基于GC－MS研究不同產(chǎn)地三色藜麥種子的代謝物差異

時(shí)羽杰 李興龍 唐媛 董雨 鄔曉勇

摘要：為了研究不同生境對(duì)藜麥發(fā)育的影響，以不同產(chǎn)地的藜麥種子為研究對(duì)象，篩選顯著差異代謝物質(zhì)和相關(guān)代謝通路，利用GC-MS平臺(tái)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，分析了青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地產(chǎn)出的黑藜、紅藜、白藜種子的代謝輪廓，將原始數(shù)據(jù)經(jīng)XCMS online平臺(tái)預(yù)處理后進(jìn)行后續(xù)多元統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地的黑、紅、白藜麥種子的代謝特征均不相同，其中紅藜麥種子與白藜麥種子差異較大，而黑藜麥種子差異最小;紅藜存在顯著差異，共有特征峰570個(gè)，上調(diào)物少于下調(diào)物;黑藜差異最小，上、下調(diào)趨勢(shì)與紅藜一致;白藜差異較大，上、下調(diào)趨勢(shì)與紅藜和黑藜相反，共有特征峰486個(gè)，上調(diào)物質(zhì)多于下調(diào)物質(zhì);不同生境對(duì)藜麥的影響較大，黑藜和紅藜更適宜在青海都蘭縣種植，而白藜更適宜在四川鹽源縣種植。研究結(jié)果可以指導(dǎo)青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地藜麥的栽培育種，也為深入研究藜麥的抗逆性機(jī)理提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：作物栽培學(xué);藜麥;GC-MS;XCMS;代謝差異;抗逆性

中圖分類號(hào)：TS210.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract：In order to study the effects of different habitats on the development of quinoa， taking quinoa seeds from different habitats as research objects， significant differences in metabolites and related metabolic pathways are screened. The metabolic profiles of the seeds of black quinoa， red quinoa and white quinoa from Dulan County， Qinghai Province and Yanyuan County， Sichuan Province are analyzed through non-targeted metabonomics analysis with GC-MS platform. The original data are pretreated by XCMS online platform for subsequent multivariate statistical analysis. The results show that the metabolic characteristics of black， red and white seeds in Dulan county and Yanyuan County are different. Among them， the difference between red and white seeds from the two counties is larger， while the difference of the black quinoa seeds is the smallest. There are 570 characteristic peaks in red seeds which have significant differences， and the up-regulated substances are less than the down-regulated. The difference between black quinoa from two habitats is the smallest， and the up- and down-regulated trends are like that of red quinoa. There is secondly significant difference between the white seeds from the two habitats， and the up- and down-regulated trends are the opposite of that of the red and black quinoas， and 486 characteristic peaks are detected， with more up-regulated substances than down-regulated. Different habitats have great impact on quinoa. Black and red quinoas are more suitable to be planted in Dulan County， Qinghai Province， while white quinoa is more suitable to be planted in Yanyuan County， Sichuan Province. The conclusions could guide the cultivation and breeding of quinoa in Dulan county and Yanyuan County， and provide theoretical basis for further study of the stress resistance mechanism of quinoa.

Keywords：crop cultivation;quinoa;GC-MS;XCMS;metabolic differences;stress resistance

代謝組學(xué)（metabonomics/metabolomics）是繼基因組學(xué)、蛋白組學(xué)之后又一門(mén)新興的學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，旨在研究生物體或組織，甚至單個(gè)細(xì)胞的全部小分子代謝物（MV<1 000）成分及其動(dòng)態(tài)變化[1]，根據(jù)分析目的的不同又可以分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)。靶向代謝組學(xué)主要針對(duì)幾種目標(biāo)化合物或某條通路上涉及的部分代謝物，利用標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的檢測(cè)方法，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分析。非靶向代謝輪廓分析方法面向所有能檢測(cè)到的化合物，可以較全面地反映整體代謝狀態(tài)的變化，并通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析篩選差異代謝物，對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路分析，揭示其變化的生理機(jī)制，在轉(zhuǎn)基因植物非預(yù)期效應(yīng)研究[2]、非生物與生物脅迫研究中顯示出了極大的潛力。

藜麥，古代印加人稱之為“糧食之母”[3]。藜麥含有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、氨基酸、纖維素、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，含量明顯高于大多數(shù)常見(jiàn)谷物[4]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織于2013年正式將藜麥推薦為最適宜人類的“全營(yíng)養(yǎng)食品”[5]。藜麥還含有豐富的多酚類、黃酮類、皂苷等活性成分[6]，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿等生理特點(diǎn)。藜麥種子主要有白、黑、紅、黃等幾種顏色系，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)差異較大，藜麥中含有生物堿、多酚等物質(zhì)。黑藜中總多酚的含量最高，明顯高于紅藜和白藜，而紅藜和白藜中總多酚含量差異不大[7]。趙亞?wèn)|[8]研究發(fā)現(xiàn)青海的不同色系藜麥中，紅藜含皂苷最多，抗氧化性極強(qiáng)，白藜抗氧化性最弱。這些研究均表明，藜麥的生境對(duì)籽粒發(fā)育影響顯著。鑒于目前國(guó)內(nèi)從代謝組學(xué)方面對(duì)不同產(chǎn)地藜麥的研究甚少，本研究主要以非靶向代謝組學(xué)研究青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地的黑、白、紅藜麥，以獲取較為全面的代謝物質(zhì)信息，全面、準(zhǔn)確地分析其差異物質(zhì)和代謝通路，分析3種藜麥種子代謝物在不同生境下的異同，為揭示藜麥在不同栽培地區(qū)造成的差異等后續(xù)研究提供理論依據(jù)，指導(dǎo)藜麥的耕作與栽培。

1主要材料與儀器

1.1材料

分別選2018年采收自青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣（平均海拔3 000 m）和四川省涼山州的鹽源縣（平均海拔2 000 m）的黑、紅、白色藜麥種子，經(jīng)發(fā)芽試驗(yàn)篩選，取發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)相同的一批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每一個(gè)樣品均重復(fù)6次。文中所提到的青海都蘭縣黑藜、紅藜、白藜均以A，C，E表示，四川鹽源縣黑藜、紅藜、白藜均以B，D，F(xiàn)表示。

1.2試劑

核糖醇，甲氧氨基鹽酸鹽，N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），購(gòu)自Sigma Aldrich公司;吡啶，甲醇，氯仿，三甲基氯硅烷均為色譜純，成都科隆化學(xué)品有限公司提供。

1.3儀器

Agilent GC-MS 7890B 5977氣質(zhì)聯(lián)用儀，產(chǎn)地美國(guó);DB-5MS毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），購(gòu)自安捷倫公司（美國(guó)）;THZ-82水浴恒溫振蕩器，常州榮華儀器制造有限公司提供;通風(fēng)櫥、H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，產(chǎn)地湖南;ZLS-2真空離心濃縮儀，湖南赫西儀器有限公司提供。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1樣品制備

分別取來(lái)自青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地的黑、紅、白藜麥種子，參考LISEC等[9]的研究方法對(duì)植物樣本進(jìn)行提取，條件稍作優(yōu)化。對(duì)樣品進(jìn)行6次生物學(xué)重復(fù)，并做質(zhì)控樣本QC，QC樣本是將所有提取物的均等混合樣隨機(jī)插入檢測(cè)的樣本序列中，主要用于實(shí)驗(yàn)方法和儀器穩(wěn)定的校正。將所有樣品置于EP管，于真空離心濃縮儀中進(jìn)行揮干備用。

2.2樣品衍生化

在上述干燥后的樣品管中加入60 μL甲氧氨基鹽酸鹽（20 mg/mL吡啶溶液），于37 ℃振蕩反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢后再加入100 μL的N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺和1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）三甲基氯硅烷（MSTFA+1%TMCS），于37 ℃振蕩反應(yīng)30 min。將衍生化完成后的樣品用0.22 μm濾膜過(guò)濾[10]后轉(zhuǎn)移至適合GC-MS分析的內(nèi)襯管中。

2.3GC-MS分析條件

2.3.1色譜條件

采用DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管氣相色譜柱;升溫程序：起始溫度保持在80 ℃，2 min后以10 ℃/min升至190 ℃，再以3 ℃/min升至220 ℃，最后以20 ℃/min升至280 ℃，保持10 min;載氣：氦氣（體積分?jǐn)?shù)為99.999%）;恒流，流速為1 mL/min;進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。

2.3.2質(zhì)譜條件

電子碰撞內(nèi)能：70 eV;離子源溫度：220 ℃;傳輸線溫度：270 ℃;注射劑溫度：280 ℃;掃描速度：每20 s光譜全波段掃描法捕獲;溶劑延遲：420 s;質(zhì)量掃描范圍m/z：70～500。

2.4數(shù)據(jù)處理

將GC-MS原始數(shù)據(jù)[11]上傳至XCMS online程序，進(jìn)行行峰識(shí)別（peaks identification）、峰過(guò)濾（peaks filtration）、峰對(duì)齊（peaks alignment）等[12]，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)參數(shù)[13]，最后得到包括質(zhì)核比（m/z）和保留時(shí)間（rt）及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Excel進(jìn)行后續(xù)整理，用SIMCA-P（v14.0） 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），結(jié)合XCMS分析篩選差異代謝物，進(jìn)行后續(xù)的差異代謝物統(tǒng)計(jì)分析。

3結(jié)果與分析

3.1主成分分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)XCMS進(jìn)行峰識(shí)別、過(guò)濾、對(duì)齊等處理后，結(jié)果見(jiàn)圖1。將處理后的數(shù)據(jù)整理后導(dǎo)入SIMCA-P軟件中進(jìn)行主成分分析（PCA），用UV處理數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擬合后方程的R2X=0.855>0.5，說(shuō)明擬合性好，且Q2=0.648，與R2X相差較小，說(shuō)明擬合方程的穩(wěn)定性好。圖2為得到的PCA得分，由圖2可知，QC的重復(fù)樣本間較為聚集，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)儀器較為穩(wěn)定，準(zhǔn)確性較好。此外，6組樣品中除了B6，D3和E3外的所有點(diǎn)基本都處在95%的置信區(qū)間內(nèi)，且每一組內(nèi)的重復(fù)樣品較為聚集，而各組間的樣品又相對(duì)較為分散，組與組之間有明顯的界限，說(shuō)明樣品組內(nèi)的重復(fù)性好，數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確;而樣品組間的明顯界限說(shuō)明，各組間存在著明顯的差異。還可以看出，在A組、C組、E組間，A組與C組、E組在第一主成分上被明顯分開(kāi)，其中A組被分在了第一主成分的左邊，而C組和E組被分在了第一主成分的右邊，說(shuō)明A組與C組、E組間差異較大，C組和E組間差異較小。B組、D組、F組間也存在著一樣的差異趨勢(shì)，說(shuō)明同一產(chǎn)地的不同色系藜麥間也存在著明顯差異。用DModX和置信區(qū)間進(jìn)行初步篩選，剔除B6，D3，E2這3個(gè)異常點(diǎn)[14]，以保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。

PCA只能反映樣品的整體趨勢(shì)，不利于發(fā)現(xiàn)組間差異和差異化合物，所以需要通過(guò)正交-偏最小二乘法判別（OPLS-DA）來(lái)更為準(zhǔn)確地分析數(shù)據(jù)，尋找組間的差異[15]。首先根據(jù)種子顏色進(jìn)行分組：A-B組、C-D組和E-F組，用Par算法進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，用OPLS-DA方程進(jìn)行擬合，得到擬合方程的模型參數(shù)見(jiàn)表1。其中所有的R2X，R2Y和Q2都大于0.5且各參數(shù)間差異較小，說(shuō)明擬合方程較為可靠。由方程擬合得到OPLS-DA得分圖，見(jiàn)圖3中的a），b）和c）。由圖3可知，A-B組、C-D組和E-F組的分離程度較大，說(shuō)明各組間有明顯差異，且組內(nèi)點(diǎn)相對(duì)較為聚集，表明樣品間重復(fù)性好且較為穩(wěn)定。再經(jīng)過(guò)OPLS-DA置換檢驗(yàn)來(lái)判斷方程是否過(guò)擬合，得到檢驗(yàn)圖（見(jiàn)圖3中的d），e）和f））。圖3中所有的Q2點(diǎn)從左到右均低于最右邊的原始Q2點(diǎn)，且Q2<0，R2和Q2的回歸線與橫坐標(biāo)交叉或者小于0，說(shuō)明評(píng)估模型可靠有效[16]。

3.3篩選顯著性差異代謝物

采用XCMS的Pairwise中的對(duì)比分析，上傳A-B組、C-D組和E-F組數(shù)據(jù)進(jìn)行分組分析處理，得到Metabolomic Cloud Plot圖，設(shè)置參數(shù)p-value<0.01，fold change>1.5，進(jìn)行顯著性差異代謝物的篩選，得到代謝物的云圖，見(jiàn)圖4。圖中M線上部為上調(diào)，M線下部為下調(diào)，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間，縱坐標(biāo)是m/z。圖4顯示，A-B組有140個(gè)差異代謝物，上調(diào)的有90個(gè)，下調(diào)的有50個(gè);C-D組有570個(gè)差異代謝物，上調(diào)的有209個(gè)，下調(diào)的有361個(gè);E-F組有486個(gè)代謝物，上調(diào)的有379個(gè)，下調(diào)的有107個(gè)。其中A-B組中上調(diào)物質(zhì)占總物質(zhì)的64.28%，下調(diào)物質(zhì)占35.72%;E-F組中上調(diào)物質(zhì)占總物質(zhì)的77.98%，下調(diào)物質(zhì)占總物質(zhì)的22.02%，兩組趨勢(shì)和比例相差不大。C-D組中，上調(diào)物質(zhì)占總物質(zhì)的36.67%，下調(diào)物質(zhì)占總物質(zhì)的6333%，與A-B組和E-F組完全相反。其中C-D組間差異物質(zhì)最多，差異最大，這一結(jié)果也與胡一晨等[7]的報(bào)道一致。

3.4差異代謝物通路分析

將上述篩選鑒定的差異代謝物上傳至Metaboanalyst，利用MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行超幾何檢驗(yàn)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，根據(jù)代謝通路的濃縮，識(shí)別出可能的受生物擾動(dòng)的代謝通路[17]。對(duì)差異代謝物和通路進(jìn)行相關(guān)性分析，得到多條相關(guān)通路。根據(jù)-log p值和Impact值綜合分析，每一組篩選出最為顯著的2條代謝通路，如表2所示。

由表2可知，黑藜中主要是吲哚生物堿合成途徑，合成的生物堿可以降血糖和血脂，有效治療糖尿病，與房娜[18]的研究結(jié)果一致;泛酸與CoA生物合成途徑與植物的碳水化合物、脂肪酸、蛋白質(zhì)和能量代謝密切相關(guān)。紅藜中主要是硫代謝途徑，它與植物抗逆性密切相關(guān)，其途徑中SO2-4經(jīng)過(guò)植物一系列還原與同化反應(yīng)后進(jìn)入有機(jī)骨架，生成半胱氨酸（Cys），植物再以Cys為前體，合成眾多具有重要生物學(xué)功能的代謝產(chǎn)物，直接關(guān)系到植物耐逆境脅迫和農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)，苯丙氨酸代謝途徑與植物的防御系統(tǒng)密切相關(guān)。白藜中主要是谷胱甘肽代謝途徑，它與植物直接和間接的抗逆功能活動(dòng)密切相關(guān)[19];丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑與糖代謝密切相關(guān)。

4討論與結(jié)論

青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣是典型的高原大陸性氣候，日照時(shí)間長(zhǎng)，太陽(yáng)輻射強(qiáng)，晝夜溫差大，常年干旱、多風(fēng)、少雨，年平均氣溫4 ℃左右;而四川省涼山州鹽源縣的日溫差較大，年均氣溫12.1 ℃，最高溫度30.7 ℃，最低溫度-11.3 ℃;雖然兩地都較適宜藜麥的種植，但不同藜麥品種間的適應(yīng)性不同。

本研究對(duì)青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地的黑、紅、白藜麥種子做了代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兩地種子之間都存在著明顯差異，其中紅藜麥種子與白藜麥種子差異較大，而黑藜麥種子差異最小。差異物質(zhì)主要是脂肪酸（棕櫚酸、肉桂酸、油酸）、糖類（乳糖、葡萄糖、脫氧糖苷）和氨基酸（脯氨酸、絲氨酸、組氨酸）等。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，四川鹽源縣與青海都蘭縣的黑藜相比，差異代謝物纈氨酸表達(dá)下調(diào)，而纈氨酸是合成α-酮異戊酸的前體，α-酮異戊酸在酶作用下生成酮泛解酸，再與β-Ala合成泛酸。纈氨酸的下調(diào)導(dǎo)致泛酸合成受阻，使得植物體的碳水化合物、脂肪酸、蛋白質(zhì)和能量代謝受阻。四川鹽源縣和青海都蘭縣的紅藜相比，差異代謝物O-Acetylserine表現(xiàn)為顯著下調(diào)，而這與半胱氨酸（Cys）密切相關(guān)。O-Acetylserine是Cys合成的前體，Cys合成受阻會(huì)導(dǎo)致硫代謝受阻。這些結(jié)果均表明，青海都蘭縣的黑藜與紅藜均比四川鹽源縣有較強(qiáng)的耐受性，均能通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝通路的變化更好地去適應(yīng)青海相對(duì)低溫的生境。而四川鹽源縣和青海都蘭縣的白藜相比，差異代謝物谷胱甘肽（還原型）表達(dá)上調(diào)。因?yàn)楣入赘孰挠泻軓?qiáng)的抗氧化性，其上調(diào)增加直接影響到植物的抗逆性，使得四川鹽源縣的白藜能更快地通過(guò)代謝通路的變化去消除體內(nèi)過(guò)氧化物以及自由基等，使藜麥進(jìn)行正常的生長(zhǎng)，因此四川鹽源縣的白藜比青海都蘭縣的白藜有更好的適應(yīng)性，而這一研究結(jié)果也與青海都蘭縣白藜麥栽培的結(jié)果一致——溫度的變化會(huì)導(dǎo)致白藜生長(zhǎng)緩慢[21]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)代謝組學(xué)分析四川鹽源縣與青海都蘭縣的黑、紅、白藜，發(fā)現(xiàn)兩地的同種藜麥間代謝物質(zhì)有很大差異。在此基礎(chǔ)上通過(guò)分析差異代謝物的代謝通路，發(fā)現(xiàn)青海都蘭縣的黑藜和紅藜比四川鹽源縣具有更好的抗逆性，而青海都蘭縣的白藜較四川鹽源縣的白藜抗逆性弱?？寡趸耘c抗逆性密切相關(guān)，這與趙亞?wèn)|等[22]的研究結(jié)果一致。所以紅藜和黑藜更適宜在青海都蘭縣種植，而白藜更適宜在四川鹽源縣種植。研究結(jié)果可為后續(xù)在代謝途徑層面上深入研究藜麥的抗逆性機(jī)理提供理論依據(jù)。

本研究所選取的樣本種類過(guò)少，在對(duì)不同生境下藜麥種子進(jìn)行分析時(shí)只進(jìn)行了代謝層面的分析，缺少對(duì)通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)和關(guān)鍵酶的分析，對(duì)整個(gè)機(jī)理的解釋存在著一定局限性。后續(xù)將結(jié)合多組學(xué)技術(shù)包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等，對(duì)不同生境下黑、紅、白藜麥的差異進(jìn)行更加全面深入的分析，以期選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的藜麥新品種，為藜麥的栽培種植提供理論依據(jù)。

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