基于SRAP分子標(biāo)記的13份貴州芒果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

劉榮 龔德勇 劉清國(guó) 黃海 范建新

摘 ?要??探索貴州芒果種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為芒果種質(zhì)資源的鑒定、創(chuàng)新與利用提供理論依據(jù)。利用SRAP標(biāo)記對(duì)13份芒果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。對(duì)108對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，其中有17對(duì)引物擴(kuò)增的條帶多且多態(tài)性好。17對(duì)引物共產(chǎn)生擴(kuò)增帶161條，多態(tài)性條帶為133條，多態(tài)性比率為82.61%，顯示較高的遺傳多態(tài)性。遺傳相似系數(shù)在0.602～0.820，其中桂熱芒10號(hào)與攀西紅芒的相似系數(shù)最大，而桂熱芒82號(hào)和紅象牙芒兩者之間的相似系數(shù)最小。UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，Mi-8與桂熱芒82號(hào)的親緣關(guān)系較近，Mi-9與紅芒6號(hào)的親緣關(guān)系較近，野生種質(zhì)資源Mi-5與串芒、桂熱芒10號(hào)和攀西紅芒的親緣關(guān)系較近，野生種質(zhì)資源Mi-6與凱特芒和金煌芒的親緣關(guān)系較近。以上研究結(jié)果說(shuō)明SRAP技術(shù)能用于貴州芒果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，也表明了貴州地區(qū)芒果種質(zhì)資源遺傳背景的復(fù)雜性。

關(guān)鍵詞 ?芒果;種質(zhì)資源;SRAP標(biāo)記;聚類分析;貴州中圖分類號(hào)??S667.7??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Genetic Diversity Analysis of Thirteen Mango Germplasm Resources Based on SRAP Molecular Markers

LIU Rong， GONG Deyong， LIU Qingguo， HUANG Hai， FAN Jianxin^*

Institute of Subtropical Crops， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Xingyi， Guizhou 562400， China

Abstract ?The genetic diversity and genetic relationship of mango germplasm resources were explored in Guizhou?to provide?the?theoretical basis for mango germplasm identification， innovation and utilization. SRAP was used to assess the genetic diversity of 13 mango?germplasm resources. 161 bands were amplified using 17 pairs of primers selected from 108 primers， of which 133 were polymorphic bands， and the polymorphic percentage of bands was 82.61%. Genetic similarity coefficients between genotypes was in the range of 0.602–0.820， with the minimum between mango Guire 10 and Panxi Red Mango， and the maximum between Guire 82 and Hongxiangya. Cluster analysis results showed that Mi-8 and Guire 82 had the closest relatives. Mi-9 and Red Mango 6 had the closest relatives. Mi-5， Chuan Mango， Guire 10 and Panxi Red Mango had the closest genetic relationship. Mi-6， Kate Mango and Jinhuang Mango had the closest genetic relationship. The test showed that SRAP technology could be used in the genetic diversity analysis of mango germplasm resources?in Guizhou， and the genetic background of mango germplasm resources?was complex in Guizhou.

Keywords ?mango; germplasm resources;?SRAP; cluster analysis; Guizhou

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.013

芒果（Mangifera indicaL.）屬于漆樹(shù)科（Anacardiaceae）、芒果屬（Mangifera），是熱帶亞熱帶重要經(jīng)濟(jì)作物之一^[1]。芒果與香蕉、柑橘、蘋果、葡萄并稱世界五大水果^[2]，因果色鮮美，肉質(zhì)香甜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，享有“熱帶果王”之美譽(yù)^[3-4]。在熱帶水果中，芒果產(chǎn)量位居第二^[5]。我國(guó)芒果主要分布于海南、廣東、廣西等地^[6]。隨著貴州省地方政策的大力支持，立足貴州地區(qū)特殊的氣候條件，適宜性種植的芒果品種需求量持續(xù)增加。因此，解決貴州芒果種質(zhì)資源的親緣關(guān)系、分子水平上的品種鑒定迫在眉睫。

分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用加快了芒果遺傳育種的步伐。近年來(lái)，相繼出現(xiàn)了ISSR^[7]、RAPD^[8]、SSR^[9]、AFLP^[10]、SCoT^[11]等標(biāo)記技術(shù)在芒果遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定等方面的研究。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一種基于PCR的分子標(biāo)記系統(tǒng)，與其他分子標(biāo)記相比，具有操作簡(jiǎn)單、共顯性高、多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，已在植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建和比較基因組學(xué)分析等研究領(lǐng)域上廣泛應(yīng)用^[12-13]。為弄清貴州地區(qū)2份野生種質(zhì)資源、2份實(shí)生材料以及9份引進(jìn)種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系，筆者以這13份芒果種質(zhì)資源為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行SRAP遺傳多樣性分析，旨在為貴州芒果種質(zhì)資源的鑒定、遺傳多樣性分析提供相應(yīng)的遺傳背景資料，為芒果品種鑒定提供理論支撐。

1??材料與方法

1.1材料

采集于貴州省亞熱帶作物研究所望謨科技示范園和南北盤江鎮(zhèn)達(dá)居基地。采集芒果的幼嫩葉片，經(jīng)無(wú)菌水清洗、液氮速凍后存于-80?℃冰箱備用。不同種質(zhì)資源的基本特性見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1??基因組DNA的提取??以13份芒果種質(zhì)資源的嫩葉為原材料，通過(guò)改良CTAB法提取其基因組DNA^[14]。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量，核酸蛋白測(cè)定儀（Themo NanoDrop 2000）測(cè)定基因組DNA的濃度和純度。

1.2.2 ?SRAP分析??PCR反應(yīng)體系^[15]：10×PCR buffer（不含Mg²⁺）2.5 μL，MgCl₂2.5 mmol/L，dNTPs 0.2?mmol/L，正向引物0.4 μmol/L，反向引物0.4 μmol/L，TaqDNA聚合酶1.5 U，基因組DNA 20 ng，補(bǔ)足ddH₂O至25?μL。SRAP引物序列見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)程序：94?℃預(yù)變性5 min;94?℃變性45 s，35?℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán);94 ℃變性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸8 min，4?℃保存。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3數(shù)據(jù)處理

電泳檢測(cè)圖譜中1條清晰條帶代表1個(gè)標(biāo)記。通過(guò)電泳條帶的有無(wú)進(jìn)行賦值[有帶的記為1，無(wú)帶的記為0，構(gòu)建（0，1）矩陣]，統(tǒng)計(jì)并記錄于Excel軟件中。采用NTSYS2.1軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，通過(guò)UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1遺傳多樣性分析

從表3結(jié)果得出，以13份芒果種質(zhì)資源的DNA為模板，對(duì)108對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，其中有17對(duì)引物擴(kuò)增的條帶多且多態(tài)性好。17對(duì)引物共產(chǎn)生擴(kuò)增帶161條，多態(tài)性條帶為133條，多態(tài)性比率為82.61%。每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為5～18不等，平均為9.47條。引物擴(kuò)增的多態(tài)性比率在57.14%～100%，且大部分引物擴(kuò)增的多態(tài)性偏高。引物ME1-EM6、ME3-EM10、ME4-EM4、ME4-EM5、ME5-EM3、ME5-EM9、ME7-EM6擴(kuò)增的總條帶數(shù)均大于10條，其中ME1-EM6、ME4-EM4、ME4-EM5和ME7-EM6這4對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條數(shù)較多，均大于10條。圖1為引物ME3-EM10所揭示的13份種質(zhì)資源的擴(kuò)增圖譜。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明SRAP技術(shù)能用于芒果種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，也表明了貴州芒果遺傳背景的復(fù)雜性。

2.2聚類分析

利用NTSYS軟件計(jì)算13份材料的遺傳相似系數(shù)，得出供試材料的遺傳相似性系數(shù)在0.602～0.820。其中桂熱芒10號(hào)與攀西紅芒遺傳相似系數(shù)最大，為0.820，說(shuō)明2份材料的親緣關(guān)系最近;桂熱芒82號(hào)和紅象牙芒遺傳相似系數(shù)最小，為0.602，說(shuō)明2份資源的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（表4）。

從聚類結(jié)果可見(jiàn)，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.665時(shí)，13份材料分為兩大類群：第Ⅰ類群為臺(tái)農(nóng)1號(hào)，該種質(zhì)資源為早熟品種;第Ⅱ類群包括引進(jìn)廣西的品種資源、貴州野生品種以及變異株等，它們?yōu)橹型硎炱贩N（圖2）。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.683時(shí)，第Ⅱ類分為3個(gè)亞類：第ⅰ亞類包括紅

象牙芒、紅芒6號(hào)和Mi-9共3種資源;第ⅱ亞類又可分為幾個(gè)小亞類：ⅲ-1包括桂熱82號(hào)和Mi-8，ⅲ-2包括Mi-6、凱特芒和金煌芒，ⅲ-3包括Mi-5、攀西紅芒、桂熱芒10號(hào)和串芒。進(jìn)一步分析2份野生種質(zhì)資源、2份實(shí)生材料與9份引進(jìn)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，結(jié)果表明，Mi-8和桂熱芒82號(hào)聚類在一起，說(shuō)明Mi-8與桂熱芒82號(hào)的親緣關(guān)系較近，也證實(shí)了實(shí)生單株的遺傳物質(zhì)未發(fā)生較大變異;Mi-9和紅芒6號(hào)聚類在一起，說(shuō)明Mi-9與紅芒6號(hào)的親緣關(guān)系較近;Mi-5與串芒、桂熱芒10號(hào)和攀西紅芒聚類在一起，說(shuō)明野生種質(zhì)資源Mi-5與串芒、桂熱芒10號(hào)和攀西紅芒的親緣關(guān)系較近;Mi-6與凱特芒和金煌芒聚類在一起，說(shuō)明野生資源Mi-6與凱特芒和金煌芒的親緣關(guān)系較近。

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