微綠球藻(Nannochloropsis oculata)培養(yǎng)基的優(yōu)化

韓福光 ，王 珺 ，2，林秋露 ，王 茜，2

（1.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 海口 570228；2.海南大學(xué)海洋生物試驗教學(xué)中心，海南 ?？?570228）

【研究意義】微綠球藻（Nannochloropsis oculata），也稱眼點擬微球藻，屬于綠藻門綠藻綱四孢藻目膠球藻科微綠球藻屬，是一種海洋單細(xì)胞餌料微藻［1］。微綠球藻細(xì)胞營養(yǎng)豐富，繁殖迅速，容易培養(yǎng)，常作為水產(chǎn)動物人工育苗的優(yōu)質(zhì)餌料。目前微綠球藻已經(jīng)應(yīng)用于刺參（Stichopus japonicus）［2］、合浦珠母貝（Pinctada fucata）［3］、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）［4-5］、 中華絨螯蟹（Spirulina platensis）等水產(chǎn)動物的育苗［6］及輪蟲培養(yǎng)［7-9］，應(yīng)用效果均較好。優(yōu)化微綠球藻的培養(yǎng)基，可以提高其生長速率，降低生產(chǎn)成本。【前人研究進(jìn)展】已有學(xué)者進(jìn)行了提高微綠球藻生長速率的研究，如陳潔等［10］對眼點擬微綠球藻生長的生態(tài)因子進(jìn)行分析；季祥等［11］對擬微綠球藻生長條件進(jìn)行優(yōu)化；張海琪等［12］研究了光照、溫度、碳源及接種密度對微綠球藻生長的影響；黃翔鵠等［13］研究了微綠球藻對氮和磷營養(yǎng)鹽的需求?！颈狙芯壳腥朦c】如何提高人工培養(yǎng)微綠球藻的生物質(zhì)產(chǎn)量和促進(jìn)其資源化高效利用是目前急需解決的問題?；诿恐晡⒃逅锠I養(yǎng)成分及含量各不同，同一種微藻在不同的營養(yǎng)液中生長的效果也不一樣，可推知藻類對營養(yǎng)的需求有適宜及最適的種類和濃度，越是符合該藻營養(yǎng)需求的配方，越能獲得較理想的培養(yǎng)效果［14］。【擬解決的關(guān)鍵問題】目前與微綠球藻生長繁殖密切相關(guān)的碳源、氮源、磷源、鐵源、維生素B1及B12等營養(yǎng)元素最佳種類及濃度的系統(tǒng)研究尚未見報道。鑒于此，本研究分析了不同質(zhì)量濃度的碳源，不同種類及質(zhì)量濃度的氮源、磷源、鐵源、VB1及VB12等主要營養(yǎng)元素對微綠球藻的生長效應(yīng)，選出最適宜的微綠球藻培養(yǎng)基，提高其生長速率，以期為微綠球藻的大規(guī)模培養(yǎng)提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試微綠球藻由海南大學(xué)海洋學(xué)院微藻保種室提供。微綠球藻藻體形狀為細(xì)胞球形，直徑2～4 μm，單細(xì)胞；眼點圓形，淡橘紅色；色素體1個，淡綠色，卵圓形或杯狀。試驗前把微綠球藻藻種接種到2 000 mL三角燒瓶中進(jìn)行活化純培養(yǎng)，不充氣，每天搖動2～4次，取指數(shù)生長期的微綠球藻用于本試驗。

試驗使用的培養(yǎng)液為寧波大學(xué) 3#微藻培養(yǎng)液［1］。供試海水取自海南省?？谑形骱０逗^(qū)，pH為8.07，鹽度為31.5，經(jīng)過濾、煮沸消毒、封口，備用。

1.2 試驗方法

微綠球藻培養(yǎng)溫度為26（±1）℃，光強(qiáng)為70（±6） μmol/（m2s），每天隨機(jī)交換培養(yǎng)瓶的位置并搖瓶3 次。試驗均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.1 有機(jī)碳源濃度的篩選 以寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，經(jīng)預(yù)備試驗，選用乙酸鈉作為微綠球藻碳源。設(shè)置乙酸鈉質(zhì)量濃度梯度為0、3、6、9、12、15 g/L。培養(yǎng)4 d后計數(shù)微綠球藻的細(xì)胞密度。

1.2.2 氮、磷、鐵源種類及濃度的篩選 根據(jù)1.2.1的試驗結(jié)果選用最佳的碳源，進(jìn)行氮、磷、鐵的篩選試驗。根據(jù)寧波大學(xué)3#配方分別配制出缺氮、缺磷、缺鐵培養(yǎng)液，以KNO3、NH4Cl、CO(NH2)2作為試驗氮源，設(shè)置氮濃度梯度為0、20、35、50、70 mg/L，進(jìn)行氮源種類及質(zhì)量濃度的篩選；以KH2PO4、NaH2PO4作為試驗磷源，設(shè)置磷質(zhì)量濃度梯度為0、1、2、3、4、5、6 mg/L，進(jìn)行磷源種類及質(zhì)量濃度的篩選；以FeSO4、C6H5O7Fe作為試驗鐵源，設(shè)置鐵質(zhì)量濃度梯度為0、0.5、1、2、3、4、5、6 mg/L，進(jìn)行鐵源種類及質(zhì)量濃度的篩選。培養(yǎng)4 d后計數(shù)微綠球藻的細(xì)胞密度。

1.2.3 VB1和VB12的正交試驗 根據(jù)1.2.1的試驗結(jié)果選用最佳的碳源，設(shè)計2因素4水平的VB1和VB12正交試驗（表1）。培養(yǎng)4 d后計數(shù)微綠球藻的細(xì)胞密度。

表1 VB1和VB12正交試驗因素水平（mg/L）Table 1 Factors and levels of VB1 and VB12 orthogonal experiments（mg/L）

1.2.4 培養(yǎng)基的比較 采用上述試驗篩選出的微綠球藻優(yōu)化培養(yǎng)基與寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基進(jìn)行對比培養(yǎng)試驗，培養(yǎng)時間為6 d。每天上午9：00計數(shù)微綠球藻的細(xì)胞密度。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 微綠球藻細(xì)胞密度的測定 先用血球計數(shù)板及分光光度計確定微綠球藻細(xì)胞密度與對應(yīng)藻液OD720值的線性關(guān)系［15］，然后測定試驗藻液的 OD720值，根據(jù)藻細(xì)胞密度與藻液 OD720的線性關(guān)系換算出微綠球藻的細(xì)胞密度。

1.3.2 微綠球藻生長速率（K）的計算 藻細(xì)胞的生長速率（K）計算公式為：

K=(lnLt-lnL0)/T

式中，Lt表示培養(yǎng)T時間后的微綠球藻細(xì)胞密度，L0表示初始培養(yǎng)時的微綠球藻細(xì)胞密度，T為培養(yǎng)時間（d）

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行處理，并采用SPSS19.0及DPS 14.5軟件進(jìn)行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸鈉濃度對微綠球藻生長的影響

乙酸鈉濃度篩選試驗中的微綠球藻初始接種密度為9.33×105個/mL。從圖1可知，添加不同質(zhì)量濃度的乙酸鈉進(jìn)行培養(yǎng)均可快速提高微綠球藻的生長速率（P＜0.01），其中以3 g/L乙酸鈉促進(jìn)微綠球藻生長的效果最優(yōu)。

2.2 氮源種類及濃度對微綠球藻生長的影響

添加3 g/L乙酸鈉的兼養(yǎng)模式下，氮源篩選試驗初始接種微綠球藻密度為2.20×105個/mL。氮源種類及濃度對微綠球藻生長速率的影響見圖2。從圖2可以看出，KNO3、NH4Cl和CO(NH2)2能極顯著促進(jìn)微綠球藻生長，適宜作為微綠球藻生長的氮源。3種氮源中NH4Cl的促生長效果好于其他兩種氮源，其中以20 mg/L的NH4Cl促生長效果最優(yōu)。

圖1 乙酸鈉濃度對微綠球藻生長的影響Fig. 1 Effects of CH3COONa concentrations on the growth of Nannochloropsis oculata

圖2 氮源種類及濃度對微綠球藻生長的影響Fig. 2 Effects of nitrogen sources and concentrations on the growth of Nannochloropsis oculata

2.3 磷源種類及其濃度對微綠球藻生長的影響

添加3 g/L乙酸鈉的兼養(yǎng)模式下，磷源篩選試驗初始接種微綠球藻密度為9.21×105個/mL。磷源種類及質(zhì)量濃度對微綠球藻生長速率的影響見圖3。由圖3可知，KH2PO4和NaH2PO4對微綠球藻的生長具有極顯著性影響，均適宜作為微綠球藻生長的磷源，其中以2 mg/L的KH2PO4對微綠球藻的促生長效果最優(yōu)。

圖3 磷源種類及濃度對微綠球藻生長的影響Fig. 3 Effects of phosphorus sources and concentrations on the growth of Nannochloropsis oculata

2.4 鐵源種類及濃度對微綠球藻生長的影響

添加3 g/L乙酸鈉的兼養(yǎng)模式下，鐵源篩選試驗初始接種微綠球藻密度為5.12×105個/mL。鐵源種類及濃度對微綠球藻生長速率的影響見圖4。由圖4可知，F(xiàn)eSO4和C6H5O7Fe對微綠球藻的生長具有極顯著影響，均適宜作為微綠球藻生長的鐵源，其中以3 mg/L FeSO4對微綠球藻的促生長效果最優(yōu)，F(xiàn)e質(zhì)量濃度在3～6 mg/L范圍時，隨著Fe質(zhì)量濃度的增加，K值越來越小。

圖4 鐵源種類及濃度對微綠球藻生長的影響Fig. 4 Effects of iron sources and concentrations on the growth of Nannochloropsis oculata

2.5 VB1、VB12的正交試驗

添加3 g/L乙酸鈉的兼養(yǎng)模式下，維生素試驗初始接種藻密度為5.67×105個/mL。從VB1和VB12的正交試驗結(jié)果（表2）可知， VB1和VB12對微綠球藻的生長具有極顯著影響，并且VB1和VB12存在交互作用。 綜合分析，采用試驗號 11混合維生素為微綠球藻的培養(yǎng)基配方，K值最大，即最適宜微綠球藻生長的維生素為VB10.05 mg/L及VB120.005 mg/L。

表2 VB1和VB12正交試驗結(jié)果Table 2 Results of VB1 amd VB12 orthogonal experiments

2.6 微綠球藻優(yōu)化培養(yǎng)基的驗證

根據(jù)上述試驗獲得微綠球藻的優(yōu)化培養(yǎng)基，采用優(yōu)化培養(yǎng)基與寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基進(jìn)行對比培養(yǎng)試驗，微綠球藻初始接種細(xì)胞密度為 2.84×105個/mL。從圖5可知，培養(yǎng)2 d后，微綠球藻在優(yōu)化培養(yǎng)基上的藻細(xì)胞密度明顯優(yōu)于寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基；培養(yǎng)4 d后，微綠球藻在優(yōu)化培養(yǎng)基中的藻細(xì)胞密度達(dá)寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基的2.55倍；培養(yǎng)6 d后，藻細(xì)胞密度達(dá)到1.74×107個/mL，但這時藻細(xì)胞密度僅為寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基的1.70倍。經(jīng)方差分析可知，優(yōu)化培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果極顯著優(yōu)于寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基。

圖5 不同培養(yǎng)基中微綠球藻的生長情況Fig.5 Growth of Nannochloropsis oculata in different culture media

3 討論

微藻光合作用的過程，也是碳的同化過程。本試驗結(jié)果表明，在有機(jī)碳乙酸鈉濃度為3 g/L的兼養(yǎng)模式下，微綠球藻的生長效果良好，達(dá)到自養(yǎng)的3.2倍?？梢姡宜徕c是微綠球藻的優(yōu)良碳源 。已有研究表明，有些微藻在得到有機(jī)質(zhì)后，生長更適宜，在有機(jī)酸中，最重要的是醋酸鈉，可以是良好的碳源［1］。氮是微藻生長必需的大量元素之一， 對微藻的生長、繁殖等生理活動有重要作用［16］。黃翔鵠等［13］研究表明，微綠球藻在 NO3-N 濃度為 28.30 mg/L和 PO4-P 濃度為 2.076 mg/L時，比生長速率達(dá)最大值。潘庭雙等［17］研究顯示，在以硝酸鈉或尿素作為氮源時，均以氮質(zhì)量濃度為24.64 mg/L條件下微綠球藻的生長效果最優(yōu)。本試驗結(jié)果表明，最適宜微綠球藻生長繁殖的氮源順序為NH4Cl-N＞ CO(NH2)2-N＞KNO3-N，NH4Cl-N質(zhì)量濃度為20 mg/L時，微綠球藻的生長速率最大；在NH4Cl-N質(zhì)量濃度為20～70 mg/L范圍時，隨著氮質(zhì)量濃度的升高，微綠球藻的生長速率越來越小，但均大于尿素及硝酸鉀處理組。

磷為無機(jī)礦物元素，是微藻正常生長繁殖所需要的大量營養(yǎng)元素之一［1］。黃翔鵠等［13］研究表明，最適合微綠球藻生長的PO4-P濃度為2.076 mg/L；王麗卿等［18］認(rèn)為最適合微綠球藻生長的PO4-P含量為2.3 mg/L。本試驗結(jié)果表明，兩種磷源之間的微綠球藻生長速率差異不顯著，其中KH2PO4-P質(zhì)量濃度為2 mg/L時，微綠球藻的K值最大。

鐵源在微藻呼吸作用、光合作用、蛋白質(zhì)與核酸合成、固氮作用等生理代謝過程中具有重要的作用［19］。鐵含量的高低對于微藻的生長有明顯影響，適宜的鐵濃度會促進(jìn)其微藻的生長繁殖［20］。陳潔等［10］研究發(fā)現(xiàn)，鐵源濃度為0.2 μmol/L時對微綠球藻生長最有利。季祥等［11］研究認(rèn)為，當(dāng)FeCl3·6H2O濃度為0.0063 g/L時，最適合擬微綠球藻生長。本試驗結(jié)果表明，F(xiàn)eSO4-Fe質(zhì)量濃度為3 mg/L時微綠球藻的生長速率最大。

維生素對微藻生長的影響因種類而不同。季祥等［11］研究表明，擬微綠球藻生長繁殖最適的維生素為 0.005 mg/L維生素B1、0.00025 mg/L維生素B12和 0.00025 mg/L生物素。宋邦興等［21］研究表明，0.1 mg/L維生素B12與0.05 mg/L 生物素混合使用對翼繭形藻的生長有極顯著影響。王永強(qiáng)等［22］研究表明，1.0 mg/L維生素B1和0.05 mg/L 生物素對錘狀中鼓藻生長有極顯著影響。本試驗結(jié)果表明，0.05 mg/L維生素B1和0.005 mg/L維生素B12對微綠球藻生長有極顯著影響。但本試驗結(jié)果微綠球藻所需的維生素B1和維生素B12質(zhì)量濃度均比季祥等［11］的研究結(jié)果大，原因是前人的研究在培養(yǎng)基中用了生物素，因此降低了微藻對維生素B1和維生素B12需求量。

在相同的生態(tài)因子條件下，用優(yōu)化培養(yǎng)基與寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基對比培養(yǎng)微綠球藻，結(jié)果表明，培養(yǎng)1 d，微綠球藻在兩種培養(yǎng)基中的生長速率差異不大；培養(yǎng)2 d后，微綠球藻在優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)基中表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢；培養(yǎng)4 d，微綠球藻在優(yōu)化培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度達(dá)寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基的2.55倍；然而培養(yǎng)4 d后，寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基的藻細(xì)胞密度增加幅度大于優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)基。主要原因：一是光線受阻，即培養(yǎng)4 d后，優(yōu)化培養(yǎng)基中的藻細(xì)胞密度大于寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基，這時平均藻細(xì)胞接受的光強(qiáng)相對較小；二是營養(yǎng)鹽水平下降，培養(yǎng)前4 d，由于優(yōu)化培養(yǎng)基中藻細(xì)胞生長速度更快，消耗的營養(yǎng)鹽更多，從而造成培養(yǎng)4 d后優(yōu)化培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽含量低于寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基。 培養(yǎng)6 d，優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)的微綠球藻細(xì)胞密度達(dá)1.74×107個/mL，生長速率是寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基的1.70倍。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，微綠球藻對各種營養(yǎng)鹽的需求如下：（1）乙酸鈉適宜作為微綠球藻培養(yǎng)的補(bǔ)充有機(jī)碳源，最佳乙酸鈉質(zhì)量濃度為3 g/L；（2）硝酸鉀、尿素和氯化銨均可作為氮鹽，最適微綠球藻生長的氮鹽為氯化銨，最佳質(zhì)量濃度為20 mg/L NH4CLl-N；（3）磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉均適宜作為微綠球藻生長的磷源，以質(zhì)量濃度為2 mg/L KH2PO4-P促進(jìn)微綠球藻生長的效果最優(yōu)；（4）硫酸亞鐵和檸檬酸鐵均適宜作為微綠球藻生長的鐵源，以質(zhì)量濃度為3 mg/L FeSO4-Fe促進(jìn)微綠球藻生長的效果最優(yōu)；（5）VB1、VB12混合使用對微綠球藻的生長有極顯著影響；（6）微綠球藻優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：3 g/L CHCOONa、 20 mg/L NH4Cl-N、2 mg/L KH2PO4-P、3 mg/L FeSO4-Fe、 0.05 mg/L VB1和 0.005 mg/L VB12，優(yōu)化培養(yǎng)基為微綠球藻的良好培養(yǎng)基。