尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種的磷酸化應激誘導蛋白1（FoSTIP1）基因的克隆及表達分析

齊興柱 汪軍 劉磊

摘? 要? 本研究克隆了尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4， Foc4）轉(zhuǎn)錄因子FoSkn7一個候選的下游基因，結(jié)果表明該基因cDNA編碼序列全長1737 nt，編碼一個含578個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。對其編碼的蛋白進行了結(jié)構域和進化分析，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)含有脅迫誘導蛋白（stress-in-ducible protein-1， STI1）結(jié)構域和多個三角形4肽重復序列結(jié)構域（tetratricopeptide repeat， TPR）。該蛋白質(zhì)與尖孢鐮刀菌番茄?；偷牧姿峄瘧ふT導蛋白1（STIP1）親緣關系最近，因此初步將其確定為Foc4的磷酸化應激誘導蛋白并命名為FoSTIP1。采用相對熒光定量PCR方法分析了該基因在野生型B2菌株入侵香蕉苗根部及在外源H2O2誘導情況下的表達變化，也分析了FoSKN7基因缺失突變體中該基因在外源H2O2誘導情況下的表達。結(jié)果表明在入侵香蕉苗根部及在外源H2O2誘導情況下，B2菌株中的FoSTIP1表達均有上調(diào)，而FoSKN7基因缺失突變體中FoSTIP1即使有H2O2誘導，其表達也遠低于B2菌株中的FoSTIP1。推測FoSTIP1可能是FoSkn7的靶基因并參與了Foc4抗外源氧化脅迫。

關鍵詞? 尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種;磷酸化應激誘導蛋白;表達特性

中圖分類號? S432.4? ? ? 文獻標識碼? A

當細胞面臨各種環(huán)境脅迫時，細胞內(nèi)熱休克蛋白基因被激活并表達，導致熱休克蛋白大量產(chǎn)生。熱休克蛋白主要作為分子伴侶參與到蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運及組裝等過程，能恢復或加速清除細胞內(nèi)已變性的蛋白質(zhì)進而穩(wěn)定細胞結(jié)構[1]。近年來的研究表明，分子伴侶如Hsp70和Hsp90生物功能的發(fā)揮受到各種輔助伴侶分子的調(diào)控。磷酸化應激誘導蛋白（stress-inducible protein 1， STIP1）是迄今為止研究最為廣泛的輔助伴侶分子，也被稱為熱休克蛋白70/90組織蛋白[heat shock protein （HSP） 70/90 organizing protein， HOP]，是一個62.6 ku蛋白，有9個三角形4肽重復結(jié)構域和一個核定位信號（NLS）[2]。該蛋白能夠直接與Hsp70和Hsp90相結(jié)合，并且作為連接體分子，把細胞質(zhì)中的Hsp70-client蛋白復合物轉(zhuǎn)運到Hsp90上[3]。STIP1的TRR結(jié)構域在Hsp90伴侶機制中參與Hsp70和Hsp90的結(jié)合[4]。這種蛋白質(zhì)復合物參與了多種細胞過程，包括轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、病毒復制、信號轉(zhuǎn)導和細胞分裂[5-6]。核定位信號序列允許STIP1在細胞周期蛋白激酶的控制下從細胞質(zhì)運輸?shù)郊毎薣2]。

然而，作為一個熱休克蛋白的輔助伴侶分子，除了釀酒酵母中報道過STIP1[7]之外，目前在植物和真菌中，無論國內(nèi)還是國外的文獻中都未見關于STIP1的報道。

Foc4是香蕉枯萎病的強致病性病原菌，這種病原菌對海南省乃至我國香蕉種植業(yè)造成了重大影響。本實驗室在研究Foc4抗外源氧化脅迫的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)過程中獲得了一個候選的cDNA片段與已報道STIP1基因高度同源[7]，同時發(fā)現(xiàn)在FoSkn7轉(zhuǎn)錄因子缺失突變體中，該基因的表達大幅下調(diào)。因此，筆者將該預測基因命名為FoSTIP1，并對其進行了克隆鑒定和表達分析，為進一步開展該類蛋白作用機理研究提供基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗用菌株和香蕉苗? Foc4的野生型B2菌株分離自海南省樂東縣香蕉枯萎病病株，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所提供。FoSKN7基因缺失突變體由本實驗室制備。袋裝巴西蕉（Musa AAA， Cavendish cv. Brazil）組培苗購自海南省儋州市組培中心。

1.1.2? 試劑、引物及培養(yǎng)基? 植物總RNA提取試劑盒，PCR Mix反應混合物，反轉(zhuǎn)錄試劑盒[FastKing RT Kit （With gDNase）]和熒光定量PCR試劑盒[Talent qPCR PreMix （SYBR Green）]均為北京天根生化科技有限公司的產(chǎn)品。PCR引物（表1）由上海生工生物科技有限公司合成。真菌菌株的培養(yǎng)采用葡萄糖-馬鈴薯培養(yǎng)基（potato- glucose-agar medium， PDA; potato-glucose-dextrose broth medium， PDB）。香蕉苗采用自來水培養(yǎng)。

1.2? 方法

1.2.1? 菌株及香蕉苗培養(yǎng)方法? 為了提取H2O2處理的菌體總RNA，將Foc4野生型B2菌株及FoSKN7基因缺失突變體于PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d，然后在超凈工作臺中用6層擦鏡紙過濾培養(yǎng)物并收集濾液（即孢子液）然后按孢子與液體PDB培養(yǎng)基為1∶50的比例將孢子液接種到新的PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，然后加入H2O2至終濃度10 μmol/mL，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h收集菌體，液氮研磨，提取總RNA。將袋裝香蕉組培苗轉(zhuǎn)入透明塑料杯中，自來水室溫培養(yǎng)10 d左右直到香蕉苗長出幼嫩的白根，再將苗轉(zhuǎn)入新的塑料杯，并加入如前所述培養(yǎng)12 h的B2菌株，繼續(xù)室溫放置24 h，收集菌體及香蕉苗根的混合物，液氮研磨，提取總RNA，檢測目的基因在病原菌入侵香蕉苗根部時的表達變化情況。為了檢測目的基因在FoSKN7基因缺失突變體菌株中的表達差異，突變體和B2菌株分別用H2O2（5和10 μmol/mL）處理5 h后再提取總RNA。

1.2.2? FoSTIP1基因組編碼區(qū)、啟動子和cDNA序列的克隆及生物信息學分析方法? 利用Foc4的FoSKN7基因缺失突變體菌株轉(zhuǎn)錄組信息獲得了1個表達下調(diào)明顯的熱休克蛋白基因的cDNA信息。利用該cDNA信息在NCBI網(wǎng)站查找同源序列的方法，獲得了一段與Foc4有較高同源性的水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi IMI 58289 ）的基因組序列（GenBank登錄號： HF679023.1），以此序列為模板設計了2對引物（表1），分別用于PCR擴增目的基因的基因組序列及其上游啟動子區(qū)的序列。利用其cDNA序列信息在其起始密碼子和終止密碼子附近設計2對引物（表1），并以10 μmol/mL H2O2誘導5 h的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用鑲嵌PCR方法擴增、克隆并測序Foc4的STIP1基因的cDNA序列。利用目的基因的cDNA序列預測的蛋白質(zhì)序列在NCBI中進行結(jié)構域分析并查找了其他物種中與該蛋白質(zhì)序列類似的蛋白。參考相關文獻[8-9]分析了啟動子序列中FoSkn7轉(zhuǎn)錄因子可能的結(jié)合位點。

所應用的生物信息學分析軟件包括：NCBI blast在線軟件http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. Cgi;NCBI結(jié)構域預測在線軟件CDD http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?；蚪Y(jié)構在線預測軟件softberry：http：//linux1.softberry. com/。Clustal X軟件對Foc4的STIP1蛋白序列及所獲得的同源蛋白序列進行多重序列比對，以鑒定它們之間的同源性;MEGA 10軟件對所獲得的序列構建了鄰位相接的系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap方法（Bootstrap method; model： P-distance; 1000 replicates; seed=64238）對該樹進行分析。

1.2.3? 實時熒光定量PCR分析基因表達? 按植物總RNA提取試劑盒說明書提取處理后菌株的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，利用熒光定量PCR試劑盒[Talent qPCR PreMix （SYBR Green）]進行相對熒光定量PCR分析，所用引物為：5-STyg、3'-STyg，5-Actin、3-Actin（表1）。PCR反應體系按照熒光定量PCR試劑盒說明書配制。PCR反應在BIO-RAD公司的Mini OpticonTM Rreal-Time PCR System上進行。PCR熱循環(huán)條件如下：94 ℃變性30 s;退火溫度設梯度溫度48～50 ℃，并退火15 s;72 ℃延伸15 s;然后讀取熒光值，重復40個循環(huán);最后從45～90 ℃，每隔0.2 ℃讀取溶解曲線熒光值，每讀數(shù)一次，停留2 s。運行完畢后，從Opticon Monitor 3.1軟件讀取C（t）值，以β-actin基因作為內(nèi)參對照，檢測目的基因在野生型菌株入侵香蕉苗以及H2O2處理時的表達水平時，采用2ΔC（t）法計算，檢測目的基因在FoSKN7基因缺失突變體菌株中的表達水平時，采用2ΔΔC（t）法計算目的基因的相對表達水平。

2? 結(jié)果與分析

2.1? FoSTIP1基因的克隆、序列分析及蛋白質(zhì)產(chǎn)物結(jié)構分析

在篩選Foc4抗外源氧化脅迫的功能基因的過程中獲得了一個候選基因（命名為FoSTIP1）的cDNA片段，通過輸入Genbank進行blast比對，發(fā)現(xiàn)與水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi IMI 58289，基因組登錄序列號：HF679023.1）高度同源。因此，以該水稻惡苗病菌同源序列為模板，設計引物擴增成功獲得了FoSTIP1的基因組編碼區(qū)序列及上游啟動子序列，其中，基因組編碼區(qū)序列的PCR擴增產(chǎn)物長2113 nt，上游啟動子序列PCR擴增產(chǎn)物長2221 nt，2個DNA片段部分重疊，測序后經(jīng)序列比對分析，最終鑒定該基因組編碼區(qū)序列1902 nt， 上游啟動子序列1501 nt。經(jīng)與水稻惡苗病菌基因組相應序列比對，同源性達90%，將該序列遞交到GenBank，獲得登錄序列號：MG742355。

將上述克隆及測序獲得的FoSTIP1基因組序列信息輸入到softberry基因結(jié)構預測網(wǎng)站，選擇了4個物種模式（Fusraium， Glarea_lozoyensis， Grosmannia_clavigera和Fusraiumgraminearum）預測轉(zhuǎn)錄序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以前3個物種模式為參照，預測的轉(zhuǎn)錄起始位點存在差異，但參照3個物種模式均預測到一個長1737 nt的ORF，編碼一個由578個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，預測該蛋白質(zhì)等電點pI=5.50，分子量為64.35127 ku，將該ORF序列與FoSTIP1（轉(zhuǎn)錄組測序編號為Gene5608）的cDNA序列進行BLAST比對，結(jié)果完全相同。利用該ORF序列，在其起始密碼子和終止密碼子附近設計引物（表1），并以10 μmol/mL H2O2誘導5 h的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴增、克隆及測序獲得了該基因ORF的cDNA序列。經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)該ORF的cDNA序列與預測的cDNA序列一致，其長度為1737 nt。將該序列遞交到GenBank，獲得登錄序列號：MG742356。將以Fusraium物種模式作參考預測的轉(zhuǎn)錄序列與前面得到的上游啟動子序列及基因組編碼區(qū)序列比對，發(fā)現(xiàn)FoSTIP1在基因組上有4個外顯子，3個內(nèi)含子（圖1）。其中，內(nèi)含子1長59 nt，內(nèi)含子2為53 nt，內(nèi)含子3長52 nt。

FoSTIP1的結(jié)構域分析表明C末端含有一個典型的脅迫誘導蛋白（stress-in-ducible protein-1，STI1）結(jié)構域，多個三角形4肽重復序列結(jié)構域（tetratricopeptide repeat，TPR）（圖2）。

筆者搜索了NCBI的基因組數(shù)據(jù)庫，獲得了其他真菌中11個磷酸化應激誘導蛋白1的蛋白序列。將所獲得的蛋白序列與我們克隆獲得的Foc4的FoSTIP1的蛋白序列一起用MEGA7.0 軟件構建了鄰位相接樹（圖3）。進化樹分析表明，該蛋白質(zhì)與尖孢鐮刀菌番茄?；偷牧姿峄瘧ふT導蛋白1（STIP1）親緣關系最近（圖3）。

2.2? FoSTIP1在外源氧化脅迫及入侵香蕉苗根部時的表達

在前期工作中，我們分別對Foc4在H2O2 （10 μmol/mL）處理5 h及入侵香蕉苗根部24 h的B2菌株進行了轉(zhuǎn)錄組測序，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)外源H2O2處理的B2菌株樣品中，檢測到FoSTIP1轉(zhuǎn)錄本為2037，而經(jīng)外源H2O2（10 μmol/mL）處理5 h的B2菌株樣品中，F(xiàn)oSTIP1轉(zhuǎn)錄本為5190，二者比較，log2（FC）=1.047286，表達上調(diào)。log2（FC）表示兩樣品間基因轉(zhuǎn)錄本差異倍數(shù)（Fold Change）的對數(shù)值，用于衡量表達量差異的大小，log2（FC）>0即為表達上調(diào)。在入侵香蕉苗根部24 h的B2菌株樣品中，檢測到FoSTIP1轉(zhuǎn)錄本為4197，與未經(jīng)處理的B2菌株樣品中FoSTIP1轉(zhuǎn)錄本數(shù)量比較，log2（FC）=1.042924，表達上調(diào)。

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性，采用半定量RT-PCR技術分析了上述2種條件下FoSTIP1的表達。分析以β-actin基因作為內(nèi)參對照，采用2ΔC（t）法計算。結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。其中，在外源H2O2（10 μmol/mL）處理5 h的B2菌株中FoSTIP1的表達量約為對照樣品中的2.201倍，入侵香蕉苗根部24 h的B2菌株中，F(xiàn)oSTIP1的表達量約為對照樣品中的1.878倍（圖4）。

2.3? FoSTIP1調(diào)控機理的初步分析

分析Foc4的FoSKN7基因缺失突變體菌株轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在FoSKN7基因缺失突變體菌株中檢測到FoSTIP1轉(zhuǎn)錄本為287，而野生型B2菌株樣品中，F(xiàn)oSTIP1轉(zhuǎn)錄本為2217，二者比較，log2（FC）= 2.97505，表達下調(diào)顯著。半定量RT-PCR分析結(jié)果如圖5所示，在用5 μmol/mL H2O2處理5 h的情況下，F(xiàn)oSKN7基因缺失突變體中FoSTIP1的相對表達量約為野生型B2菌株2/3，在用10 μmol/mL H2O2處理5 h的情況下，F(xiàn)oSKN7基因缺失突變體中FoSTIP1的相對表達量約為野生型B2菌株1/3。表明即使有外源氧化脅迫存在的情況下的情況下，F(xiàn)oSKN7基因缺失突變體中FoSTIP1的表達量相對B2菌株也大幅下調(diào)。

He等[8]報道了Skn7能結(jié)合到其靶基因（氧化脅迫應答基因）啟動子區(qū)特異結(jié)合位點（5'-GGCNNGGC-3'， 5'-GGCNGGC-3'， 5'-GGCN A A-3'， 或5'-GGCNNAGA-3'）。Morgan等[9]也報道了Skn7 能結(jié)合到其靶基因啟動子區(qū)結(jié)合位點（5'-CCG AAA-3'）。參考釀酒酵母中Skn7轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的堿基序列[10-11]，我們進一步分析了FoSTIP1基因上游的啟動子序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FoSTIP1基因上游的啟動子含有2個可能的Skn7轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶位點：5'-CCGAAA-3'（-1490），5'-GGCGAGA-3' （-770）（圖6）。

3? 討論

植物對病原菌入侵的最快防衛(wèi)反應之一就是活性氧的急促釋放，稱為氧化爆發(fā)（oxidative burst），這種現(xiàn)象在植物抵抗病原菌入侵過程中具有重要作用。前期的研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)Foc4在入侵位點會遭遇寄主細胞因活性氧迸發(fā)而產(chǎn)生的強氧化脅迫環(huán)境。因此，分別對H2O2處理過的以及香蕉苗根誘導過的Foc4野生型B2菌株，進行了轉(zhuǎn)錄組測序，以探究Foc4遭遇外源氧化脅迫時的分子應對機制。同時，還對一個Foc4的FoSKN7基因缺失突變體進行了轉(zhuǎn)錄組測序。發(fā)現(xiàn)FoSKN7PCR反應進行3次重復。

基因缺失突變體中一個熱休克蛋白基因（磷酸化應激誘導蛋白1，F(xiàn)oSTIP1）表達下調(diào)顯著。因此對該基因進行了克隆鑒定，基因結(jié)構分析，啟動子分析。并利用實時熒光定量PCR方法對其在外源氧化脅迫存在條件下及菌株入侵香蕉苗根部條件下的表達進行了分析?？紤]到熱休克蛋白作為細胞內(nèi)的保護性蛋白，是一類提高細胞應對外界環(huán)境脅迫能力的蛋白質(zhì)。熱休克蛋白能與很多蛋白質(zhì)分子結(jié)合，發(fā)揮多種生理功能：幫助氨基酸鏈折疊成正確的三維結(jié)構，清除受損而無法正確折疊的氨基酸鏈，護送蛋白分子尋找目標分子以免受到其他分子的干擾等，從而減輕各種極端環(huán)_? 標記為Skn7的可能結(jié)合靶位點，其中“ATG ”為FoSTIP1開放閱讀框的起始密碼子。

境條件如高溫、干旱、強氧化脅迫、UV線照射等對細胞的損害。所以，當細胞面臨各類環(huán)境脅迫時，第一反應就是引起多種熱休克蛋白表達上調(diào)[11]。與此相一致，本研究中FoSTIP1在外源氧化脅迫及香蕉苗根部誘導條件下的表達均大幅上調(diào)。在高等哺乳動物體內(nèi)，STIP1也是一個重要的分子伴侶，其兩端分別與Hsp70和Hsp90相連，對于腫瘤細胞發(fā)生、脅迫反應和細胞增殖分化等均具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前，STIP1作為卵巢癌發(fā)生的一種新的標志物被廣泛研究和報道[12-14]。但是在植物和真菌中，除酵母以外未見有關于STIP1功能研究的報道。

考慮到Skn7轉(zhuǎn)錄因子是一個調(diào)控多種熱休克蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白質(zhì)包含一個N-末端的熱休克轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構域（heat-shock transcription factor-like DNA-binding domain）和一個C-末端的應答調(diào)節(jié)受體結(jié)構域（response regulator receiver domain）[15]，而FoSKN7的基因缺失突變體中FoSTIP1的表達大幅下調(diào)以及FoSTIP1啟動子區(qū)存在的可能的FoSkn7結(jié)合位點表明FoSTIP1是FoSkn7可能的靶基因。

綜上所述，本研究的結(jié)果暗示FoSTIP1可能參與了Foc4抗外源氧化脅迫，原因如下：1、熒光定量PCR表明，在有H2O2誘導的情況下FoSTIP1基因表達上調(diào)。2、由于Foc4在入侵位點會遭遇寄主細胞因活性氧迸發(fā)而產(chǎn)生的強氧化脅迫環(huán)境，香蕉苗誘導的情況下FoSTIP1基因表達上調(diào)可能與寄主細胞中活性氧（ROS）物質(zhì)的含量增加有關。3、酵母和多種絲狀真菌中的研究表明Skn7轉(zhuǎn)錄因子是參與抗外源氧化脅迫信號通路的的重要一環(huán)[10]，而轉(zhuǎn)錄組測序、熒光定量PCR及啟動子分析均證明FoSTIP1是FoSkn7的可能的靶基因。熱休克蛋白質(zhì)的主要功能即為參與生物細胞應對外界環(huán)境脅迫[16]，而作為一種熱休克蛋白質(zhì)，F(xiàn)oSTIP1也可能參與這些過程。

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