1 875例孕婦產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷結(jié)果與產(chǎn)前診斷指征分析

龍喜貴 覃婷 莫偉英 伍欣 張鵬 田矛

廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心（南寧530021）

產(chǎn)前診斷是預(yù)防出生缺陷的主要手段。目前，國內(nèi)外針對(duì)產(chǎn)前診斷中胎兒染色體異常/畸變檢測(cè)以G 顯帶核型分析、拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）檢測(cè)及快速產(chǎn)前檢測(cè)，如熒光定量PCR（QF-PCR）及熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測(cè)為主。G 顯帶核型分析是目前產(chǎn)前診斷細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)5～10 Mb 以下的小片段的染色體CNV 缺乏診斷能力。全基因組拷貝數(shù)變異檢測(cè)（CNV-sequencing，CNV-seq）可檢測(cè)染色體非整倍體以及100 kb 以上CNV 導(dǎo)致的疾病，但不能檢測(cè)染色體易位及倒位等平衡變異。美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)（ACOG）已推薦其可作為胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)診斷評(píng)估的一線檢測(cè)方法［1］。FISH［2］及QF-PCR［3］通常只作為對(duì)胎兒常見染色體（13、18、21、X、Y）的非整倍體快速篩查。本研究通過聯(lián)合應(yīng)用需細(xì)胞培養(yǎng)的染色體核型分析及不需細(xì)胞培養(yǎng)的高通量測(cè)序CNV-seq，探討了1 875例胎兒中不同產(chǎn)前診斷指征、不同取材及不同檢測(cè)方法下的染色體異常檢出率及差異，特別比較及討論了兩種方法在診斷染色體嵌合體上的差異及處理原則。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集自2016年1月至2018年8月因不良孕產(chǎn)史、高齡、單基因病攜帶、母血清篩查高風(fēng)險(xiǎn)、母血中胎兒游離DNA 檢測(cè)（non-invasive prenatal test，NIPT）高風(fēng)險(xiǎn)、超聲軟指標(biāo)異常［如胎兒頸部透明帶（nuchal translucency，NT）增厚、鼻骨缺失、腸管回聲增強(qiáng)、側(cè)腦室臨界、腎盂輕度分離等］、超聲胎兒結(jié)構(gòu)異常、胎兒生長受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）、附屬物異常等高危因素作為產(chǎn)前診斷指征，接受侵入性產(chǎn)前診斷取材，取材培養(yǎng)成功的產(chǎn)前診斷標(biāo)本共1 875例，其中根據(jù)不同孕周，分別進(jìn)行經(jīng)腹絨毛活檢169例、羊水取材1 435例、臍靜脈取樣271例。

1.2 研究方法羊水穿刺、臍帶血穿刺及絨毛活檢3種取材均在超聲定位引導(dǎo)下進(jìn)行。染色體核型分析由我院細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室完成，取材后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片及G 顯帶核型分析，使用Zeiss AxioImagerZ2 全自動(dòng)染色體遺傳分析系統(tǒng)（德國），顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)20個(gè)分裂象，分析5個(gè)核型，發(fā)現(xiàn)異常核型后則加大計(jì)數(shù)至50～100個(gè)細(xì)胞；CNV-seq 外送至湖南家輝遺傳?？漆t(yī)院，使用Illumina NEXT SEQ CN500 高通量測(cè)序儀（中國），通過二代測(cè)序法檢測(cè)。全部結(jié)果經(jīng)匯總產(chǎn)前診斷指征、超聲結(jié)果、染色體核型及CNV 結(jié)果等信息進(jìn)行分析。染色體核型分析根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體系（ISCN2016）進(jìn)行命名，CNV 致病性判讀根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。侵入性產(chǎn)前診斷取材，送檢檢測(cè)方法均遵守廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的要求，所有孕婦術(shù)前常規(guī)進(jìn)行咨詢并簽署知情同意書，結(jié)果出具后復(fù)診及咨詢。

2 結(jié)果

2.1 染色體及CNV 異常檢出率1 875例接受產(chǎn)前診斷的孕婦中，總共確診致病性染色體和致病性CNV 179例，異常檢出率9.55%。其中單獨(dú)致病性染色體檢出159例，異常檢出率8.48%（159/1 875）。檢出染色體多態(tài)88例（4.69%），染色體平衡易位10例（0.53%）；單獨(dú)致病性CNV 檢出144例，異常檢出率7.68%（144/1 875）。同時(shí)，檢出意義不明CNV 82例（4.37%），多態(tài)性CNV 89例（4.75%）。見表1。

表1 1 875例產(chǎn)前診斷胎兒染色體及CNV 異常與多態(tài)檢出率Tab.1 The detection rates of chromosome and CNV abnormalities and polymorphisms in 1 875 prenatal diagnosis fetuses

2.2 各高危指征異常檢出率各指征中，NIPT 高危、胎兒心臟異常、胎兒NT 增厚和鼻骨缺失的異常檢出率較高，分別為10.71%（3/28）、41.57%（37/89）、19.72%（14/71）、26.89%（32/119）及15.38%（6/39）。此外，高齡、單臍動(dòng)脈、羊水異常及IVFET 術(shù)后異常檢出率分別為7.69%（64/832）、13.04%（6/46）、7.89%（3/38）及8.22%（6/73）。見表2。

2.3 染色體正常核型及多態(tài)性核型中不同CNV的檢出情況90例染色體多態(tài)性核型的胎兒中，CNV-seq 發(fā)現(xiàn)2例致病性（2.22%）及8例臨床意義不明CNV（8.89%）；1 624例染色體核型正常的胎兒中，CNV-seq 檢出16例致病性CNV（0.99%）及74例臨床意義不明CNV（4.56%）。見表3。

2.4 兩種檢測(cè)方法對(duì)染色體嵌合的檢出情況共檢出異常染色體嵌合狀況16例，其中2例染色體核型分析正常，但CNV 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1例為18 三體嵌合，1例為X 染色體單體嵌合，嵌合比例約占1/3；2例CNV 檢測(cè)未見異常，但染色體核型發(fā)現(xiàn)X 單體嵌合。其余12例嵌合情況一致，但嵌合比例存在差異。見表4。

2.5 染色體三體及性染色體異常核型檢測(cè)率3種取材染色體核型分析及CNV-seq 共檢出常見染色體三體/及性染色體異常127例，包括6例13-三體、28例18-三體、51例21-三體、12例45，X、6例47，XXX、7例47，XXY 及4例47，XYY等，檢出率為6.77%（127/1 875）。見表5。

表2 各高危指征及異常檢出率Tab.2 The detection rates of high-risk indications

表3 正常及多態(tài)染色體核型中不同CNV的檢出情況Tab.3 The detection of different CNVs in normal and polymorphic karyotypes 例（%）

3 討論

產(chǎn)前診斷是防控出生缺陷的有力舉措。通常，除部分明顯的胎兒畸形或結(jié)構(gòu)異常可通過超聲等得以診斷外，大部分需通過侵入性取材進(jìn)行產(chǎn)前診斷以避免缺陷患兒出生。本研究回顧性分析了1875例有產(chǎn)前診斷指征的孕婦在超聲引導(dǎo)下，根據(jù)孕婦情況及孕周分別選擇絨毛活檢、羊膜腔穿刺或臍帶血穿刺，取材后行胎兒染色體核型分析和/或CNV-seq 檢測(cè)，比較了不同指征的胎兒染色體異常檢出率。

與傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析相比，超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒畸形的情況下行CNV 檢測(cè)可提高致病性CNV 或臨床意義不明CNV的檢出水平［1，4］。在一項(xiàng)針對(duì)1 033例超聲提示胎兒畸形的研究中，致病性CNV的檢出率為5.5%［5］。本研究中，總的異常檢出率9.55%。其中單獨(dú)染色體核型異常檢出率為8.48%，單獨(dú)致病性CNV 異常檢出率為7.68%。減去染色體核型分析能發(fā)現(xiàn)的異常外，CNV-seq 可額外發(fā)現(xiàn)約1.07%的異常（微缺失、微重復(fù)），與報(bào)道類似［6］，說明染色體核型分析聯(lián)合CNV-seq技術(shù)一定程度上提高了異常檢出率，可為遺傳咨詢及再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供更多的依據(jù)。但需進(jìn)行檢測(cè)前咨詢或產(chǎn)前診斷前咨詢，從而使患者有機(jī)會(huì)了解CNV檢測(cè)技術(shù)的益處及局限性，并根據(jù)他們的個(gè)人信仰和實(shí)際情況做出是否進(jìn)行檢測(cè)的決策［7-8］。本研究中常見的指征是高齡，占總穿刺人數(shù)的44.37%，可能與目前生育年齡整體偏晚及“二孩”政策開放有關(guān)，異常檢出率為7.69%，與國內(nèi)研究［9］結(jié)論相近。其次為不良孕產(chǎn)史和母血清學(xué)篩查高危等，這可能與生育觀念改變及血清學(xué)篩查的常規(guī)應(yīng)用有關(guān)。

表4 染色體核型嵌合檢出情況Tab.4 The detection of chromosome mosaics

表5 染色體三體及性染色體異常核型檢出率Tab.5 The detection rates of autosomal trisomy and sex chromosome anomalies

NIPT 因常見染色體非整倍體近100%的敏感性和特異性使其成為快速應(yīng)用的基因檢測(cè)之一。本研究中，NIPT 總體高危的染色體異常檢出率最高，說明了NIPT技術(shù)的陽性預(yù)測(cè)值較高，展示了NIPT 良好的應(yīng)用前景。但尚有不少比例為假陽性，這與我們分析統(tǒng)計(jì)時(shí)將NIPT 提示性染色體異常及相關(guān)附加提示（其他染色體或CNV 異常）都包括在內(nèi)有關(guān)，這提示我們NIPT 高危后進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷的必要性。最近一項(xiàng)針對(duì)2 779個(gè)胎兒的研究發(fā)現(xiàn)，報(bào)告異常的CNV 結(jié)果中約有50%無法通過標(biāo)準(zhǔn)NIPT 檢測(cè)到（即不涉及21、18、13-三體，X 單體或性染色體三體）［10］。造成NIPT 結(jié)果不一致的原因眾多，限制性胎盤嵌合體、母體CNV、雙胎之一消失、母體癌癥及真正的胎兒嵌合等是最常見的原因［11］。NT 增厚與染色體核型異常、胎兒先天性心臟病及其他結(jié)構(gòu)畸形高度相關(guān)，當(dāng)NT 厚度≥3.0 mm，胎兒致病性CNV 檢出率可達(dá)7.69%［12］。本研究中NT 增厚的異常檢出率為26.89%，異常檢出率較高，可能與樣本數(shù)較少及計(jì)算時(shí)包括了染色體異常有關(guān)。ACMG 對(duì)CNV 評(píng)估及臨床解讀是根據(jù)CNV 是否相鄰或位于已知綜合征區(qū)域，CNV 涉及區(qū)域內(nèi)的基因及其突變的性質(zhì)與大小等進(jìn)行。根據(jù)此CNV的判讀原則，本研究在1 714例染色體多態(tài)或正常的孕婦中檢出18例致病性CNV，說明CNV-seq技術(shù)具有更高的靈敏度和特異性。有研究認(rèn)為年齡小于36歲的孕婦患致病性CNV的風(fēng)險(xiǎn)高于唐氏綜合征［13］。這說明不管高齡與否，常規(guī)開展CNV-seq 檢測(cè)具有必要性。本研究意義不明CNV 檢出率較高，可能本研究中樣本來源皆為具有產(chǎn)前診斷指征的高危孕婦有關(guān)。檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的臨床意義不明CNV 因報(bào)道的變異與表型之間的相關(guān)性或證據(jù)不足，無法有效將變異與胎兒的異常表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)。這些臨床意義不明CNV 給臨床診斷及遺傳咨詢帶來了不小壓力。對(duì)于新發(fā)的臨床意義不明CNV，ACMG 建議對(duì)患者出生后進(jìn)行隨訪［14］。

研究表明［15］胚胎分裂期嵌合率約為15%～90%。相對(duì)于常規(guī)核型分析，CNV-seq 不需要細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)分裂期及未分裂期細(xì)胞均可檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)16例染色體嵌合體異常，其中2例染色體核型檢測(cè)正常，但CNV 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1例為18-三體嵌合，1例為X 染色體單體嵌合，可能與核型細(xì)胞培養(yǎng)過程中，正常細(xì)胞相對(duì)異常細(xì)胞具有生長優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過培養(yǎng)后嵌合情況往往會(huì)降低不容易被檢出有關(guān)，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)2例CNV-seq 檢測(cè)未見異常，但染色體核型分析發(fā)現(xiàn)為X 單體嵌合，這可能與離體培養(yǎng)時(shí)異常細(xì)胞得到擴(kuò)增或母體細(xì)胞污染有關(guān)。其余12例嵌合情況一致，但嵌合比例存在差異。這提示因不同方法靈敏度及是否經(jīng)過培養(yǎng)等差異，檢測(cè)的嵌合比例不可避免存在差異。通常，CNV-seq技術(shù)對(duì)嵌合體的診斷相對(duì)于核型分析具有更高的準(zhǔn)確性和真實(shí)性，這提示筆者在遇到產(chǎn)前診斷嵌合的情況時(shí)，需結(jié)合超聲及多個(gè)平臺(tái)的結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并建立特殊病例討論制度。做到“準(zhǔn)確”診斷，有效咨詢。21、18、13-三體及性染色體非整倍體是導(dǎo)致出生缺陷的常見原因。本研究中，三種取材共檢出常見染色體三體/及性染色體異常127例，檢出率為6.77%。21、18、13-三體總計(jì)85例，以21-三體最多，占60%。這提示我們對(duì)常見三體綜合征及性染色體異常的產(chǎn)前診斷工作依然是重點(diǎn)，需謹(jǐn)慎全面，診斷有力有效。

綜上所述，本研究通過聯(lián)合應(yīng)用染色體核型分析及CNV-seq技術(shù)，較為詳細(xì)地闡述了不同指標(biāo)及不同方法下異常染色體的檢出率，特別分析了兩種方法對(duì)染色體嵌合體的檢出比例差異，有效改善了產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性，阻斷了異常胎兒的出生。但檢出的眾多臨床意義不明CNV 使得產(chǎn)前診斷的臨床咨詢更具復(fù)雜性及挑戰(zhàn)性。本研究的不足在于樣本量偏小，部分指標(biāo)的分析易受樣本量的影響。隨著進(jìn)一步診斷及研究，樣本量增大后這一問題將得到解決。鑒于染色體平衡易位通常不產(chǎn)生病理表型，是否平衡易位核型胎兒不需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷選擇？在常規(guī)染色體核型分析不能診斷平衡易位產(chǎn)生的斷裂或融合致病基因的前提下，G 顯帶核型分析是否逐漸失去了檢測(cè)的意義？是否可完全被CNV 檢測(cè)取代？隨著技術(shù)的不斷發(fā)展終將得到解決。