五種植物源提取物對博物館展廳空氣來源細菌的抑制效果

唐 歡，王 春，周理坤，范文奇

(重慶中國三峽博物館館藏文物有害生物控制研究中心，重慶 400015)

0 引言

長期以來，有機質文物的霉變現(xiàn)象多有發(fā)生，造成文物損毀的情況較為嚴重。因此，關于文物霉菌污染的來源、種類、防治研究一直是文物保護工作者關注的重點之一［1，2］。但與之相對，微生物另一大類群的細菌對于文物所具有的潛在危害并未得到充分重視。近年來，隨著分子微生物學技術的進步與發(fā)展，細菌參與文物劣化的報道日益增多。CAPODICASA等［3］運用多種分子生物學手段結合電子顯微鏡觀察，對古代油畫表面的微生物進行了深入的分析，并以此揭示了油畫表面細菌與真菌的相互關系;L PEZ等［4］利用聚合酶鏈式反應－變性梯度凝膠電泳(Polymerase chain reaction－Denaturing gradient gel electrophoresis，PCR －DGGE)技術結合克隆文庫的構建，研究了油畫表面的細菌與真菌微生物群落，發(fā)現(xiàn)油畫表面來自于空氣氣溶膠中的細菌都具有典型的磷酸酶—萘酚－AS－BI－磷酸水解酶，這類酶能夠參與酯鍵的水解，進而造成有機質文物成分的降解。同時，意大利學者PI AR等［5］對于巴勒莫地下墓穴墻面、木乃伊內外及其填充物的微生物進行了深入分析，發(fā)現(xiàn)大量具有強烈蛋白水解活性及纖維素分解活性的細菌，而這些細菌不僅參與了文物的劣化過程，而且與文物材質的變色直接相關?？梢?，文物展覽和保存環(huán)境中的細菌污染問題正逐步凸顯。

除了對文物所處環(huán)境中細菌與文物的作用過程研究較為缺失外，對于文物展存環(huán)境中空氣微生物凈化措施的研究更是極其有限。隨著文物預防性保護理念的深入和相關工作的推廣實施，目前對于多種館藏文物的特征污染物，如甲醛，可使用基于殼聚糖高分子材料制成的高效凈化材料進行吸附;甲酸、乙酸，可通過無酸材料的使用逐步進行控制;對展陳環(huán)境中的總揮發(fā)性有機化合物(Totla volatile organic compound，TVOC)，則可通過包覆鋁塑膜封閉處理的方式以降低其對文物的損傷。但對于展廳、展柜內廣泛存在的微生物，則缺乏有效手段對其進行凈化調控。使用傳統(tǒng)的化學藥劑(如環(huán)氧乙烷、溴甲烷等)熏蒸雖可有效防治館藏有機質地文物上的有害生物，但其對環(huán)境和人體的安全性備受爭議。

植物源提取物(Plant－derived extracts)包括從植物中提取的活性成分和按活性結構合成的化合物及衍生物，具有高效環(huán)保、通常被認為是安全(General recognized as safe，GRAS)、殺蟲滅菌效果顯著等特點［6－8］?？諝鈨艋?，吳慧清等［9］的研究表明植物精油型空氣殺菌劑對空氣微生物的清除效果可達到消毒指標要求，林雅慧等［10］利用復合香辛料精油自然揮發(fā)可殺滅及抑制空氣中大部分細菌;文物保護上，上海博物館利用蒜素作為文物入庫前的消殺熏蒸劑進行文物除菌防霉處理。上述研究結果與實踐案例顯示植物源提取物作為博物館內人與文物適用的空氣凈化劑具有一定可行性。

綜上，本研究擬利用活菌計數法和PCR－DGGE技術，評價5種植物源提取物在不同熏蒸劑量下對博物館展廳內采集到的空氣細菌的抑制效果，以期為博物館文物展陳環(huán)境內的空氣微生物控制篩選更多安全有效、對人對文物友好的凈化劑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

空氣微生物中的細菌培養(yǎng)計數使用營養(yǎng)瓊脂平板(重慶龐通醫(yī)療器械有限公司)進行培養(yǎng)檢測，細菌總菌DNA使用QIAampDNA Mini Kit(QIAGEN)提取;Taq DNA聚合酶為上海生工產品;實驗中使用的香葉油、香茅醇、香茅醛、芳樟醇、檸檬醛購自重慶日用化學工業(yè)研究所，其中香葉油是混合物，為水蒸氣蒸餾精制而得;香茅醇、香茅醛、芳樟醇和檸檬醛全部為合成單體，香茅醇含量是95%，香茅醛的含量為96%，芳樟醇含量為98%，檸檬醛含量為97%。

1.2 主要儀器設備

生化培養(yǎng)箱(SPX－250B型，上海躍進)，PCR儀(C1000型，Bio－Rad)，核酸定量儀(Nano Drop 2000C型，Thermo)，凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+型，Bio－Rad)，變性梯度凝膠電泳儀(DCodeTMUniversal Mutation Detection System，Bio－Rad)，空氣浮游菌采樣器(ZR2050型，青島眾瑞)。

1.3 實驗方法

1．3．1 空氣微生物采樣 采樣時間為2017年5月13日，采樣地點為重慶中國三峽博物館的壯麗三峽展廳，采樣方法為撞擊法(參照國家標準 GB/T 18883—2002《室內空氣質量標準》進行，采樣流量為10 L/min，采樣時長10 min)。采集后的平板置于手提式冷藏箱內迅速帶回實驗室。

1．3．2 平板表面熏蒸抑菌實驗 用6 mm打孔器在定性濾紙上打出圓形濾紙片，121℃滅菌20 min后烘干備用。帶回實驗室的平板置于超凈工作臺上，將圓形濾紙片置于平板蓋中心，分別在濾紙上滴加不同劑量的植物源提取物，對照組則滴加對應劑量的無菌生理鹽水［4］，每組做3個重復。將處理后的平板用封口膜封口，倒置于生化培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)48 h，密封熏蒸。計數后，取各組菌落數最多的一個平板，用無菌去離子水充分沖洗菌落，凍存于－20℃準備進行細菌總DNA提取。

1．3．3 空氣微生物總菌DNA提取 細菌總DNA參照試劑盒操作說明進行提取，并由核酸定量儀測定DNA樣品濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1．3．4 PCR － DGGE 分析［11］5 種植物源提取物平板表面熏蒸后的細菌多樣性變化使用16SrRNA基因V3區(qū)作為靶標進行PCR－DGGE分析。第一次PCR擴增引物序列為 V3－341f(5’－GTATTACCGCGGCTGTGG－3’)和 V3－GC Clamp－534r(5’－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG －CACGG －GGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG －3’)，引物由上海生工公司合成。PCR擴增體系為25 μL，其中模板量10 ng，10 ×Taq 緩沖液(Mg2+plus)2.5 μL，dNTP 1 μL(each 10 mmol/L)，Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，濃度為10 μmol/L 的上、下游引物各 0.5 μL，加無菌雙蒸水補至終體積25 μL。PCR循環(huán)條件為:94℃預變性4 min;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min。

獲得PCR產物后，為了去除引物二聚體對DGGE的影響，再按照 XIONG等［12］的方法進行復原條件PCR:取第一次PCR產物5 μL為模板，終體系為25 μL，循環(huán)5次，其他條件與第一次PCR的條件相同。

DGGE操作按照DCode System的儀器說明書進行操作，電泳方法參照 MUYZER［13］和 WALTER等［14］的文獻，V3區(qū)PCR產物的變性梯度設置為35%～65%，聚丙烯酰胺濃度為8%。在200 V電壓條件下電泳4 h后，用SYBR greenI染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，圖像由Quantity One(Bio－Rad)軟件進行分析。

對于需要測序的特殊條帶，用無菌刀片將之由DGGE膠上切割下來并用槍頭搗碎，以1×Taq緩沖液(Mg2+plus)4℃浸泡過夜，取浸泡液為模板經二次PCR并跑膠，確認與原條帶位置相同后，外送上海生工公司測序［15－16］，序列同源性通過在GenBank進行BLAST比對，網址為 www．ncbi．nlm．nih．com。

1．3．5 數據處理 展廳空氣來源細菌菌群多樣性分析包括豐富度(richness，S)和加權多樣性 H'。DGGE圖像由Quantity One(Bio－Rad)軟件進行分析，該軟件自動獲取每條泳道內的條帶數、條帶位置信息及亮度峰值數據，進而進行相似性、多樣性分析。S表示DGGE圖譜每個垂直泳道內的條帶數，H'的計算方法為 H'= －∑PilnPi，其中，Pi=ni/N，代表第i條帶的吸光度(ni)與該泳道所有條帶吸光度總和(N)的比值［17］。

統(tǒng)計學分析使用SPSS PASW statistics 18.0軟件，組間比較使用Oneway ANOVA進行，P＜0.05為統(tǒng)計學上有顯著差異，P＜0.01為統(tǒng)計學上極顯著差異。

2 結果與討論

2.1 平板內氣相熏蒸前后展廳空氣來源微生物數量的比較

表1顯示了5種植物源提取物在3個不同熏蒸劑量下對于展廳空氣來源細菌數量的抑制結果。首先，活菌計數結果顯示展廳內空氣微生物總菌落數基本穩(wěn)定在219～253 CFU/m3的水平中，與前期研究結果相吻合［18］。其次，與對照組相比，5種受試植物源提取物對于空氣來源細菌的數量呈現(xiàn)不同程度的抑制。

使用5 μL香葉油進行平板內熏蒸，活菌數與對照組相比無顯著性差異(P=0.054＞0.01)，而其他4種植物源提取物在5 μL劑量下均對細菌產生極其顯著的抑制。從組間數據比較的統(tǒng)計學結果可見，抑菌效果最好的是檸檬醛，其次是香茅醇和芳樟醇，而效果最弱的是香葉油，略弱是香茅醛。

另外，以檸檬醛為例，在使用熏蒸劑量為5 μL時，平板內生長的菌落總數極顯著少于對照組(P=0.003＜0.01)，當熏蒸劑量為20 μL時，熏蒸組的平板中平均只生長了3.33個菌落，檸檬醛對空氣來源細菌的抑制作用極其有效(P=0.000＜0.001)，可見其抑菌效果隨使用劑量增加而愈發(fā)明顯。

古希波等［19］利用一種植物消毒劑對空氣中白葡萄球菌進行氣溶膠噴霧消毒后，活菌計數結果顯示其平均殺滅率超過99%，吳慧清等［9］研制的液體復方精油對空氣微生物的平均消殺效果也可達到99.93%，以0.1 mL/m3的濃度經加熱熏蒸，空氣微生物總量從熏蒸前的平均24 954 CFU/m3下降到平均13 CFU/m3。本研究中，使用20 μL香茅醇、芳樟醇、檸檬醛熏蒸后的平均除菌率分別為98.53%，97.95%，98.53%，也具有較好的除菌抑菌效果。

表1 不同劑量植物源對展廳空氣來源細菌的數量抑制Table 1 Quantitative inhibition of airborne bacteria in the exhibition hall by different doses of plant－derived compounds(n=3，珋±s)(CFU/m3)

表1 不同劑量植物源對展廳空氣來源細菌的數量抑制Table 1 Quantitative inhibition of airborne bacteria in the exhibition hall by different doses of plant－derived compounds(n=3，珋±s)(CFU/m3)

注: 與對照組比較，*P ＜0．05;＊＊P ＜0．01;＊＊＊P ＜0．001。與檸檬醛組相比，△P ＜0．05;△△P ＜0．01;△△△P ＜0．001。

5 μL 10 μL 20 μL對照組 219.33±56．15△△ 253．33±20．82△△△ 227．33±5．03△△△香葉油 174．67 ±70．47△ 65．00 ±35．34＊＊＊△ 19．33 ±14．50＊＊＊△△香茅醇 104．00 ±18．33＊＊ 5．67 ±2．31＊＊＊ 3．33 ±0．58＊＊＊香茅醛 109．33 ±10．07＊＊ 81．33 ±22．03＊＊＊△△ 15．33 ±1．53＊＊＊△芳樟醇 110．67 ±19．73＊＊ 33．67 ±15．50＊＊＊ 4．67 ±1．53＊＊＊檸檬醛 98．67 ±29．48＊＊ 23．00 ±13．11＊＊＊ 3．33 ±1．53＊＊＊

2.2 平板內氣相熏蒸前后展廳空氣來源細菌多樣性的比較

PCR－DGGE本身是建立在不依賴于培養(yǎng)的條件下，可快速、高效、直觀研究微生物群落多樣性、群落變化動態(tài)以及群落微生物組成的分析技術，研究者通過對PCR－DGGE圖譜上的特定條帶進行回收測序可以快速進行菌種鑒定［20］。本研究利用PCR－DGGE這個特點，在培養(yǎng)平板內，將不同種類植物源提取物在不同熏蒸劑量下對空氣來源微生物的抑制能力可視化、直觀化，并進一步通過差異條帶比較、互補的方法，為下一步的植物提取物復配提供直接證據。

3種劑量植物源于平板內氣相熏蒸后，展廳空氣來源細菌在PCR－DGGE圖譜上，自左至右共16個泳道(lane)，分別顯示的是對照組(lane 1)、香葉油(lane 2～4)、香茅醇(lane 5～7)、香茅醛(lane 8～10)、芳樟醇(lane 11～13)和檸檬醛(lane 14～16)。5種植物源以5，10，20 μL的劑量熏蒸處理后，空氣中的細菌呈現(xiàn)的種類變化見圖1。PCR－DGGE圖譜結果表明:不同種類的植物源如同抗生素一樣具有不同的抗菌譜，同種植物源不同劑量的熏蒸處理，能夠抑制的空氣內細菌種類也存在差異。

對PCR－DGGE圖譜條帶信息進行進一步分析可見，5種植物源提取物熏蒸后細菌PCR－DGGE條帶的豐富度和多樣性發(fā)生變化(表2)。與對照組相比，條帶數(豐富度)下降最大的是泳道13，即20 μL芳樟醇熏蒸后，展廳空氣來源的細菌的種類下降最多，條帶數由15條下降至4條，其次是20 μL香茅醛和檸檬醛熏蒸組，條帶數均減少至5條。該結果表明，與香葉油和香茅醇相比，芳樟醇、香茅醛和檸檬醛的熏蒸可以清除更多種類的細菌，即抗菌譜更廣。同時，多樣性指數降幅最大的是20 μL檸檬醛熏蒸組，H'從對照組的2.31下降到1.18。多樣性指數除說明種類數量信息之外，還可反映某種類在整個微生物群落中所占的比例，因此，經20 μL檸檬醛的熏蒸處理后，展廳空氣中采集到的細菌其種類和對應數量均降幅最大。

表2 不同劑量植物源熏蒸后展廳空氣中細菌豐富度和多樣性指數Table 2 Richness and diversity index of airborne bacteria in the exhibition hall fumigated by different doses of plant－derived compounds

通過SPSS的比較分析(圖2～3)，與對照組相比，經過10 μL及20 μL植物源提取物熏蒸后，平板中的細菌豐富度極其顯著地下降(P=0.004＜0.01，P=0.001 ＜0.01)，但10 μL 植物源提取物熏蒸不會顯著降低細菌的多樣性指數，僅20 μL組可以起到顯著的效果(P=0.011＜0.05)。上述結果說明，使用20 μL的植物源對展廳空氣中采集到的細菌進行平板內的氣相熏蒸，可以起到顯著減少細菌種類及其對應數量的作用。

進一步針對目的條帶的測序分析結果見表3。條帶8經測序比對與一株瓦式葡萄球菌(Staphylococcus warneri)的相似性為100%，該條帶在每個泳道內均存在，說明5種植物源提取物在3個實驗劑量下的熏蒸均不能抑制其生長。而條帶1，3，4，7也幾乎貫穿每個PCR－DGGE泳道，說明通過植物源提取物的熏蒸也較難使其失去活性，通過測序結果可以發(fā)現(xiàn)，它們分別是肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus，相似性 100%)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus hominis，相似性100%)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，相似性100%)、輕型鏈球菌(Streptococcus mitis，相似性100%)。但香茅醇的熏蒸可以抑制肺炎鏈球菌(條帶4)及輕型鏈球菌(條帶7)的生長，因為在10 μL或20 μL香茅醇熏蒸后，PCR－DGGE圖譜泳道內未出現(xiàn)其對應條帶。類似地，20 μL芳樟醇或檸檬醛處理可抑制一株肉葡萄球菌(條帶1)的生長，但若降低熏蒸劑量至10 μL，則抑制效果消失。條帶11代表一株鏈球菌屬(Streptococcus sp．，相似性 100%)，對香葉油處理不敏感，而芳樟醇和檸檬醛的高劑量處理可以有效抑制其生長。

表3 PCR－DGGE條帶測序比對結果Table 3 Results of the PCR－DGGE sequencing

此外，檸檬醛熏蒸后，PCR－DGGE膠上反應出來的主要條帶數為5條，對這5個條帶割膠測序的結果顯示，它們分別是條帶7(Streptococcus mitis，相似性100%)、條帶3(Staphylococcus hominis，相似性100%)、條帶 8(Streptococcus pneumoniae，相似性100%)、條帶 4(Streptococcus pneumoniae，相似性100%)和條帶13(Micrococcus lactis，相似性100%)，該結果表明，20 μL的檸檬醛熏蒸對于這5種細菌沒有滅菌作用，但是對于其他種類的細菌，則該劑量的檸檬醛熏蒸處理可以完全抑制其生長。

同時，DGGE圖譜對于植物提取物的復配種類與劑量也有直觀的指導作用，如本結果中，20 μL的香茅醇與20 μL檸檬醛復配可起到較好的互補作用:檸檬醛無法完全抑制的條帶4(Streptococcus pneumoniae)可由香茅醇進行抑制，而香茅醇無法完全抑制的條帶1(Staphylococcus carnosus)可由檸檬醛抑制。二者進行復配，可能對這兩株菌起到抑制作用。

在空氣中細菌的群落組成上，對DGGE圖譜上特異條帶的測序結果表明，展廳內主要的細菌以多種球菌和桿菌為主，與 GA Z RE 等［21］對盧浮宮、LECH 等［22］對 Krakow 博物館、武望婷等［23］對首都博物館展廳空氣微生物的研究結果一致。

本研究使用的5種植物提取物中，只有香葉油是混合物，雖然不同產地、不同季節(jié)產的香葉油其成分存在一定差異，但主要成分以香茅醇、香葉醇和芳樟醇等為主。我國云南產香葉油香茅醇含量最高，可達40% ～49%［24］。實驗結果顯示，作為香葉油主要成分的香茅醇、芳樟醇抑菌效果均優(yōu)于香葉油，一方面，說明二者可能是香葉油的主要抑菌成分;另一方面，說明實驗用香葉油中，二者的含量不高。此外，綜合對細菌數量和種類的抑制結果，檸檬醛對展廳內空氣內的細菌抑制效果最好。檸檬醛對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、綠膿桿菌的抑菌活性多有報道［25－26］，本研究也顯示檸檬醛對一株肉葡萄球菌具有良好的抑制作用，其抑菌機制可能與增高細菌細胞膜的相對滲透率、破壞細菌細胞膜有關［27］。

除了考慮植物源對細菌抑制的有效性外，在其使用過程中對文物的安全性也極其值得關注。通常，文物用熏蒸劑的使用需要充分考慮其對文物本底材質及顏料等的作用［28］，陳元生等［29］研究了中藥防霉劑CI、OI和LI對46種霉菌的抑制作用，同時發(fā)現(xiàn)在試驗期內，3種植物成分對于竹、木、漆、角、紙張和顏料等未產生影響;王克華等［30］的實驗表明，香茅醛的熏蒸不會顯著改變紙張及顏料的顏色，而檸檬醛和肉桂醛則對紙張及顏料都存在一定程度的影響?？梢?，不同的植物源對于多種材質的文物本底可能存在不同程度的影響，關于殘留的作用尚待開展長期且深入的研究。鑒于植物源對于文物本底的作用尚未明確，本研究僅從預防性保護要求文物保存環(huán)境“潔凈、穩(wěn)定”的角度，重點評價了植物源作為展廳空氣微生物凈化劑的效果，以期通過“潔凈”文物展陳的小環(huán)境，為展廳內陳列的文物免受微生物危害提供第一層保障。

3 結論

本研究選用5種植物源提取物對博物館展廳內采集的空氣微生物進行了平皿內的氣相熏蒸處理，綜合對細菌的數量及種類抑制，抑菌效果最好的植物源提取物為檸檬醛，其次為香茅醇、芳樟醇、香茅醛，抑菌效果最弱的為香葉油，同時，PCR－DGGE結果提示，檸檬醛和香茅醇的復配可進一步提高抑菌效果。實驗表明，植物源提取物抑菌效果良好，加之其氣味芳香溫和，易于被公眾接受，可作為博物館展廳內的空氣微生物凈化劑予以進一步的研究與應用。