小檗堿與多種成分復(fù)配及其對(duì)番茄灰霉病的抑制作用

李朋鈺 李映 楊濤 田平芳 田國(guó)英 葛喜珍

摘要：采用菌絲生長(zhǎng)速率法和共毒因子法，測(cè)定小檗堿與山豆根、爐甘石、蕓薹素內(nèi)酯、復(fù)硝酚鈉復(fù)配劑對(duì)番茄灰霉病的抑制作用。結(jié)果表明，小檗堿（0.280 mg/mL）與10%山豆根（2.257 mg/mL）、小檗堿（0.155 5 mg/mL）與爐甘石（0.062 5 mg/mL）復(fù)配使用對(duì)灰霉病菌抑制效果較佳，小檗堿與蕓薹素內(nèi)酯、復(fù)硝酚鈉復(fù)配能促進(jìn)灰霉菌生長(zhǎng)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)小檗堿和山豆根、爐甘石復(fù)配處理的灰霉病菌菌絲扭曲、干癟。田間防效試驗(yàn)結(jié)果表明，10%小檗堿可濕性粉劑1 000倍稀釋液對(duì)灰霉病菌的防效為71.7%，小檗堿與山豆根、爐甘石、復(fù)硝酚鈉、蕓薹素內(nèi)酯合用均能增加小檗堿對(duì)番茄灰霉病的防效。由此可知，小檗堿可與山豆根、爐甘石、蕓薹素內(nèi)酯、復(fù)硝酚鈉復(fù)配用于番茄灰霉病防治。

關(guān)鍵詞：小檗堿;復(fù)配劑;灰霉病;抑菌活性

中圖分類號(hào)：S436.412? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）01-0056-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.01.013? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Inhibition of Berberine with other Components on Botrytis cinerea

LI Peng-yu1，LI Ying1，YANG Tao1，TIAN Ping-fang2，TIAN Guo-ying3，GE Xi-zhen1

（1.College of Biochemical Engineering，Beijing Union University，Beijing 100023，China;

2.College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China;

3.Shijiazhuang Academy of Agriculture and Forestry Science，Shijiazhuang 050000，China）

Abstract： The antibacterial activity of berberine with radix Sophorae tonkinensis，calamine，brassinolide and compound sodium nitrophenolate on Botrytis cinerea was studied by the method of mycelial growth rate and co-toxicity factor. The results showed that both of complex of berberine（0.280 mg/mL） and radix Sophorae tonkinensis （2.257 mg/mL） or berberine（0.155 5 mg/mL） and calamina（0.062 5 mg/mL） had strong inhibition against B. cinerea. However， the mixtures of berberine and brassinolide or compound sodium nitrophenolate could promote the growth of B. cinerea. Scanning electron microscope analysis revealed that the mycelia of B. cinerea manifested abnormity including distortion and collapse. The results of field control experiments showed that the control effect of 10% berberine was 71.7%. Furthermore， berberine combined with radix Sophorae tonkinensis， calamina， brassinolide and compound sodium nitrophenolate could increase the control effect of berberine against Botrytis cinereal. So it could be hypothesized that complex drugs could inhibited the gray mold cell membrane and played an antibacterial effect.

Key words： berberine; mixtures; Botrytis cinerea; antibacterial activity

灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染所致的真菌性植物病害，引起番茄、黃瓜、葡萄等果蔬葉子和果實(shí)的腐爛，繼而造成果蔬的腐爛枯死，嚴(yán)重影響這些經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量[1，2]。目前防治灰霉病以三唑類、吡咯類、嘧啶胺類、甲基硫菌靈、異菌脲等化學(xué)藥劑為主[3]?；瘜W(xué)藥物不僅作用靶點(diǎn)單一，且藥物殘留對(duì)環(huán)境和人體都有巨大的危害[4，5]。近年來(lái)，尋找合適的生物源殺菌劑和生防菌、減少環(huán)境污染、確保食品安全是農(nóng)藥研究的重點(diǎn)[6，7]。小檗堿作為傳統(tǒng)治療腸胃炎的中藥成分，廣泛存在于黃連、黃柏等植物中，來(lái)源豐富，價(jià)格低廉[8]。山豆根是越南槐（Radix Sophorae tonkinensis）的干燥根莖，主要成分為生物堿、黃酮、皂苷類物質(zhì)，常用于治療咽喉腫痛、火毒蘊(yùn)結(jié)[9];爐甘石是一種主要成分為碳酸鋅的復(fù)雜礦物集合體，具有解毒明目退翳，收濕止癢斂瘡等功效[10];蕓薹素內(nèi)酯是一種廣譜植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能提高農(nóng)作物的抗病性緩解藥害[11];復(fù)硝酚鈉是一種集營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)、預(yù)防為一體的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可與其他抑菌成分復(fù)配使用從而提高藥效[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對(duì)桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）和灰霉病菌（即灰葡萄孢菌）防效好[13，14]。然而在實(shí)際生產(chǎn)上不可能僅使用一種殺菌劑。本試驗(yàn)對(duì)小檗堿與山豆根、爐甘石、蕓薹素內(nèi)酯、復(fù)硝酚鈉復(fù)配的相容性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山豆根、爐甘石、蕓薹素內(nèi)酯、復(fù)硝酚鈉單獨(dú)使用對(duì)番茄灰霉病菌有抑制作用，但最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）均較大。通過(guò)探究小檗堿分別與山豆根、爐甘石、云薹素內(nèi)酯、復(fù)硝酚鈉復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用，以期為小檗堿的研究和指導(dǎo)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

番茄灰霉病菌（ATCC 11542）由北京化工大學(xué)提供。小檗堿（簡(jiǎn)稱BBR，97%）購(gòu)自陜西慧科生物發(fā)展有限公司，山豆根（10%）、爐甘石購(gòu)自長(zhǎng)安中藥材有限公司，0.1%蕓薹素內(nèi)酯、0.2%復(fù)硝酚鈉購(gòu)自河南神雨生物科技有限公司，10%小檗堿可濕性粉劑（自制）。

PDA培養(yǎng)基：新鮮去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加去離子水定容至1 000 mL，分裝10瓶待用。

1.2? 方法

1.2.1? 小檗堿及其他成分對(duì)灰霉病的毒力測(cè)定? 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[15]測(cè)定小檗堿及其他成分分別對(duì)番茄灰霉病菌的毒力。將小檗堿與其他成分母液稀釋為一系列濃度，按照表1比例分別加入經(jīng)115 ℃滅菌25 min后冷卻至55 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，制成系列濃度含成分PDA平板，以加無(wú)菌水為空白對(duì)照。用直徑為8 mm的打孔器取在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)3 d的灰霉病菌菌餅，接種于含不同成分不同濃度梯度的PDA平板上。將各平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，避光培養(yǎng)，24 h后，每隔12 h用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑。根據(jù)番茄灰霉病菌在不同藥物梯度平板上的生長(zhǎng)速率，計(jì)算出小檗堿及其他成分對(duì)番茄灰霉病的半最大效應(yīng)濃度（EC50）、不同濃度成分對(duì)灰霉病的生長(zhǎng)抑制率。其中，菌落直徑=測(cè)量菌落直徑平均值-8;抑制率=（空白組菌落直徑-加藥處理組菌落直徑）/空白組菌落直徑×100%。

1.2.2? 小檗堿與其他成分最小抑菌濃度和最小殺菌濃度? 設(shè)置分別含小檗堿（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mg/mL）、10%山豆根（25、50、75、100、125、150 mg/mL）、爐甘石（1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 mg/mL）、蕓薹素內(nèi)酯（25、50、75、100、125、150 mg/mL）、復(fù)硝酚鈉（25、50、75、100、125、150 mg/mL）的培養(yǎng)基抑制番茄灰霉病菌，將菌餅接種至培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)，12 h后觀察培養(yǎng)基上番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)情況，無(wú)菌絲生長(zhǎng)，則該濃度即為MIC值，72 h后未見(jiàn)菌絲生長(zhǎng)的濃度即為MBC值。

1.2.3? 小檗堿與其他成分復(fù)配? 根據(jù)等效線法[16]，以小檗堿和山豆根為例，按照各自EC50的濃度配制母液，復(fù)配比例按照表2分別制備含小檗堿和山豆根的PDA培養(yǎng)基，將8 mm的番茄灰霉病菌菌餅接種到培養(yǎng)基表面中央，28 ℃培養(yǎng)，24 h后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。采用共毒系數(shù)法計(jì)算共毒因子，若共毒因子大于20，則表示兩藥之間有協(xié)同作用;若共毒因子小于-20，則表示兩藥之間有拮抗作用;若共毒因子為-20～20，則表示兩藥之間作用相加。其中，混劑理論抑制率=小檗堿理論抑制率+其他成分理論抑制率;共毒因子=[（混劑實(shí)際抑制率-混劑理論抑制率）/混劑理論抑制率]×100%。

1.2.4? 不同成分處理灰霉病菌電鏡觀察? 采用“1.2.2”的方法，設(shè)置小檗堿和山豆根、爐甘石復(fù)配空白對(duì)照和EC50對(duì)照組，用玻片覆蓋法采集菌絲，將均勻長(zhǎng)著灰霉病菌絲的蓋玻片，用1%戊二醛溶液固定12 h，然后用0.15%戊二醛沖洗;用10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液梯度洗脫5 min，100%乙醇溶液洗脫10 min，充分脫水;真空冷凍干燥;將樣品固定到樣品臺(tái)，噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.5? 小檗堿與不同成分復(fù)配對(duì)灰霉病的田間防效試驗(yàn)? 田間試驗(yàn)設(shè)在北京市密云番茄種植基地日光室，品種為原味。試驗(yàn)時(shí)間為2016年3月10日至5月12日。田間防治用清水處理作為對(duì)照;每個(gè)濃度4次重復(fù)，共20個(gè)小區(qū)，隨機(jī)排列，每小區(qū)500株。施藥時(shí)間為3月18日、3月29日、4月10日、4月25日，共計(jì)施藥4次。最后一次施藥10 d后調(diào)查灰霉病病果率，計(jì)算防效。番茄灰霉病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及藥效計(jì)算方法按照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》進(jìn)行[17]，記錄病果個(gè)數(shù)。病果分級(jí)采用如下標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病斑;2級(jí)，殘留花瓣發(fā)病或柱頭發(fā)病;3級(jí)，萼片腐爛或柱頭發(fā)病蔓延到果臍部;5級(jí)，果臍部有浸潤(rùn)斑但無(wú)霉層;7級(jí)，果臍部有霉層但未擴(kuò)展到其他部位。

藥效計(jì)算方法：病果率=（病果數(shù)/調(diào)查果數(shù)）×100%，防治效果=[（對(duì)照病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)]×100%）。

1.2.6? 數(shù)據(jù)處理? 各試驗(yàn)操作重復(fù)3次。用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所給出的數(shù)據(jù)均是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;OriginPro9.1 繪圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 小檗堿與其他成分對(duì)灰霉病的EC50、MIC及MBC

由表3可知，小檗堿抑制番茄灰霉病菌的EC50為0.311 mg/mL，MIC為3.25 mg/mL，MBC為6.50 mg/mL;10%山豆根對(duì)番茄灰霉病菌的EC50為22.570 mg/mL，MIC為150.00 mg/mL，MBC為275.00 mg/mL;爐甘石對(duì)番茄灰霉病菌的EC50為0.908 mg/mL，MIC為9.25 mg/mL，MBC為18.75 mg/mL;蕓薹素內(nèi)酯對(duì)番茄灰霉病菌的EC50為6.292 mg/mL，MIC為50.00 mg/mL，MBC為125.00 mg/mL;復(fù)硝酚鈉對(duì)番茄灰霉病菌的EC50為2.113 mg/mL，MIC為25.00 mg/mL，MBC為100.00 mg/mL。除小檗堿外，其他成分的MIC值與MBC值均偏大，故考慮與其他成分復(fù)配使用。

2.2? 小檗堿與其他成分復(fù)配對(duì)番茄灰霉病的抑制效果

由圖1、圖2可知，小檗堿與爐甘石復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌有很強(qiáng)的抑制作用，通過(guò)空白組（對(duì)照）與試驗(yàn)組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，0.155 5 mg/mL小檗堿+0.062 5 mg/mL爐甘石在菌落生長(zhǎng)的各個(gè)階段抑菌效果最好，抑菌率超過(guò)50%，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，爐甘石的溶解性差，其溶解于培養(yǎng)基的具體濃度并未檢測(cè)出。與對(duì)照相比，小檗堿與10%山豆根復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)有一定抑制作用;小檗堿與蕓薹素內(nèi)酯復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用;小檗堿與復(fù)硝酚鈉復(fù)配也有促進(jìn)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)的現(xiàn)象。

2.3? 小檗堿與山豆根復(fù)配對(duì)灰霉病的藥效評(píng)價(jià)

根據(jù)“2.2”試驗(yàn)結(jié)果，選擇了復(fù)配成分對(duì)灰霉病菌抑制效果較好的小檗堿和山豆根，并對(duì)其藥效進(jìn)行了評(píng)價(jià)。從表4可以看出，小檗堿與10%山豆根按9a/10+b/10復(fù)配時(shí)，共毒因子大于20，表明在該復(fù)配比下有協(xié)同增效作用;按8a/10+2b/10、2a/10+8b/10和a/10+9b/10復(fù)配時(shí)，共毒因子為20～-20，說(shuō)明在該復(fù)配比下小檗堿和10%山豆根之間有相加作用;其他配比情況下，共毒因子小于-20，表示復(fù)配的小檗堿和10%山豆根之間有拮抗作用。因此，小檗堿與10%山豆根的最佳復(fù)配為9a/10+b/10，即0.280 mg/mL小檗堿+2.257 mg/mL 10%山豆根。

2.4? 小檗堿與其他成分復(fù)配對(duì)灰霉病菌菌絲形態(tài)的影響

由圖3可知，與處理組相比，正常生長(zhǎng)的菌絲平滑、豐滿、粗細(xì)均勻。小檗堿與山豆根、爐甘石處理后，菌絲多出現(xiàn)纏繞扭曲，菌絲表面出現(xiàn)斷裂、干癟、褶皺、塌陷等粗細(xì)不均的形態(tài)，菌絲萎縮脫水嚴(yán)重，部分菌絲甚至出現(xiàn)溶解斷裂。基于這些成分處理后菌絲呈現(xiàn)異常的形態(tài)變化，表明小蘗堿與山豆根、爐甘石復(fù)配對(duì)番茄灰霉病有強(qiáng)烈的抑制作用。

2.5? 小檗堿與不同成分復(fù)配對(duì)灰霉病的田間防效

由表5可知，對(duì)照的病果率為31.6%。10%小檗堿可濕性粉劑1 000倍稀釋液?jiǎn)为?dú)使用防效71.7%，小檗堿與山豆根、爐甘石、復(fù)硝酚鈉、蕓薹素內(nèi)酯合用均能增加小檗堿對(duì)番茄灰霉病的防效。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)番茄灰霉病的情況下復(fù)硝酚鈉、蕓薹素內(nèi)酯均能不同程度促進(jìn)病原菌生長(zhǎng)。

3? 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)研究了山豆根、爐甘石、復(fù)硝酚鈉及蕓薹素內(nèi)酯分別與小檗堿復(fù)配對(duì)灰霉病菌的抑菌效果。結(jié)果表明，小檗堿與山豆根、爐甘石復(fù)配無(wú)論是菌體還是活體均可起抑制作用;在活體試驗(yàn)中，小檗堿與復(fù)硝酚鈉、蕓薹素內(nèi)酯復(fù)配使用可增加復(fù)配成分對(duì)番茄灰霉病菌的防效，實(shí)驗(yàn)室平板試驗(yàn)反而促進(jìn)番茄灰霉病菌的生長(zhǎng)。復(fù)硝酚鈉、蕓薹素內(nèi)酯作為新型綠色環(huán)保植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在活體狀態(tài)下[18]可促進(jìn)蔬菜、瓜類、水果等作物生長(zhǎng)，改善品質(zhì)，提高產(chǎn)量，說(shuō)明小檗堿可與復(fù)硝酚鈉、蕓薹素內(nèi)酯同時(shí)使用，小檗堿與不同成分復(fù)配不僅通過(guò)抑制菌體生長(zhǎng)來(lái)起到抑菌效果，有可能通過(guò)其他間接作用于活體。

本研究采用共毒因子法發(fā)現(xiàn)小檗堿和山豆根復(fù)配最優(yōu)配比為0.279 9 mg/mL小檗堿+2.257 mg/mL 10%山豆根，此時(shí)共毒因子為33，具有協(xié)同增效的作用。山豆根主要活性成分為生物堿類、黃酮類、三萜皂苷類[19]，蔡錦源等[20]發(fā)現(xiàn)其有很好的抗氧化及抑菌活性。通過(guò)電鏡觀察，推測(cè)小檗堿和山豆根復(fù)配使用的抑菌機(jī)理可能是損壞了菌體的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞凹陷胞內(nèi)物質(zhì)外泄，扭曲折斷無(wú)法正常代謝。

0.155 5 mg/mL小檗堿+0.062 5 mg/mL爐甘石復(fù)配對(duì)灰霉病菌的抑菌效果最好。爐甘石[10，21]主要成分為碳酸鋅、氧化鈣，很多研究發(fā)現(xiàn)其有收濕斂瘡等功效，然而爐甘石的水溶性較差影響其功效的發(fā)揮。通過(guò)電鏡觀察，推測(cè)小檗堿和爐甘石復(fù)配使用的抑菌機(jī)制可能是收斂了真菌細(xì)胞的水分，導(dǎo)致細(xì)胞缺水無(wú)法進(jìn)行正常的生長(zhǎng)代謝，從而干癟、脆弱易斷。

目前，關(guān)于植物源農(nóng)藥抑菌機(jī)制的報(bào)道還很少。后期會(huì)在尋找廣譜抑菌物質(zhì)的同時(shí)探索藥物作用靶點(diǎn)，以期為這些成分單獨(dú)使用或復(fù)配提供適宜、快速的理論指導(dǎo)。

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