑制內質網應激誘導的肺泡上皮細胞的凋亡，提示ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸與內質網應激之間存在相關性。以上研究結果提示，在肝臟中ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸與內質網應激之間也可能存在相關性。

胰島素抵抗是指胰島素的靶器官包括肝臟、脂肪組織、胰島素β細胞等對胰島素的敏感性及反應性降低。胰島素抵抗是導致肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝性疾病的核心病理變化。RAS中的血管緊張素Ⅱ在IR過程中發(fā)揮重要作用，而Ang-(1-7)則發(fā)揮與血管緊張素Ⅱ相反的作用[21-22]。現(xiàn)有研究[23]表明，過表達ACE2可以保護胰腺β細胞免受氧化損傷；Ang-(1-7)改善非酒精性脂肪變性和炎性反應以及肝纖維化和肝臟對胰島素的敏感性[24]；Ang-(1-7)還能抑制氧化應激并通過脂肪細胞中的MAS受體改善葡萄糖攝取[25]。以上這些研究主要是集中在ACE2和Ang-(1-7)上，而Santos等[26]的研究表明，MAS基因缺失的小鼠表現(xiàn)出血脂異常，葡萄糖耐受不良和胰島素敏感性降低以及脂肪細胞對胰島素刺激的葡萄糖攝取的減少和脂肪組織中Glut 4的減少。另一項研究[27]表明，MAS受體的遺傳缺失導致腎小球高濾過和微量白蛋白尿。以上這些研究說明，MAS受體作為關鍵因子，在ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸中發(fā)揮著重要作用。本研究表明，在HepG2細胞中過表達MAS受體，改善了Tg誘導的內質網應激和其介導的細胞凋亡，同時還改善了Tg誘導后HepG2細胞的糖脂代謝，這可能與MAS對內質網應激的保護作用有關。

在本研究中，以MAS過表達載體轉染HepG2細胞，之后用毒胡蘿卜素處理以構建細胞內質網應激模型，在此基礎上，檢測內質網應激相關基因GRP78、CHOP和凋亡相關基因PERK、IRE1、ATF6、Caspase-3以及Caspase-12表達均顯著降低，同時HepG2細胞三酰甘油含量降低，糖原含量升高。而糖異生關鍵酶G6pase和PEPCK、脂質合成相關的FAS和ACCα在mRNA水平和蛋白水平表達均下調。這說明，MAS可能是通過對HepG2細胞中內質網應激的保護作用從而改善HepG2細胞的糖脂代謝。

本研究探討了MAS受體與HepG2細胞糖脂代謝之間的關系，但還存在不足之處：①目前的實驗結果僅在細胞水平，下一步計劃在MAS敲除小鼠及高脂誘導模型鼠上進一步觀察ACE2-Ang(1-7)-Mas軸對肝臟內質網應激及糖脂代謝的影響；②目前，MAS對內質網應激影響的具體機制還不清楚，之后將在線粒體和內質網方面進行進一步研究；③肝臟只是胰島素作用的靶器官之一，下一步將繼續(xù)研究MAS受體在肌肉、脂肪等代謝相關組織器官中發(fā)揮的作用。

綜上所述，本研究結果表明，MAS受體表達上調可以改善HepG2細胞內糖脂代謝，這一過程可能是通過降低內質網應激水平和減少肝細胞的凋亡來實現(xiàn)的。本研究結果進一步明確了MAS在肝細胞糖脂代謝中的調節(jié)作用，并為ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸在改善胰島素抵抗機制中的作用提供了新的思路。