橡膠樹毛色二孢葉斑病病原菌的鑒定及其生物學(xué)特性研究

吳如慧 李增平 張宇 施澤坤

摘 ?要??近期在海南省三亞市的橡膠樹種植區(qū)發(fā)現(xiàn)一種新的橡膠樹葉斑病，利用組織分離法和單孢分離法獲得純化菌株HNSY003。通過形態(tài)學(xué)特征觀察、rDNA-ITS和EF1-α序列分析及柯赫氏法則驗(yàn)證，確定該病原菌為假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）。這是假可可毛二孢所致橡膠樹葉斑病的首次發(fā)現(xiàn)。生物學(xué)特性測定結(jié)果表明，病菌最適生長條件為：溫度32?℃，pH?5，碳源為D-果糖，氮源為酵母浸膏。不同光照條件對菌絲生長影響不顯著。

關(guān)鍵詞 ?橡膠樹;毛色二孢葉斑病;假可可毛色二孢;生物學(xué)特性中圖分類號(hào)??S794.1??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Identification and Biological Characteristics of the Pathogen Causing Lasiodiplodia?Leaf?Spot of Robber Tree

WU Ruhui， LI Zengping^*， ZHANG Yu，?SHI Zekun

Institute of Tropical Agriculture and Forestry，?Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract ?A new leaf?spot?disease of rubber tree was found in Sanya， Hainan. The pathogen strain HNSY003 was isolated and purified by methods of tissue isolation and single spore isolation.?The pathogen was identified?asLasiodiplodia pseudotheobromaeby morphological observation， sequence analyses of rDNA-ITS and EF1-α， and its pathogenicity was confirmed by Kochs postulate. The fungal species is reported?the first?time?as the pathogen of robber tree?leaf?spot. The results of biological characteristics test showed that the optimum conditions for the pathogen growth were as follows： temperature 32?℃， pH?5， D-fructose as the carbon source， yeast extract as the nitrogen source. Different light conditions had little effect on the growth rate of the pathogen hypha.

Keywords ?rubber tree;Lasiodiplodialeaf?spot;Lasiodiplodia pseudotheobromae;?biological characteristic

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.016

橡膠樹[Hevea brasiliensis（Willd.ex A.Juss.）Muell. Arg]為大戟科（Euphobiaceae）三葉橡膠樹屬（Hevea）的多年生熱帶產(chǎn)膠喬木，其所產(chǎn)生的天然橡膠與石油、煤炭、鋼鐵并稱世界四大工業(yè)原料^[1]。中國的橡膠樹種植區(qū)主要分布于海南、云南、廣東、廣西、福建等地區(qū)，其中海南和云南為主要植膠區(qū)。隨著世界各國越來越重視環(huán)境，煤炭等不可再生資源大量消耗，對天然橡膠的需求將不斷增加，天然橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊^[2]。

斯里蘭卡曾報(bào)道了侵染橡膠樹的60多種病原菌^[3]。由美國植物病理學(xué)會(huì)組織編撰的作物病蟲害數(shù)據(jù)庫^[4]中記錄的橡膠樹病害有117種。危害橡膠生產(chǎn)的病害主要有葉部病害（如白粉病^[5]和炭疽病^[6]）、根病^[7]（如紅根病和褐根?。?、莖干病害（如緋腐病^[8]和割面條潰瘍^[9]）等。一些橡膠樹葉斑病常造成膠樹大量落葉，對橡膠樹的危害較為嚴(yán)重。

筆者對海南省多個(gè)橡膠樹種植地進(jìn)行調(diào)查時(shí)，在海南省三亞市的吉陽鎮(zhèn)膠園中發(fā)現(xiàn)一種危害橡膠樹葉片的新病害，經(jīng)初步鑒定后取名為橡膠樹毛色二孢葉斑病。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該病原菌主要為害膠樹下層老化葉片，在6—10月高溫、多雨的季節(jié)發(fā)生，6月開始發(fā)病，7—9月進(jìn)入臺(tái)風(fēng)雨季后發(fā)病迅速，9月為發(fā)病高峰期，株發(fā)病率為32.64%。本研究對這一橡膠樹新病害的病原菌結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法及柯赫法則進(jìn)行種類鑒定，并對其病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性初步研究，以期為進(jìn)一步研究該病害的發(fā)生流行規(guī)律及防控提供理論支持和技術(shù)借鑒。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?病樣采集及接種苗木??于2017年9月從海南省三亞市吉陽鎮(zhèn)橡膠園中的發(fā)病膠樹上采集病葉，樣品用保鮮袋包裝后帶回實(shí)驗(yàn)室備用。致病性測定所用橡膠樹苗由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院提供的二年生7-33-97橡膠芽接幼樹。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和查氏培養(yǎng)基（Czapek），詳細(xì)配方參閱《植病研究方法》^[10]。

1.1.3 ?試劑及儀器??E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit，OMEGA?Extraction Kit，2×Taq-Mixture，DNA Marker。Olympus BX 51顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 ?橡膠樹毛色二孢葉斑病病原菌分離與純化??采用常規(guī)組織分離法，將發(fā)病葉片先用無菌水沖洗，再從發(fā)病初期葉片病健交界處切取3?mm×?3?mm的病斑組織，在75%酒精中浸泡8?s，再用1%的升汞溶液浸泡1?min，然后用無菌水漂洗3次，用滅菌后的鑷子將其轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上，封口，28?℃恒溫培養(yǎng)。待其產(chǎn)孢后采用單孢分離法用已滅菌的接種環(huán)從已長滿菌絲的PDA平板里挑取少量帶分生孢子的菌絲，置于1?mL滅菌水中混勻后梯度稀釋成不同濃度的孢子懸浮液，涂布在PDA平板表面，28?℃的恒溫培養(yǎng)1?d后挑取單孢菌落進(jìn)行純化。分離菌株純化后編號(hào)為HNSY003，轉(zhuǎn)入斜面試管4?℃冷藏保存?zhèn)溆?sup>[11]。

1.2.2 ?菌株的致病性測定??采取6株種植二年生的熱研7-33-97健康橡膠樹袋裝苗，表面消毒后，采用針刺法接種，3株接HNSY003分離菌，3株接空白PDA培養(yǎng)基作對照。用滅菌手術(shù)刀在消毒的植株莖干表面削出3個(gè)間隔5?cm左右長約1?cm的平面?zhèn)?，用滅菌束針刺傷接種的葉片，將培養(yǎng)2?d的菌落上的菌絲塊面朝下貼在傷口上，對照處接空白培養(yǎng)基，表面覆蓋棉花后用滅菌水濕潤保濕，每天觀察發(fā)病情況，定期記錄并拍照。

1.2.3 ?菌株鑒定??形態(tài)鑒定：將分離菌株移接在PDA培養(yǎng)基上，28?℃培養(yǎng)2?d后，觀察菌落形態(tài)和顏色，并挑取菌絲制片在光學(xué)顯微鏡下觀察和測量病菌的分生孢子器和分生孢子并拍照。

分子鑒定：使用OMEGA Fungal DNA Kit來提取病原菌DNA。采用通用引物ITS1（5′-TC C G TAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）^[12]擴(kuò)增rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及特異性引物EF1-688F（5′-CGGT CACT TGATCTACAAGTGC-3′）/EF1-1251R（5′-C CT CGAACTCACCAGTACCG-3′）^[13]擴(kuò)增翻譯延伸因子的部分序列。PCR擴(kuò)增后對其產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。使用OMEGA Extraction Kit試劑盒切膠回收目的片段，純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的序列在NCBI上進(jìn)行比對分析，并提交序列，然后對測序后的rDNA-ITS和EF1-α序列進(jìn)行序列聯(lián)配比較、編輯。利用 MEGA 6.0軟件用鄰接法（neighbor-joining，NJ）以Botryosphaeria dothidea為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹^[14]。

1.2.4 ?橡膠樹毛色二孢葉斑病病原菌的生物學(xué)特性測定??用直徑5?mm的打孔器在培養(yǎng)2?d的菌落邊緣打取菌餅，將其移接到不同種類的培養(yǎng)基平板中心進(jìn)行培養(yǎng)。逐日定時(shí)定點(diǎn)用十字交叉法測量菌落直徑。每組不同處理測定設(shè)置3個(gè)重復(fù)。除碳、氮源生物學(xué)測定外，其他條件所使用的培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基。

（1）溫度：接菌后置于15、20、25、28、30、32、35、40?℃共8個(gè)溫度梯度下恒溫黑暗培養(yǎng)。

（2）光照：采用15?W照明燈，測定條件設(shè)置為連續(xù)光照、完全黑暗、12?h光暗交替3種條件，28?℃恒溫培養(yǎng)。

（3）pH：在已滅菌的PDA培養(yǎng)基凝固之前，用1?mol/L的HCl和1?mol/L的NaOH將pH分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11共10個(gè)梯度，28?℃恒溫培養(yǎng)。

（4）碳、氮源：分別稱取等碳量的D-果糖、D-山梨醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、肌醇加入基礎(chǔ)碳源培養(yǎng)基，稱取等氮量的L-天冬酰胺、牛肉膏、酵母浸膏、大豆蛋白胨、硝酸銨、草酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣加入基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基中，將不加蔗糖、硝酸鈉的Czapek培養(yǎng)基作為缺碳、缺氮空白對照。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Excel?2010軟件和SAS 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans?multiple?range?test進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。

2??結(jié)果與分析

2.1橡膠樹毛色二孢葉斑病癥狀

橡膠樹毛色二孢葉斑病主要為害橡膠樹老化葉片，葉片染病后初期呈現(xiàn)黑褐色圓形小病斑，周圍具明顯黃色暈圈，后期擴(kuò)展為圓形、半圓形或不規(guī)則形灰白色病斑，其上散生小黑點(diǎn)，病健交界處有一明顯的深褐色壞死帶，外圍有明顯黃色暈圈。病斑擴(kuò)展不受小葉葉脈限制，但受主脈限制（圖1A，圖1B）。

2.2致病性測定

用菌株HNSY003接種橡膠樹葉片，針刺接種1?d后發(fā)病，3?d后發(fā)病部位失水褪綠變成灰白色（圖2A），7?d后病斑逐漸擴(kuò)展成近圓形，邊緣灰褐色至褐色，中間灰白色，外圍具明顯黃色暈圈，癥狀與田間發(fā)病植株癥狀一致（圖2B），對照均未發(fā)病。莖干接種3～14?d后，傷口接種分離菌的橡膠苗莖干被侵染變褐色并擴(kuò)展，對照則無明顯變化。菌絲塊接種3?d后傷口變黑褐色并向周圍擴(kuò)展，病健交界處有褐色水漬狀壞死帶，上部葉片仍保持綠色，14?d后，接種病原菌的橡膠苗嫩莖病部組織變干，表面生出大量小黑點(diǎn)（分生孢子器），上部葉片失水下垂，失綠并變黃（圖2C，圖2D，圖2E）。采發(fā)病組織進(jìn)行分離獲得相同的菌株，表明分離菌為致病菌。

2.3病原菌的形態(tài)鑒定

在PDA平板上培養(yǎng)的菌株HNSY003的菌落初期呈白色絨毛狀，近圓形，邊緣整齊，病原菌生長很快，28?℃黑暗條件下培養(yǎng)2?d即可長滿培養(yǎng)皿（d=90?mm）（圖3A），菌絲放射狀生長，繼而變墨綠色，菌絲致密，氣生菌絲發(fā)達(dá)，后期逐漸變?yōu)楹谏?，氣生菌絲極發(fā)達(dá)。低溫處理后在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生許多黑色顆粒狀的分生孢子座，散生，球形或近球形，暗褐色，較厚。在發(fā)病的膠樹葉片和橡膠嫩莖上產(chǎn)生分生孢子器（圖3B，圖3C），常多個(gè)聚生，單室，球形或近球形，初埋生于寄主表皮下，成熟后突破表皮外露，器壁暗褐色，較厚，大小為163.9～227.53?μm×?105.98～209.4?μm（平均197.53?μm×184.75?μm）（圖3D，圖3E）。分生孢子有2種類型，橢圓形或卵圓形，壁厚;不成熟時(shí)呈無色透明狀，單胞，成熟后變棕色至黑色，具有縱紋，厚壁，雙胞;分生孢子大小為 21.5～31.85?μm×12.06～14.49?μm（平均26.63?μm×13.1?μm）（圖3F，圖3G）。根據(jù)該病原菌的菌落特征及顯微形態(tài)特征，結(jié)合致病性測定，確定該病原菌為假可可球二孢菌[Lasiodiplodia pseudotheobromaeA.J.L. Philips， A. Alves & Crous.]^[15-18]，屬半知菌類（Imperfect）、腔孢綱（Coelomycetes）、球殼孢目（Sphacrop sid ales）。其有性階段未知。

2.4橡膠樹毛色二孢葉斑病病原菌的分子鑒定

經(jīng)測序，病原菌 rDNA-ITS和EF1-α序列分別為503?bp（NCBI登錄號(hào)為MH422961），和523?bp（NCBI登錄號(hào)為MH543322），與NCBI登錄號(hào)為KX244815.1、MH102237.1等假可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia pseudotheobromaeA.J.L. Philips， A. Alves & Crous]序列的相似度為100%。從GenBank中選取含模式菌株在內(nèi)的相關(guān)菌株Lasiodiplodia pseudotheobromae、Lasiodiplodia theobromae、Lasiodiplodia parva等菌株的ITS及 EF1-α序列，使用2種序列聯(lián)合建樹，進(jìn)行多重序列比較及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果顯示，該病原菌的rDNA-ITS及EF1-α序列與假可可毛色二孢菌的同源性達(dá)100%，表明該病原菌HNSY003與假可可毛色二孢菌遺傳距離最小，聚為一類（圖4）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定結(jié)果，確定該病原菌為假可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia pseudotheobromaeA.J.L. Philips， A. Alves & Crous.]。

2.5橡膠樹毛色二孢葉斑病病菌的生物學(xué)特性

2.5.1 ?溫度對菌落生長的影響??該菌菌落在15～?40?℃溫度范圍內(nèi)均能生長，25～35?℃適合該菌生長，最適生長溫度為32?℃，40?℃時(shí)，該菌菌落生

長速度下降明顯，當(dāng)溫度45?℃時(shí)停止生長，但病原菌未死亡，將其轉(zhuǎn)移至適合的溫度仍可繼續(xù)生長（圖5）。

不同大寫字母表示0.01水平上差異極顯著，不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著。

Different capital letters mean extremely significant different at 0.01 level; different lowercase?letters mean significantdifferent at 0.05 level.

2.5.2 ?光照對菌絲生長的影響??在連續(xù)光照、完全黑暗、12?h光暗交替3種光照條件下該菌均能生長，且3種處理下病原菌菌落生長勢基本一致，由此可見，3種不同的光照條件對菌絲的生長幾乎沒有影響（圖6）。

2.5.3 ?pH對菌絲生長的影響 ?橡膠樹葉斑病病菌HNSY003在pH 3～11范圍內(nèi)均能生長，但是在不同的pH條件下培養(yǎng)2 d后，該菌的菌落直徑不同，pH為5時(shí)菌落直徑最大，且極顯著高于其他處理，表明pH?5最適宜菌絲生長，pH 4～7與pH 8處理間菌落直徑差異顯著（圖7），表明橡膠樹葉斑病病菌更適合在弱酸性至中性環(huán)境中生長。

2.5.4 ?碳、氮源對菌絲生長的影響??由表1可知，橡膠樹毛色二孢葉斑病病菌HNSY003在供試的8種不同碳源培養(yǎng)基上均能正常生長，D-果糖為最適碳源，菌落直徑最大，菌絲致密，白色絨毛狀;其次為可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，在肌醇和D-山梨醇中菌落直徑最小，且在D-山梨醇中菌落稀薄，碳源的利用率低。表明橡膠樹毛色二孢葉斑病病菌菌絲對不同的碳源利用率存在差異。

由表2可知，橡膠樹毛色二孢葉斑病病菌HNSY003在供試的12種不同氮源培養(yǎng)基上均可

生長，單一氮源以硝酸銨為最適氮源，其菌落直徑最大，菌絲致密長勢優(yōu)良，其次為硝酸鈣。草酸銨為氮源的菌落利用率最低，直徑最小。只有草酸銨和氯化銨為碳源時(shí)菌落直徑小于對照。在缺氮的培養(yǎng)基中，菌絲稀薄。復(fù)合氮源中以酵母浸膏為最適氮源，菌落圓形，致密。表明病原菌對不同的氮源利用率存在差異。

3??討論

通過對海南省三亞市橡膠樹種植區(qū)新發(fā)現(xiàn)的毛色二孢葉斑病病原菌的形態(tài)特征觀察、致病性測定及分子鑒定，表明該病害是由假可可毛色二孢（Lasiodiplodia? pseudotheobromae）侵染引起的，這是該病原菌所致橡膠樹葉斑病的首次發(fā)現(xiàn)。該病原菌主要為害橡膠樹老化葉片，嚴(yán)重時(shí)從下部老葉向上部擴(kuò)展蔓延;人工接種可侵染橡膠樹

小苗莖干，導(dǎo)致橡膠樹小苗整株葉片在短期內(nèi)失綠發(fā)黃，迅速失水、萎蔫下垂，樹皮干縮，最后整株徹底枯死。假可可毛色二孢是一種重要的植物病原菌，寄主范圍廣泛，包括中國的相思樹、林生杧果、泡桐、南洋楹，泰國的橡膠樹、依蘭、

蓮霧、龍眼、桂花，烏拉圭的大桉，哥斯達(dá)黎加的馬占相思，蘇里南的酸橙，巴西的番木瓜，馬達(dá)加斯加的欖仁樹等多種植物的枝干和果實(shí)^[19]，引起潰瘍病、枝枯病及果腐病等，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Trakunyingcharoen等^[20]曾經(jīng)報(bào)道假可可毛色二孢也能為害橡膠樹的莖干和葉片，致使橡膠樹整株葉片在短期內(nèi)迅速失水、萎蔫下垂，大枝條和莖干繼續(xù)失水，樹皮干縮，最后整株徹底枯死。

假可可毛色二孢（L. pseudotheobromae）與可可毛色二孢（L. theobromae）都是重要的農(nóng)業(yè)病原菌，兩者的田間發(fā)病癥狀及形態(tài)結(jié)構(gòu)相似不易區(qū)分，假可可毛色二孢曾為可可毛色二孢的隱含種^[15-16]，Alves等^[19]認(rèn)為該種應(yīng)從可可毛色二孢中劃分出來，成為一個(gè)新種。雖然2個(gè)種不易區(qū)分，但兩者在分生孢子形態(tài)和分生孢子器的分布上存在差別?？煽擅叩某墒旆稚咦拥膬啥顺蕡A形，分生孢子器大多單生;而假可可毛色二孢的分生孢子稍長，頂端鈍圓，向基部變尖，呈平截狀，分手孢子器大多聚生，稍小。根據(jù)分子鑒定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，兩者分別聚在系統(tǒng)進(jìn)化樹的不同分支，能夠明顯區(qū)分開假可可毛色二孢與可可毛色二孢。目前，利用形態(tài)學(xué)性狀及生理生化等宏觀上的鑒定手段已經(jīng)不能滿足我們的需求，還需結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)等各方面的性狀才能進(jìn)行更精準(zhǔn)的鑒定。

本研究發(fā)現(xiàn)，該病原菌菌絲生長適宜溫度為25～35?℃，32?℃時(shí)最適該菌生長;pH為4～6適宜該菌生長，pH為5時(shí)最適菌絲生長;8種供試碳源培養(yǎng)基中，D-果糖為最適碳源，菌落直徑最大，長勢最好;12種不同氮源培養(yǎng)基中，單一氮源以硝酸銨為最適氮源，復(fù)合氮源中以酵母浸膏為最適氮源，菌落直徑最大，圓形，致密，長勢優(yōu)良。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該病原菌主要為害膠樹下層老化葉片，在6—10月高溫、多雨的季節(jié)發(fā)生，6月開始發(fā)病，7—9月進(jìn)入臺(tái)風(fēng)雨季后發(fā)病迅速，9月為發(fā)病高峰期;該病原菌常與白粉病褐色壞死斑伴隨侵染橡膠樹，但白粉病菌不侵染老葉，其褐色壞死斑病斑不規(guī)則形，而毛色二孢葉斑病菌侵染老化葉后，發(fā)病初期產(chǎn)生帶有黃色暈圈的黑褐色小病斑，易與白粉病病斑區(qū)分。研究發(fā)現(xiàn)病原菌易從葉片上的傷口侵入，對橡膠樹存在潛在的危害性，在生產(chǎn)防治中應(yīng)給予高度重視并加強(qiáng)監(jiān)測和防控。

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