黃芩甙對(duì)慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知功能及其對(duì)海馬內(nèi)LC-3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)的影響

陳玉靜 陳文強(qiáng) 張建新 劉 妍 吳犀翎 王建東 黃小波*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中醫(yī)科，北京市中西醫(yī)結(jié)合老年疾病研究所，北京 100053; 2.山東省夏津縣人民醫(yī)院內(nèi)科，山東德州 253200 )

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)與血管性癡呆(vascular dementia，VD)是老年期認(rèn)知功能損害的兩個(gè)主要臨床類型。慢性腦低灌注是AD與VD共有的重要病理學(xué)基礎(chǔ)[1]，近年研究[2]表明，自噬作為細(xì)胞受到刺激后，通過溶酶體途徑完成自身代謝和細(xì)胞器更新的重要方式，與β-淀粉樣蛋白 (amyloid β-protein， Aβ)的聚集和AD的發(fā)病密切相關(guān)。中藥黃芩為唇形科植物黃芩的根，味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效。黃芩甙是從黃芩的根莖中分離純化得到的一種黃酮類單體化合物，也是黃芩的主要有效成分，黃芩甙具有多種生物活性和功效，如抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜、神經(jīng)保護(hù)、抗凋亡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力以及抑菌作用等[3-4]。本研究通過觀察黃芩甙對(duì)慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)大鼠模型認(rèn)知障礙的改善作用及其對(duì)自噬通路的影響，為開發(fā)治療血管性認(rèn)知功能損害的有效中藥提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，體質(zhì)量(250±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：SCXK京2007-0001)。

1.1.2 藥品及主要試劑

黃芩甙(濃度>95%)購自美國Sigma公司，LC-3Ⅱ和Beclin-1抗體購自美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備、分組及給藥

SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組和黃芩甙低、中、高3個(gè)劑量組，每組各10只。

慢性腦低灌注大鼠模型的建立：參考文獻(xiàn)方法[5]，SD大鼠自購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前禁食，以1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸部備皮，常規(guī)碘伏消毒，頸部正中縱向切口，暴露氣管及胸鎖乳突肌，小心輕柔分離一側(cè)頸總動(dòng)脈與周圍組織、迷走神經(jīng)等，避免拉扯，手術(shù)縫線進(jìn)行血管上下端結(jié)扎后離斷血管，縫合肌肉、筋膜及皮膚后肌注青霉素抗感染。7 d后，結(jié)扎對(duì)側(cè)。對(duì)照組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行結(jié)扎與離斷，保證其他操作相同。術(shù)后l周起給予對(duì)照組、模型組大鼠腹腔注射等滲0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，治療組使用黃芩甙分別按照60、120、240 mg·kg-1·d-1的劑量進(jìn)行腹腔注射，共4周。

1.2.2 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試

參照Morris水迷宮法進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)[6]，歷時(shí)6 d。定向航行實(shí)驗(yàn)評(píng)估空間學(xué)習(xí)能力，空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)估空間記憶能力。在1～5 d進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)，即每日將大鼠在同一象限入水點(diǎn)靠池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠從入水到爬上對(duì)角線象限的站臺(tái)所需時(shí)間和路線，即逃避潛伏期以及搜索距離，每只大鼠訓(xùn)練2次/d。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，即撤去站臺(tái)，將大鼠從原入水點(diǎn)放入水池，記錄120 s內(nèi)大鼠在原站臺(tái)象限游泳的時(shí)間。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)LC-3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)

大鼠斷頭后于冰上取腦，用冷PBS漂洗殘余血后，分離海馬，提取蛋白質(zhì)，定量，用蛋白酶抑制劑將各樣品調(diào)整成等體積含相同蛋白濃度的樣品，配制15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分離膠，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃縮膠， 30 μg蛋白的樣品上樣，100 V電壓電泳75 min，97 V電壓PVDF膜轉(zhuǎn)膜90 min，室溫下封閉1 h，LC-3 Ⅱ(1∶1 000)和Beclin-1(1∶1 000)4 ℃ 過夜，TBST洗5 min×3次，二抗(1∶5 000)室溫下1 h，TBST洗5 min×3次，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、曝光、拍照，分析目標(biāo)帶的相對(duì)分子質(zhì)量和吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芩甙對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

記錄大鼠搜索并找到逃避平臺(tái)的逃避潛伏期及搜索距離，結(jié)果詳見表1和表2。在測(cè)試的5 d內(nèi)所有大鼠的潛伏期都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。自第2天起，模型組較對(duì)照組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，搜索距離增加(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示由于慢性腦低灌注而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降。黃芩甙干預(yù)組自第3天起，逃避潛伏期和搜索距離均較模型組縮短(P<0.05，P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以中、高劑量組更為顯著。

表1 定向航行實(shí)驗(yàn)中各組平均逃避潛伏期比較Tab.1 Comparison of the average escape latency in place navigation test

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group

表2 定向航行實(shí)驗(yàn)中各組游泳距離比較Tab.2 Comparison of the swimming distance in place navigation test

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

觀察撤臺(tái)后大鼠在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間，結(jié)果詳見表3。與對(duì)照組相比，模型組大鼠在原平臺(tái)所在象限搜索時(shí)間縮短(P<0.01)，黃芩甙各劑量組大鼠在原平臺(tái)所在象限搜索時(shí)間均較模型組延長(zhǎng) (P<0.05，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？臻g探索實(shí)驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果表明，黃芩甙在一定程度上可以緩解記憶功能損傷。

表3 各組空間探索實(shí)驗(yàn)比較Tab.3 Results of spatial probe test

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsmodel group

2.2 黃芩甙對(duì)大鼠海馬LC-3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)的影響

模型組中LC-3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。黃芩甙干預(yù)后海馬內(nèi)LC-3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。詳見圖1，表4。

圖1 Western blotting檢測(cè)各組海馬LC-3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)Fig.1 Western blotting expression of LC-3Ⅱ and Beclin-1

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group;1:control group;2: model group;3: low-dose baicalin group;4: medium-dose baicalin group;5: high-dose baicalin group.

表4 黃芩甙對(duì)大鼠海馬LC-3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)的影響Tab.4 Effects of baicalin on expression of LC-3Ⅱ and Beclin-1 in hippocampal of rats

3 討論

隨著生活水平的提高、生活方式的改變以及老齡人口的增多，癡呆與認(rèn)知功能損害的發(fā)病率有增高的趨勢(shì)。AD與VD是老年期認(rèn)知功能損害的兩個(gè)主要臨床類型，近年來大量研究[7-8]顯示，AD和VD患者的影像學(xué)都表現(xiàn)出腦組織低灌注。慢性腦低灌注是一種常見的臨床病理現(xiàn)象，見于多種腦血管疾病的病理發(fā)生過程中，實(shí)驗(yàn)研究[9-10]也顯示慢性腦低灌注可導(dǎo)致多種神經(jīng)遞質(zhì)的失衡，使腦組織發(fā)生神經(jīng)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激，破壞血腦脊液屏障，造成免疫損傷，并且使腦組織處于隱性能量代謝障礙狀況，造成樹突形態(tài)和密度的變化，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。海馬是腦內(nèi)缺血性損傷的最敏感區(qū)域，慢性腦低灌注可能通過多方面來影響海馬的學(xué)習(xí)和記憶過程，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生和發(fā)展。

自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)等有害大分子物質(zhì)的重要途徑。正常老化伴隨著自噬小泡聚集及自噬功能的障礙[11]，在此過程中，Beclin-1啟動(dòng)自噬小體[12]，LC3B參與了自噬形成及成熟過程[13]。LC3-Ⅰ經(jīng)剪切、脂化、與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3B-Ⅱ[14]。自噬泡的形成以LC3B-Ⅱ從膜的外表面釋放為標(biāo)志，LC3B-Ⅱ表達(dá)增加通常被認(rèn)為是自噬泡形成增加、自噬活性增加的證據(jù)[15]。自噬本身具有兩面性，一方面自噬可以清除胞內(nèi)有害和過剩的細(xì)胞器以及病原體，另一方面自噬的過度激活可以導(dǎo)致細(xì)胞的程序性凋亡，從而引起一系列疾病過程[16]。有研究[17]顯示，自噬參與了慢性腦低灌注的發(fā)生，并且在認(rèn)知功能減退之前腦內(nèi)自噬系統(tǒng)就已經(jīng)發(fā)生改變。有文獻(xiàn)[17-18]顯示慢性腦低灌注發(fā)生4周時(shí)，LC-3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)增加，并且自噬泡中富含淀粉樣前體蛋白、Aβ及γ-分泌酶，誘導(dǎo)自噬可引起Aβ增多，因此自噬泡被認(rèn)為是Aβ產(chǎn)生的場(chǎng)所。隨著低灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，自噬持續(xù)激活且降解能力持續(xù)下降，即使腦血流部分恢復(fù)，慢性腦低灌注導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷卻持續(xù)加重。

本研究顯示慢性腦低灌注模型組LC-3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)增多，說明慢性腦低灌注激活了體內(nèi)自噬系統(tǒng)，造成海馬神經(jīng)元損傷；黃芩甙干預(yù)組，自噬標(biāo)志蛋白 LC-3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)量明顯降低，表明黃芩甙可抑制自噬的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)了海馬神經(jīng)元。

近年來研究[19]顯示黃芩甙可直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞，對(duì)出血性、缺血性腦損傷以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性腦損傷具有廣泛的保護(hù)作用，此外，黃芩甙能夠促進(jìn)AD模型大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增生和分化[20]，在神經(jīng)免疫方面，黃芩甙通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活和促進(jìn)腫瘤壞死因子-α和重組人白介素-6的表達(dá)，緩解Aβ1-42帶來的病理損害[21]。本研究應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)、記憶能力的測(cè)試，觀察各組大鼠的認(rèn)知功能狀況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)、跨越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.01)，提示慢性腦低灌注大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力明顯降低。而黃芩甙干預(yù)組大鼠的逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯多于模型組(P<0.05，P<0.01)，提示用黃芩甙干預(yù)能明顯改善慢性腦低灌注大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，猜測(cè)也許與其抑制自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，黃芩甙能夠縮短慢性腦低灌注模型組大鼠找到平臺(tái)的游泳路徑，降低海馬神經(jīng)元自噬標(biāo)志蛋白 LC-3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)，從而對(duì)慢性腦低灌注模型學(xué)習(xí)記憶起到改善作用，是否有其他因素參與了黃芩甙改善認(rèn)知障礙的過程，尚需更深層次的研究。