澳洲堅果油微乳體系的構(gòu)建

涂行浩 張帥中 唐景華 杜麗清 帥希祥 張明

摘? 要? 為擴大澳洲堅果油應(yīng)用領(lǐng)域，構(gòu)建了澳洲堅果油微乳體系。以微乳區(qū)面積為評價指標，采用偽三元相圖法，并結(jié)合單因素試驗和Box-Behnken試驗，對表面活性劑、助表面活性劑種類及用量和制備溫度進行優(yōu)選，并對相圖中O/W型微乳中心區(qū)域的兩條可稀釋線上靠近中心的兩個微乳液配方的粒徑測定，評價微乳穩(wěn)定性。澳洲堅果油微乳液較佳的制備工藝為：吐溫60 （Tween 60）與聚氧乙烯氫化蓖麻油（PEG-40）質(zhì)量比2.5為混合表面活性劑、聚乙二醇400（PEG400）與澳洲堅果油質(zhì)量比3.5為混合油相、制備溫度60 ℃，可制備出微乳區(qū)面積較大，無色透明并可無限稀釋的微乳液，試驗得到SME為13.61%。微乳液在長期貯存和大量稀釋過程中，粒徑變化較小，穩(wěn)定性較好。

關(guān)鍵詞? 澳洲堅果油;微乳區(qū)面積;Box-Behnken試驗;粒徑;穩(wěn)定性

中圖分類號? TS201.2? ? ?文獻標識碼? A

澳洲堅果（Macadamia integrifolia）是一種原產(chǎn)于澳大利亞的樹生堅果，也叫夏威夷果，因其果仁風味獨特、營養(yǎng)豐富以及經(jīng)濟價值高特點，被譽為“干果皇后”?，F(xiàn)已在我國熱帶地區(qū)廣泛種植，初步統(tǒng)計種植面積已超過150 hm2[1-2]。澳洲堅果果仁中含油70%～80%，且80%以上的脂肪酸是單不飽和脂肪酸，主要以油酸（約60%）和棕櫚油酸（約20%）為主，并含有大量生育酚和角鯊烯等活性成分，具有較高的保健價值及功能特性[3-4]。精制的澳洲堅果油呈淡黃色，除作為功能油脂食用外，還可用于高檔化妝品制造的原料[5]。特別是其脂肪酸組成和與皮脂類似，易于吸收，使它有利于作為皮膚護理產(chǎn)品以及抗衰老面霜的關(guān)鍵成分[6-7]。另外，多項研究表明，澳洲堅果油在預防癌癥[8]、降低炎癥[6]和降低膽固醇[9]等方面具有較好的功效。

澳洲堅果油作為一種功能性油脂，受限于其水溶性的影響，市面上產(chǎn)品形式較為單一。為提高澳洲堅果油的溶解度和分散性，可通過制備微乳液、環(huán)糊精絡(luò)合以及脂質(zhì)體包封等方法改善。而微乳液具有制備工藝簡單、熱力學穩(wěn)定以及增溶性好等一系列優(yōu)點，且在藥物傳導體系已經(jīng)運用非常成熟，具有較好的應(yīng)用前景[10-12]。近年來微乳化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于常見植物油、色素以及精油等[13-17]的運載和包埋，不僅可以改善其水溶性[18]，還能大幅度提升儲藏穩(wěn)定性[19]。制備微乳區(qū)域越大，意味著在一定范圍內(nèi)被大量稀釋后，其液滴形態(tài)和穩(wěn)定性可基本保持不變，即穩(wěn)定性越好[20-21]。本文以澳洲堅果油為油相，借助少量的外部能量如攪拌，以微乳區(qū)面積為指標，采用單因素試驗設(shè)計、Box-Behnken試驗設(shè)計成功構(gòu)建并優(yōu)選出可無限稀釋、澄清透明、穩(wěn)定性好的O/W型微乳液，為將來進一步擴大澳洲堅果油在食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍提供技術(shù)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料及試劑? 澳洲堅果油：國家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心澳洲堅果研發(fā)部提供，冷榨制取。

吐溫80（Tween80，TW-80）、吐溫60（Tween60，TW-60）、吐溫20（Tween20，TW-20）、司盤80（Span80，SP-80）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（PEG-40）、甘油、1，2-丙二醇，均為食品級，山東優(yōu)索化工科技有限公司;聚乙二醇400（PEG 400），醫(yī)藥級，山東優(yōu)索化工科技有限公司;聚蓖麻酸甘油酯（PGPR），食品級，德國Merck公司;無水乙醇、正丁醇、亞甲基藍、蘇丹紅Ⅲ，國產(chǎn)分析純，國藥試劑有限公司。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? Nano-ZS90粒徑分析儀，英國Malvern儀器有限公司;ETS-D5加熱型磁力攪拌器，德國IKA公司;LVEM5臺式透射電子顯微鏡，Quantum量子科學儀器貿(mào)易（北京）有限公司;FV10i激光共聚焦顯微鏡，奧林巴斯（中國）有限公司;ME-104精密型電子天平，Mettler Toledo中國有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 澳洲堅果油微乳的制備? 采用轉(zhuǎn)相乳化法制備澳洲堅果油微乳。將澳洲堅果油與助表面活性劑混合作為混合油相，分別按不同質(zhì)量比（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9）與表面活性劑混合均勻，在磁力攪拌的條件下逐滴加入去離子水，記錄體系由澄清透明變渾濁，再由渾濁變澄清透明時轉(zhuǎn)變點的臨界加水量，計算各組分（混合油相、表面活性劑、去離子水）的質(zhì)量分數(shù)。然后分別以混合油相、表面活性劑、水相為3個頂點，根據(jù)各組分質(zhì)量分數(shù)確定臨界點在相圖中的位置，將各點連接起來，繪制偽三元相圖，計算微乳區(qū)面積[15-16]。

1.2.2? 微乳類型鑒定及形態(tài)觀察? 微乳類型用染色法鑒定[22];形態(tài)觀察分別在激光共聚焦顯微鏡及透射電子顯微鏡下進行[11， 23]。

1.2.3? 微乳配方的初步篩選? （1）助表面活性劑的確定。將無水乙醇、1， 2-丙二醇、PEG400、甘油和正丁醇作為助表面活性劑，與澳洲堅果油按照3∶1配比作為混合油相，然后與表面活性劑TW-60/PEG-40（3∶1）混合均勻，按照1.2.1方法制備微乳。通過繪制偽三元相圖，比較各自形成的微乳區(qū)面積大小，確定最佳助表面活性劑種類。

（2）單一表面活性劑的初步選擇。在前期預試驗的基礎(chǔ)上，篩選PEG400：澳洲堅果油=3∶1為較佳的混合油相比例，分別以TW-80、TW-60、TW-20、SP-80、PEG-40、PGPR作為表面活性劑，按照1.2.1方法制備微乳。通過肉眼觀察，以外觀均一透明，流動性好為作為微乳形成的標準[19]，按照1.2.1方法制備微乳，1.2.2方法對微乳進行鑒定，初步篩選表面活性劑。

（3）復合表面活性劑的篩選。將上述初步篩選得到的表面活性劑TW-60和PEG-40，分別按照質(zhì)量比5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5與SP-80復配，固定PEG400/澳洲堅果油（3∶1）為混合油相，按照1.2.1方法制備微乳，比較成乳狀況和最小可稀釋比（The minimum dilution ratio， DR），DR值為微乳擬三元相圖中可稀釋線所對應(yīng)的混合表面活性劑與堅果油的最小質(zhì)量比。

1.2.4? 單因素試驗? 按照1.2.1中的方法制備微乳，分別考察TW-60與PEG-40質(zhì)量比、PEG400與堅果油質(zhì)量比和制備溫度對澳洲堅果油微乳的微乳區(qū)面積大小的影響。

1.2.5? 響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化微乳配方? 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件，按照Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面試驗，對澳洲堅果油微乳配方進一步優(yōu)化。選擇TW-60與PEG-40質(zhì)量比（A）、PEG400與堅果油質(zhì)量比（B）、制備溫度（C）三個因素為考察因素，以微乳區(qū)面積SME為響應(yīng)值，確定最佳試驗條件。因素水平如表1所示。

1.2.6? 微乳粒徑及多分散指數(shù)（Polydispersity index， PDI）的測定? 采用粒徑分析儀測定堅果油微乳的粒徑大小和PDI值[18]。平行測定3次，結(jié)果取平均值。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次，使用Microsoft Excel軟件、Design-Expert 8.0.6軟件和Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖和統(tǒng)計分析，AutoCAD 2010軟件用于計算微乳區(qū)面積。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 微乳配方初選結(jié)果

2.1.1? 助表面活性劑的確定? 在微乳偽三元相圖中，微乳區(qū)面積（SME）大小與載油量、成乳能力以及穩(wěn)定性均密切相關(guān)。助表面活性劑通過滲透到表面活性劑分子之間的空隙，從而形成一個無序的混合膜，以此增加微乳界面柔韌性，減少其形成時所需的界面彎曲能，從而形成微乳。一般選擇短鏈醇作為助表面活性劑，且醇的鏈長對微乳的粒徑，分散性和穩(wěn)定性有著較大的影響[17， 19]。由圖1可知，當以PEG400為助表面活性劑時，形成的SME最大，顯著大于以無水乙醇、1， 2-丙二醇、甘油、正丁醇作為助表面活性劑時的SME（p<0.05），所以選擇PEG400為最佳助表面活性劑。

2.1.2? 表面活性劑初選結(jié)果? 微乳制備過程中不同表面活性劑，對微乳的性質(zhì)及形成能力均有較大影響。DR反映了制備堅果油微乳時表面活性劑的最少用量，因此，以DR為指標，初步篩選最佳的堅果油微乳體系的表面活性劑，結(jié)果見表2。對于Tween系列表面活性劑，隨著疏水鏈的長度變短，HLB值增大，越不利于微乳的形成，這與梁蓉等[21]的研究結(jié)果一致。表面活性劑的HLB值決定微乳的類型，HLB在3～8的表面活性劑可制備W/O型微乳，HLB在8～18的表面活性劑可制備O/W型微乳[24]?？紤]到單一的表面活性劑不能很好的形成微乳或形成的微乳不穩(wěn)定，因此在單一乳化劑初選結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過考察成乳效果和DR值。試驗結(jié)果表明，選取TW-60和PEG-40作為復合表面活性劑較為合適。

2.2? 單因素試驗結(jié)果

2.2.1? 表面活性劑配比的影響? 將TW-60/PEG- 40分別按質(zhì)量比5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5混合作為混合表面活性劑，按照1.2方法制備微乳，繪制出擬三元相圖，計算SME，得到的結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，TW-60與PEG-40在質(zhì)量比3∶1條件下成乳區(qū)域最大，SME顯著高于其他配比，這可能是因為該配比與澳洲堅果油乳化所需的HLB值最接近。所以響應(yīng)面試驗中選擇TW-60/PEG-40質(zhì)量比3∶1為中心點進行優(yōu)化。

2.2.2? 助表面活性劑含量的影響? 將PEG400/堅果油分別按質(zhì)量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1及5∶1混合為混合油相，按照1.2.1方法制備微乳，繪制出偽三元相圖，計算SME。由圖3可知，隨著PEG400含量的增加，SME明顯增大，當PEG400與堅果油質(zhì)量比為3∶1時，SME達到最大，這是因為隨著助表面活性劑含量的增加，降低了形成微乳所需的表面活性劑含量[16];繼續(xù)增加助表面活性劑，SME反而減小，這可能與形成的微乳體系內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)。在最佳條件下，助表面活性劑正好完全鑲嵌到表面活性劑中，此時形成的微乳結(jié)構(gòu)中增溶空間最大，載油量最大。但是當助表面活性劑增加至過量時，可與表面活性劑的極性端締合使混合膜變得松散，微乳區(qū)面積反而減小，而且會導致混合膜強度降低，影響微乳穩(wěn)定性[19-20]。因此，綜合考慮響應(yīng)面試驗中PEG400/堅果油質(zhì)量比為3∶1為中心點進行優(yōu)化較為合適。

2.2.3? 制備溫度的影響? 制備溫度對微乳區(qū)面積的影響如圖4所示。圖4反映了在不同溫度條件下所制備微乳的SME的變化趨勢。當溫度為90 ℃時SME最大，與60 ℃條件下所形成SME差異不顯著，溫度升高對于提升微乳區(qū)的面積并不十分明顯，但隨著溫度的進一步升高，由于澳洲堅果油富含不飽和脂肪酸，可能導致微乳中的澳洲堅果油加速氧化，引起變質(zhì)。因此，綜合考慮選擇微乳的制備溫度60 ℃為中心點進行優(yōu)化較為合適。

2.3? 響應(yīng)面試驗及結(jié)果分析

2.3.1? 響應(yīng)面法確定堅果油微乳較佳配方? 將TW-60與PEG-40質(zhì)量比A（n）、PEG400與堅果油質(zhì)量比B（k）和制備溫度C（t）經(jīng)過如下變換：A=（n-3）/2，B=（k-3）/1，C=（t-60）/15后作為自變量，以試驗中繪制偽三元相圖所計算得到的微乳區(qū)面積SME（%）為響應(yīng)值，響應(yīng)面分析實驗方案及結(jié)果見表3，回歸方程方差分析結(jié)果見表4。采用Design-Expert 8.0.6軟件，對表3中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得出以微乳區(qū)面積SME（%）為目標函數(shù)的二次回歸方程：

表4回歸統(tǒng)計分析結(jié)果表明：選取的三個因素對SME的影響順序為：PEG400與堅果油質(zhì)量比（B）>制備溫度（C）>TW-60與PEG-40質(zhì)量比（A）。模型的F=13.23，p=0.0013<0.01，表明實驗的二次模型是極顯著的，具有統(tǒng)計學意義。失擬項p值=0.0598>0.05，說明模型不失擬，回歸決定系數(shù)R2=0.9445，校正決定系數(shù)R2Adj=0.8731，說明該二次多項模型可以解釋87.31%的響應(yīng)值的變化，模型能夠充分擬合實驗數(shù)據(jù)。因此，可以利用該回歸方程對SME的變化進行分析。模型中二次項A2、B2對SME的影響極顯著（p<0.01），二次項C2對SME的影響為顯著（p<0.05）;一次項B對SME的影響極顯著（p<0.01），一次項A、C和交互項AB、AC、BC對SME的影響均不顯著（p>0.05），無統(tǒng)計學意義。

明該因素對SME的影響越大，相應(yīng)表現(xiàn)為SME數(shù)值變化的大小。由等高線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。從圖5能夠看出影響SME最大的因素是B，達到極顯著水平，其次是C和A，表4回歸分析結(jié)果也與此相吻合。

2.3.2? 驗證試驗? 通過Design Expert軟件分析確定的微乳液最佳制備工藝為TW-60與PEG-40質(zhì)量比2.51、PEG400與堅果油質(zhì)量比3.62、制備溫度63.8 ℃，此條件下SME的理論預測值為14.13%?？紤]到實際操作可行性，將工藝條件調(diào)整為TW-60與PEG-40質(zhì)量比2.5、PEG400與堅果油質(zhì)量比3.5、制備溫度60 ℃，按1.2.1的方法繪制偽三元相圖如圖6所示。試驗得到SME為（13.61±0.42）%，模型預測值為13.74%，與理論預測值相差不大，說明模型可靠，擬合度好，可用于澳洲堅果油微乳液制備工藝參數(shù)優(yōu)化和回歸分析。優(yōu)化得到的微乳液SME數(shù)值與梁蓉等[21]制備的丁香油微乳相當。

2.4? 微乳類型鑒定結(jié)果

如圖7所示，在微乳液表面滴加等量染液后觀察，藍色亞甲基藍在微乳中的擴散速度明顯快于紅色蘇丹紅Ⅲ的擴散速度，顏色逐漸擴散到微乳液中表明所制備的澳洲堅果油微乳為水包油（O/W）型。圖8為不同配方微乳樣品，從2個配方樣品外觀可以看出澳洲堅果油微乳液基本為澄清透明的液體。

采用上述試驗方法制備的微乳劑進行形態(tài)觀察，激光共聚焦顯微鏡觀察的形態(tài)見圖9所示，由圖可知澳洲堅果油微乳成球形，粒徑較小，分布均一;通過透射電鏡觀察觀察微乳形態(tài)見圖10所示，由圖可知澳洲堅果油微乳形態(tài)規(guī)整，電鏡左滴加亞甲基藍，右滴加蘇丹紅Ⅲ。

2.5? 堅果油微乳的粒徑分布及稀釋、貯藏穩(wěn)定性

為探究澳洲堅果油經(jīng)微乳包埋后的穩(wěn)定性情況，分別選擇圖6中O/W型微乳中心區(qū)域位置的兩條無限稀釋線上靠近中心的兩個配方點：樣品一：混合表面活性劑（TW-60∶PEG-40=2.5∶1）：混合油（PEG400：堅果油=3.5∶1）：水=12∶3∶35（質(zhì)量比）;樣品二為：混合表面活性劑（TW-60∶PEG-40=2.5∶1）：混合油（PEG400∶堅果油=3.5∶1）：水=21∶9∶56（質(zhì)量比），如圖8所示，通過粒徑測定，評估其穩(wěn)定性。

粒徑大小和分布是微乳性質(zhì)最主要的評價指標，澳洲堅果油微乳的粒徑分布見圖11，澳洲堅果油微乳的粒徑分布較為理想，平均粒徑為15.23 nm。由表5可知，澳洲堅果油微乳在經(jīng)過10倍、100倍水相稀釋后，微乳粒徑變化不大，這表明微乳在稀釋過程中粒徑能基本保持恒定，而且微乳稀釋前后的多分散指數(shù)PDI（Polydispersity index）值均較小，說明2種配方制備的微乳稀釋穩(wěn)定性較好。PDI可反應(yīng)堅果油微乳中粒子的分散寬度，通過粒徑分析儀測定（通過儀器自帶軟件按照國際化標準ISO 13321計算得到）。PDI值在0.1～0.3之間則表示樣品是單分散體系，PDI值越大，體系越復雜，表5中測定的PDI值表明澳洲堅果油微乳是單分散體系。儲藏穩(wěn)定性也是影響微乳應(yīng)用的重要因素，試驗通過測定乳液粒徑隨時間的變化情況來表征。由表5可知。在儲藏60 d內(nèi)，澳洲堅果微乳粒徑變化不大，無明顯差異，PDI值在儲藏過程中也無明顯變化，表明2種微乳均能保持良好的貯藏穩(wěn)定性。

3? 討論

本研究采用轉(zhuǎn)相乳化法制備微乳液，通過繪制偽三元相圖，以及單因素試驗和Box-Behnken試驗成功構(gòu)建澳洲堅果油O/W微乳體系，并確定了微乳較佳配方：TW-60與PEG-40質(zhì)量比2.5、PEG400與堅果油質(zhì)量比3.5、制備溫度60 ℃，此條件下形成微乳液的微乳區(qū)面積可達13.61%，在DR值為6∶4條件下，澳洲堅果油最大載量占比達到25.0%，并可加水無限稀釋。作為一種經(jīng)濟價值較高的油脂，該比例已經(jīng)足夠?qū)ζ溥M一步開發(fā)應(yīng)用。通過考察微乳區(qū)中心區(qū)域的兩個配方樣品在長期儲存、大量稀釋過程中粒徑大小的變化情況，結(jié)果表明兩種微乳粒徑變化不大，表明其穩(wěn)定性良好。另外，儲藏試驗表明粒徑較大的澳洲堅果油微乳至少可貯藏100 d，稀釋前后的多分散指數(shù)PDI值均較小，也說明制備的澳洲堅果油微乳液性質(zhì)穩(wěn)定。

澳洲堅果油的生物活性功能被越來越多的研究結(jié)果所證實，作為一種保健價值較高的功能性植物油脂，市面上關(guān)于澳洲堅果油的加工產(chǎn)品以及以往的科學研究僅限于制作堅果油微膠囊、粉末油脂等方面，雖克服了澳洲堅果油易被氧化的不足，但產(chǎn)品為固體狀態(tài)，且工業(yè)化生產(chǎn)復雜，大大限制了在食品中的進一步應(yīng)用。本研究提供了一種切實可行的方案，將澳洲堅果油制備成澄清透明、水包油型的食品級微乳液，不但克了服其易氧化和疏水特性，且研究結(jié)果表明該微乳液穩(wěn)定性良好，表現(xiàn)出熱力學穩(wěn)定、粒徑小、增容性強等優(yōu)點。另外，整個工藝過程較為簡單，不需特殊設(shè)備即可大批量生產(chǎn)，在功能食品以及化妝品領(lǐng)域應(yīng)用前景良好。

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