• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    芒果果實bHLH家族轉錄因子的生物信息學分析

    2019-06-11 11:14:48鄭斌文定青武紅霞鄒明宏劉恒
    熱帶作物學報 2019年2期
    關鍵詞:轉錄因子生物信息學芒果

    鄭斌 文定青 武紅霞 鄒明宏 劉恒

    摘? 要? bHLH家族作為植物中較大的轉錄因子家族之一,在真核生物生長發(fā)育調控中具有重要作用。本研究基于芒果果實轉錄組數據,利用生物信息學方法鑒定出87個bHLH家族蛋白,其中酸性蛋白所占比例較大,大部分為不穩(wěn)定蛋白,且均為不含信號肽的親水性蛋白,除CL10714.Contig1為膜結合轉錄因子外,其余均不含跨膜結構。芒果bHLH蛋白結構域有多個氨基酸位點保守性較高,87個芒果bHLH蛋白中73個(83.91%)具有E-box結合功能。GO分析發(fā)現芒果bHLH蛋白共注釋到生物學過程、細胞組分和分子功能3大類功能的17個亞類。進化樹分析發(fā)現芒果bHLH蛋白與擬南芥有較高的保守性,并基于進化樹對部分bHLH蛋白的功能進行了預測。本研究結果將為下一步芒果bHLH蛋白的功能研究奠定基礎。

    關鍵詞? 芒果;bHLH家族;轉錄因子;生物信息學

    中圖分類號? S667.7? ? ?文獻標識碼? A

    堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)轉錄因子為真核生物蛋白中的一個大家族[1],在生物的生長發(fā)育調控中起著極為重要的作用。bHLH轉錄因子于1989年首次在動物中發(fā)現,因含有bHLH結構域而得名[2]。bHLH結構域由大約60個氨基酸組成,分為堿性氨基酸區(qū)域(basic)和α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)(HLH),堿性氨基酸區(qū)位于bHLH結構域的N端,長度約為15個氨基酸,主要負責與DNA順式元件結合,HLH區(qū)位于該結構域的C-端,由大約40個氨基酸組成,具有形成二聚體的特性[2-4]。

    植物中bHLH轉錄因子是僅次于MYB的第二大轉錄因子家族[5],其參與調控抗逆、器官發(fā)育、激素響應及代謝物合成等多個生物學進程[6]。與對照相比,擬南芥中過表達bHLH122基因的株系對干旱、NaCl和滲透脅迫的抗性增強[7];Jiang等[8]發(fā)現bHLH轉錄因子參與了黃瓜果實長度的調控;在擬南芥中,bHLH基因BEE1、BEE2和BEE3參與對油菜素內酯的響應,且這3個基因在油菜素內酯的信號傳導中功能冗余[9];MdbHLH33參與調控蘋果花色素苷的生物合成[10]。

    基于高通量測序及生物信息學分析技術,人們已對一些植物的bHLH基因家族進行了挖掘、比較分析和功能預測,并對部分bHLH基因進行了功能分析?;诨蚪M信息,Geng等[11]在甜橙中發(fā)現56個bHLH轉錄因子,其中CsbHLH18通過調控抗氧化基因調節(jié)植株耐寒性及活性氧平衡。芒果素有“熱帶果王”之美譽,含有豐富的糖類、蛋白質、維生素、類胡蘿卜素和鈣質等營養(yǎng)成分,在我國主要分布在海南、廣西、云南、四川、廣東和福建等地,已成為我國熱區(qū)農業(yè)的支柱產業(yè)[12],但目前關于芒果bHLH轉錄因子的研究還鮮有報道。為此,本研究基于芒果果實轉錄組測序結果,利用生物信息學手段對bHLH家族基因進行鑒定和分析,為進一步探究芒果bHLH轉錄因子的功能奠定基礎。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料

    芒果蛋白序列來源于構建的轉錄組數據庫(GenBank accession SRP035450)。擬南芥bHLH家族氨基酸序列下載于擬南芥信息資源(TAIR)數據庫(http://www.arabidopsis.org/)。

    1.2? 方法

    1.2.1? 芒果bHLH家族蛋白的鑒定? 從Pfam 31.0[13]數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載HLH結構域種子文件PF00010和PF14215,利用HMMER 3.1b2[14]軟件分別構建Profile HMM(數值表格型隱馬可夫模型),基于Profile HMM分別檢索芒果轉錄組蛋白數據庫并對檢索結果進行整合去冗余,得到候選蛋白。將候選蛋白用SMART[15](http://smart.embl-heidelberg.de/)分析HLH結構域,同時用NCBI blast(https://blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)和植物轉錄因子數據庫[16](PlantTFDB)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)進行進一步分析鑒定,篩選出具有全長氨基酸序列的芒果bHLH轉錄因子。

    1.2.2? 芒果bHLH家族蛋白生物信息學分析? 基于篩選鑒定的芒果bHLH家族蛋白,利用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對其進行理化性質分析,并用在線軟件SOPMA[17](https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ sopma.html)分析其二級結構,信號肽的預測應用SignalP 4.1 Server[18](http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)軟件進行分析,最后采用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件完成跨膜結構分析。

    1.2.3? 芒果bHLH家族蛋白結構域分析? 使用BioEdit軟件對芒果bHLH家族蛋白結構域進行比對,將比對結果用在線軟件WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/cre ate.cgi)分析結構域序列標簽。

    1.2.4? 芒果bHLH家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構建及基序分析? 利用MEGA 6.0軟件內置的Clustal W程序對芒果bHLH家族蛋白的氨基酸序列進行比對分析,將比對結果采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,選用Poisson模型,并進行自舉評估(Bootstrap),重復次數為1000次,缺失值處理方式為配對狀態(tài)刪除(pairwise deletion),其他參數使用默認值[19]。運用MEME 4.11.02程序[20]分析芒果bHLH家族蛋白的基序,設定基序寬度為6~50,基序數量為5,其余參數為默認值。

    1.2.5? 芒果bHLH家族蛋白GO分析? 首先使用Blast2GO 4.0軟件[21]對芒果bHLH家族蛋白序列進行GO(gene ontology)注釋,然后用在線軟件WEGO[22](http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/ wego/index.pl)繪制GO功能分類圖。

    1.2.6? 芒果和擬南芥bHLH蛋白進化樹構建? 使用MEGA 6.0軟件采用最大似然法將芒果bHLH蛋白和擬南芥bHLH蛋白共同構建進化樹。

    2? 結果與分析

    2.1? 芒果bHLH家族成員的獲得

    基于從Pfam 31.0數據庫下載的種子文件PF00010和PF14215,使用HMMER 3.1b2軟件從芒果轉錄組49 117個蛋白序列中分別篩選出211個和86個候選蛋白序列,逐個進行結構域及同源比對分析,去除重復及非全長氨基酸序列,共獲得87個芒果bHLH家族蛋白序列(表1),其中最小的bHLH蛋白含89個氨基酸,最大的bHLH蛋白含944個氨基酸。

    2.2? 芒果bHLH家族蛋白特性分析

    對芒果bHLH家族蛋白進一步進行生物信息學分析(表1),理化性質分析發(fā)現:87個芒果bHLH家族蛋白的相對分子量在10.17~102.47 ku之間,其中含61個酸性蛋白(理論等電點<7)和26個堿性蛋白(理論等電點>7);不穩(wěn)定指數(Ⅱ)分析發(fā)現除Unigene21025和CL12 02.Contig3為穩(wěn)定蛋白外(Ⅱ<40),其余均為不穩(wěn)定蛋白(Ⅱ>40);平均疏水指數均小于0,為親水性蛋白。二級結構分析發(fā)現:芒果bHLH家族蛋白中無規(guī)卷曲和α-螺旋所占比例較大,其中50個為無規(guī)卷曲所占比例最大,36個為α-螺旋所占比例最大,CL5018.Contig2二級結構中α-螺旋和無規(guī)卷曲所占比例一致。87個bHLH家族蛋白均不含信號肽??缒そY構分析發(fā)現CL10714.Contig1含跨膜結構,為膜結合轉錄因子,其余bHLH蛋白均不含跨膜結構。

    2.3? 芒果bHLH蛋白結構域分析及分類

    使用BioEdit對87個芒果bHLH蛋白的結構域進行比對,并用WebLogo 3獲得芒果bHLH蛋白的結構域序列標簽(圖1)。分析發(fā)現,在芒果bHLH結構域的2個α-螺旋區(qū)內,23和54位點均為疏水性氨基酸亮氨酸(L),100%的20、44和51位點,98.85%的16位點以及97.70%的27位點為疏水性氨基酸(A、F、I、L、M、P、V、W或Y),而這些疏水性氨基酸對bHLH的蛋白二級結構的穩(wěn)定性起著關鍵作用[23]。

    在bHLH結構域的堿性區(qū)內,有多個關鍵位點用于識別并結合DNA特定堿基序列,其中9位點的谷氨酸(E)用于與DNA雙螺旋結構的大溝結合[23],分析發(fā)現,73個(83.91%)芒果bHLH結構域的9位點為谷氨酸(E),其中72個在9位點為谷氨酸(E)且12位點為精氨酸(R),而且研究發(fā)現具有9位點為E且12位點為R結構的bHLH蛋白具有識別并結合E-box序列(CANNTG)的功能[24],57個(65.52%)bHLH蛋白結構域在5位點為組氨酸(H)或賴氨酸(K)、9位點為谷氨酸(E)且13位點為精氨酸(R),而在植物中該結構被證實用于識別并結合G-box[25]。在14個9位點不是谷氨酸(E)的bHLH結構域中,有3個bHLH結構域的堿性區(qū)內含5個及以上堿性氨基酸(R、K或H),這3個bHLH蛋白可能在非E-box序列處與DNA結合[4]。11個bHLH結構域9位點不是谷氨酸(E)且堿性區(qū)內含5個以下堿性氨基酸(R、K或H),該類bHLH蛋白不具有結合DNA功能[26]。

    2.4? 芒果bHLH家族蛋白進化樹及基序分析

    通過MEGA 6.0軟件構建芒果bHLH家族蛋白的系統(tǒng)進化樹。由圖2可知,在進化樹中,相同類型的bHLH蛋白聚在一起,且相近分支的bHLH序列長度及結構域位置相近。

    3? 討論

    植物bHLH蛋白參與抗逆、生長發(fā)育、生物合成及信號傳導等生理生化過程[35]?;谏镄畔W分析技術,目前已從一些植物如擬南芥[36]、水稻[37]、人參[38]、西瓜[39]、茶樹[40]、葡萄[41]、蘋果[42]等分別鑒定出162、167、169、96、120、110、175個bHLH蛋白。

    本研究基于芒果果實轉錄組數據,鑒定出87個bHLH家族蛋白,其中酸性蛋白所占比例較大,大部分為不穩(wěn)定蛋白,且均為不含信號肽的親水性蛋白,此現象與‘短柄櫻桃[43]等多種植物的bHLH家族蛋白相似。除CL10714.Contig1為膜結合轉錄因子外,其余bHLH蛋白均不含跨膜結構,推測CL10714.Contig1與芒果對環(huán)境的脅迫響應有關[44]。大部分芒果bHLH家族蛋白二級結構中無規(guī)卷曲所占比例最大,該結果與云南紅皮梨bHLH轉錄因子一致[45]。

    芒果bHLH蛋白結構域有多個氨基酸位點保守性較高,且保守位點與西瓜[39]和蓮[46]bHLH蛋白的分析結果相似。87個芒果bHLH蛋白中的73個(83.91%)具有E-box結合功能,57個(65.52%)具有G-box結合功能,該結果與擬南芥(60.54%)和水稻(56.89%)[37]的分析結果相似。

    進化樹上相近分枝的芒果bHLH的基序組成相同,序列長度及結構域位置相近,與擬南芥bHLH的分析結果相似[27]。

    芒果bHLH蛋白共注釋到GO分類中生物學過程、細胞組分和分子功能3大類功能的17個亞類,其中56.32% bHLH蛋白注釋到結合功能。

    對芒果和擬南芥bHLH蛋白共同構建的進化樹分析發(fā)現,芒果bHLH蛋白與擬南芥有較高的保守性,大部分芒果bHLH蛋白與擬南芥不同亞組的bHLH蛋白聚在一起,推測芒果bHLH蛋白與相近的擬南芥bHLH蛋白具有相似的功能,該分析將為下一步芒果bHLH蛋白的功能分析提供參考?;诖朔椒ǎ珻hen等[47]發(fā)現與擬南芥AtbHLH112同源的水稻OsbHLH068在參與鹽脅迫響應時與AtbHLH112功能一致,參與花期調控時與AtbHLH112功能相反。

    bHLH蛋白參與植物的多種生命活動,本研究從芒果轉錄組數據中鑒定87個bHLH家族蛋白,為今后芒果bHLH家族蛋白的研究提供了基礎。由于轉錄組數據的局限性,所鑒定的僅為芒果bHLH家族的部分蛋白序列,因此,芒果bHLH家族蛋白還有待進一步挖掘和研究。本研究僅對部分芒果bHLH蛋白進行了功能預測,其具體功能有待進一步驗證。

    參考文獻

    Ledent V, Vervoort M. The basic helix-loop-helix protein family: comparative genomics and phylogenetic analysis[J]. Genome Research, 2001, 11(5): 754-770.

    Murre C, Mccaw P S, Baltimore D. A new DNA binding and dimerization motif in immunoglobulin enhancer binding, daughterless, MyoD, and myc, proteins[J]. Cell, 1989, 56(5): 777-783.

    FerrédAmaré A R, Pognonec P, Roeder R G, et al. Structure and function of the b/HLH/Z domain of USF[J]. The EMBO Journal, 1994, 13(1): 180-189.

    Toledoortiz G, Huq E, Quail P H. The Arabidopsis basic/helix-loop-helix transcription factor family[J]. Plant Cell, 2003, 15(8): 1749-1770.

    楊鵬程, 周? 波, 李玉花. 植物花青素合成相關的bHLH轉錄因子[J]. 植物生理學報, 2012, 48(8): 747-758.

    Kazan K, Manners J M. MYC2: The master in action[J]. Molecular Plant, 2013, 6(3): 686-703.

    Liu W, Tai H, Li S, et al. bHLH122 is important for drought and osmotic stress resistance in Arabidopsis, and in the repression of ABA catabolism[J]. New Phytologist, 2014, 201(4): 1192-1204.

    Jiang L, Yan S, Yang W, et al. Transcriptomic analysis reveals the roles of microtubule-related genes and transcription factors in fruit length regulation in cucumber (Cucumis sativus L.)[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 8031.

    Friedrichsen D M, Nemhauser J, Muramitsu T, et al. Three redundant brassinosteroid early response genes encode putative bHLH transcription factors required for normal growth[J]. Genetics, 2002, 162(3): 1445-1456.

    Xu H, Wang N, Liu J, et al. The molecular mechanism underlying anthocyanin metabolism in apple using the MdMYB16 and MdbHLH33 genes[J]. Plant Molecular Biology, 2017, 94(1-2): 149-165.

    Geng J, Liu J. The transcription factor CsbHLH18 of sweet orange (Citrus sinensis) functions in modulation of cold tolerance and reactive oxygen species homeostasis by regulating the antioxidant gene[J]. Journal of Experimental Botany, 2018, 69(10): 2677-2692.

    武紅霞, 許文天, 羅? 純, 等. 芒果果實轉錄組數據組裝及基因功能注釋[J]. 熱帶作物學報, 2016, 37(11): 2191-2198.

    Finn R D, Coggill P, Eberhardt R Y, et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 44(Database issue): D279-D285.

    Finn R D, Clements J, Eddy S R. HMMER web server: interactive sequence similarity searching[J]. Nucleic Acids Research, 2011, 39(Web Server issue): D29-D37.

    Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART 7: recent updates to the protein domain annotation resource[J]. Nucleic Acids Research, 2012, 40(Database issue): D302-D305.

    Jin J, Tian F, Yang D, et al. PlantTFDB 4.0: toward a central hub for transcription factors and regulatory interactions in plants[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45(Database issue): D1040-D1045.

    Geourjon C, Deléage G. SOPMA: significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments[J]. Computer Applic ations in the Biosciences Cabios, 1995, 11(6): 681- 684.

    Petersen T N, Brunak S, Von H G, et al. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods, 2010, 8(10): 785-786.

    Hall B G. Building phylogenetic trees from molecular data with MEGA[J]. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30(5): 1229-1235.

    Bailey T L, Elkan C. Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers[C]// International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, 1994: 28-36.

    Conesa A, G?tz S, Garcíagómez J M, et al. Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research[J]. Bioinformatics, 2005, 21(18): 3674-3676.

    Ye J, Fang L, Zheng H, et al. WEGO: a web tool for plotting GO annotations[J]. Nucleic Acids Research, 2006, 34(Web Server issue): W293-W297.

    Atchley W R, Zhao J. Molecular architecture of the DNA-binding region and its relationship to classification of basic Helix–Loop–Helix proteins[J]. Molecular Biology & Evolution, 2007, 24(1): 192-202.

    Ellenberger T, Fass D, Arnaud M, et al. Crystal structure of transcription factor E47: E-box recognition by a basic region helix-loop-helix dimer[J]. Genes & Development, 1994, 8(8): 970-980.

    Hudson K A, Hudson M E. A classification of basic Helix-Loop-Helix transcription factors of Soybean[J]. International Journal of Genomics, 2015, 2015(3): 603182.

    Atchley W R, Fitch W M. A natural classification of the basic helix-loop-helix class of transcription factors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997, 94(10): 5172-5176.

    Heim M A, Jakoby M, Werber M, et al. The basic helix-loop-helix transcription factor family in plants: a genome-wide study of protein structure and functional diversity[J]. Molecular Biology & Evolution, 2003, 20(5): 735-747.

    Wang H, Yang L, Pan J, et al. The bHLH transcription factors MYC2, MYC3, and MYC4 are required for jasmonate-mediated inhibition of flowering in Arabidopsis[J]. Molecular Plant, 2017, 10(11): 1461-1464.

    Selote D, Samira R, Matthiadis A, et al. Iron-binding E3 ligase mediates iron response in plants by targeting basic helix-loop-helix transcription factors[J]. Plant Physiology, 2015, 167(1): 273-286.

    Li X, Zhang H, Ai Q, et al. Two bHLH transcription factors, bHLH34 and bHLH104, regulate iron homeostasis in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Physiology, 2016, 170(4): 2478-2493.

    Heisler M G, Atkinson A, Bylstra Y H, et al. SPATULA, a gene that controls development of carpel margin tissues in Arabidopsis, encodes a bHLH protein[J]. Development, 2001, 128(7): 1089-1098.

    Rajani S, Sundaresan V. The Arabidopsis myc/bHLH gene ALCATRAZ enables cell separation in fruit dehiscence[J]. Current Biology, 2001, 11(24): 1914-1922.

    Liu Y, Ji X, Nie X, et al. Arabidopsis AtbHLH112 regulates the expression of genes involved in abiotic stress tolerance by binding to their E-box and GCG-box motifs[J]. New Phytologist, 2015, 207(3): 692-709.

    Li Y, Wang H, Li X, et al. Two DELLA-interacting proteins bHLH48 and bHLH60 regulate flowering under long-day conditions in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimen tal Botany, 2017, 68(11): 2757-2767.

    劉曉月, 王文生, 傅彬英. 植物bHLH轉錄因子家族的功能研究進展[J]. 生物技術進展, 2011, 1(6): 391-397.

    Bailey P C, Weisshaar B. Update on the basic helix- loop-helix transcription factor gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell, 2003, 15(11): 2497-2502.

    Li X, Duan X, Jiang H, et al. Genome-Wide analysis of Basic/Helix-Loop-Helix transcription factor family in Rice and Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2006, 141(4): 1167-1184.

    Chu Y, Xiao S, Su H, et al. Genome-wide characterization and analysis of bHLH transcription factors in Panax ginse ng[J]. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2018, 8(4): 666-677.

    何? 潔, 顧秀容, 魏春華, 等. 西瓜bHLH轉錄因子家族基因的鑒定及其在非生物脅迫下的表達分析[J]. 園藝學報, 2016, 43(2): 281-294.

    Cui X, Wang Y, Liu Z, et al. Transcriptome-wide identifica tion and expression profile analysis of the bHLH family genes in Camellia sinensis[J]. Functional & Integrative Ge nomics, 2018, 18(15): 489-503.

    尹? 歡, 蔡? 斌, 李成慧, 等. 葡萄bHLH轉錄因子家族全基因組分析[J]. 江西農業(yè)學報, 2013, 25(9): 1-6.

    Yang J, Min G, Li H, et al. Identification and expression analy sis of the apple (Malus×domestica) basic helix-loop- helix transcription factor family[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 28.

    應炎標, 朱友銀, 郭衛(wèi)東, 等. 櫻桃bHLH轉錄因子家族基因鑒定及表達分析[J]. 分子植物育種, 2018, 16(14): 4559-4568.

    王? 楠, 向鳳寧, 李? 朔. 植物膜結合轉錄因子與脅迫響應[J]. 生命科學, 2016(7): 799-806.

    孟富宣, 周? 軍, 辛培堯, 等. 云南紅皮梨bHLH轉錄因子的生物信息學分析[J]. 基因組學與應用生物學, 2013(5): 652-659.

    Hudson K A, Hudson M E. The basic helix-loop-helix tran scription factor family in the sacred lotus, Nelumbo Nucifera[J]. Tropical Plant Biology, 2014, 7(2): 65-70.

    Chen H, Hsieh-Feng V, Liao P, et al. The function of OsbHLH068, is partially redundant with its homolog, AtbHLH112, in the regulation of the salt stress response but has opposite functions to control flowering in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology, 2017, 94(4-5): 531-548.

    猜你喜歡
    轉錄因子生物信息學芒果
    我才不要穿
    小洞會“咬”人
    小洞會“咬”人
    “PBL+E—learning”教學模式探索
    移動教學在生物信息學課程改革中的應用
    今傳媒(2016年11期)2016-12-19 11:35:50
    中醫(yī)大數據下生物信息學的發(fā)展及教育模式淺析
    NF—κB信號通路抗肝纖維化的研究進展
    數據挖掘技術在生物信息學中的應用
    植物Trihelix轉錄因子家族的分類、結構和功能研究進展
    轉錄因子Foxd3、Sox2在宮頸上皮內瘤樣病變中的表達臨床意義
    国产成人精品在线电影| 51午夜福利影视在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美国产精品va在线观看不卡| 日本爱情动作片www.在线观看| av天堂久久9| 少妇的丰满在线观看| 成人黄色视频免费在线看| av网站免费在线观看视频| 在线看a的网站| av.在线天堂| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲人成网站在线观看播放| 少妇精品久久久久久久| 妹子高潮喷水视频| 曰老女人黄片| 日韩免费高清中文字幕av| av天堂久久9| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲 欧美一区二区三区| 人人澡人人妻人| 青春草亚洲视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 99精品久久久久人妻精品| 1024视频免费在线观看| 成人国语在线视频| 欧美日韩视频精品一区| 赤兔流量卡办理| 蜜桃在线观看..| 赤兔流量卡办理| 免费少妇av软件| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产av一区二区精品久久| 精品视频人人做人人爽| av线在线观看网站| 美女视频免费永久观看网站| a 毛片基地| 色播在线永久视频| av网站在线播放免费| 亚洲精品乱久久久久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久99精品国语久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| a级毛片在线看网站| 日韩人妻精品一区2区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日韩一本色道免费dvd| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产伦人伦偷精品视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 国产97色在线日韩免费| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 欧美久久黑人一区二区| 少妇人妻久久综合中文| 精品国产乱码久久久久久小说| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 人成视频在线观看免费观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久97久久精品| av卡一久久| av国产久精品久网站免费入址| 在线观看免费高清a一片| 毛片一级片免费看久久久久| 丁香六月欧美| 亚洲 欧美一区二区三区| 热re99久久国产66热| 久久韩国三级中文字幕| 高清欧美精品videossex| 丝袜脚勾引网站| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲专区中文字幕在线 | 日本午夜av视频| 成人国产av品久久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产精品成人在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲欧洲国产日韩| 精品久久久久久电影网| 日本午夜av视频| 日日撸夜夜添| 少妇的丰满在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产在视频线精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品国产区一区二| 国产精品久久久久久精品古装| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 午夜福利视频在线观看免费| av在线老鸭窝| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 日本wwww免费看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产片内射在线| 高清不卡的av网站| 国产精品女同一区二区软件| 国产av国产精品国产| 丰满少妇做爰视频| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品亚洲成a人片在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美精品高潮呻吟av久久| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲中文av在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 90打野战视频偷拍视频| 国产成人精品久久二区二区91 | √禁漫天堂资源中文www| 两个人看的免费小视频| 青青草视频在线视频观看| 青青草视频在线视频观看| 9191精品国产免费久久| 亚洲综合精品二区| 国产 精品1| 国产成人欧美| 高清在线视频一区二区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 午夜福利,免费看| 成年人免费黄色播放视频| 国产av精品麻豆| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人欧美在线观看 | 国产成人欧美| 韩国精品一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲久久久国产精品| 美女高潮到喷水免费观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 91国产中文字幕| 免费观看人在逋| 午夜免费鲁丝| 一本大道久久a久久精品| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产av码专区亚洲av| 国产欧美亚洲国产| av.在线天堂| 日韩人妻精品一区2区三区| 日本av免费视频播放| 男人操女人黄网站| 十分钟在线观看高清视频www| 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 老司机靠b影院| 老熟女久久久| 在线观看免费视频网站a站| 久久久国产精品麻豆| 免费观看av网站的网址| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产探花极品一区二区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 18在线观看网站| 成人国语在线视频| 久久韩国三级中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品国产三级国产专区5o| 91成人精品电影| 亚洲精品一二三| 精品酒店卫生间| 在线看a的网站| 少妇人妻 视频| 搡老乐熟女国产| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 尾随美女入室| 老司机影院毛片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产成人系列免费观看| 亚洲,欧美精品.| 99国产综合亚洲精品| 91国产中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 看免费av毛片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产免费又黄又爽又色| 在线精品无人区一区二区三| 欧美日韩综合久久久久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品一区二区精品视频观看| 18禁观看日本| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 色网站视频免费| av片东京热男人的天堂| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲国产成人一精品久久久| kizo精华| 欧美xxⅹ黑人| 精品国产乱码久久久久久小说| 中国国产av一级| 久久久久国产精品人妻一区二区| 少妇精品久久久久久久| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成人精品无人区| 成人国产麻豆网| 青青草视频在线视频观看| 老司机在亚洲福利影院| 丁香六月天网| 国产在线视频一区二区| 十八禁人妻一区二区| 午夜久久久在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 九九爱精品视频在线观看| 日本欧美视频一区| 女性生殖器流出的白浆| 超色免费av| 大片电影免费在线观看免费| 一本久久精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 捣出白浆h1v1| 超色免费av| 黑人猛操日本美女一级片| 一本大道久久a久久精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费观看人在逋| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费日韩欧美在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 午夜免费男女啪啪视频观看| 免费高清在线观看日韩| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产99久久九九免费精品| 久热爱精品视频在线9| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲国产日韩一区二区| 精品福利永久在线观看| 极品人妻少妇av视频| 天美传媒精品一区二区| 免费日韩欧美在线观看| 国产乱人偷精品视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品三级大全| 一级黄片播放器| 日本欧美视频一区| 男女床上黄色一级片免费看| 成人免费观看视频高清| 18在线观看网站| 国产精品免费大片| 人妻人人澡人人爽人人| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲国产精品国产精品| 大香蕉久久网| 91国产中文字幕| 一边亲一边摸免费视频| 又黄又粗又硬又大视频| 日日啪夜夜爽| av视频免费观看在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久久欧美国产精品| 亚洲七黄色美女视频| 桃花免费在线播放| 一区二区三区四区激情视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 青春草视频在线免费观看| 日韩av不卡免费在线播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 99久久综合免费| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品二区激情视频| 麻豆av在线久日| 久久ye,这里只有精品| 97精品久久久久久久久久精品| 成年动漫av网址| 制服丝袜香蕉在线| 国产男人的电影天堂91| 亚洲综合精品二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 夫妻性生交免费视频一级片| 一区二区av电影网| 精品卡一卡二卡四卡免费| 熟妇人妻不卡中文字幕| 波野结衣二区三区在线| 国产一区二区在线观看av| 我要看黄色一级片免费的| 一个人免费看片子| 黄频高清免费视频| 一级毛片 在线播放| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美激情高清一区二区三区 | 一级a爱视频在线免费观看| 精品一区二区三卡| 永久免费av网站大全| 久久久久精品国产欧美久久久 | av卡一久久| 韩国精品一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 国产一区二区在线观看av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产在线一区二区三区精| 五月开心婷婷网| 一区在线观看完整版| 色视频在线一区二区三区| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲,欧美精品.| 最黄视频免费看| 男男h啪啪无遮挡| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 性高湖久久久久久久久免费观看| bbb黄色大片| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲国产成人一精品久久久| 九草在线视频观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产免费视频播放在线视频| 999久久久国产精品视频| 国产精品一区二区在线观看99| 性少妇av在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品亚洲成国产av| 国产精品av久久久久免费| 亚洲综合色网址| 下体分泌物呈黄色| 精品视频人人做人人爽| 十八禁人妻一区二区| 色视频在线一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 黄色毛片三级朝国网站| 男女午夜视频在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| svipshipincom国产片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人精品福利久久| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久性视频一级片| 观看美女的网站| 国产一级毛片在线| 五月开心婷婷网| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 亚洲四区av| 精品人妻在线不人妻| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品三级大全| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲国产看品久久| 国产极品天堂在线| 美女福利国产在线| 搡老岳熟女国产| 亚洲美女黄色视频免费看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 无遮挡黄片免费观看| 欧美日韩综合久久久久久| 在线观看三级黄色| 亚洲三区欧美一区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 午夜日韩欧美国产| 亚洲第一av免费看| 成人毛片60女人毛片免费| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产成人欧美| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品人妻久久久影院| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 黄色视频不卡| 一区二区av电影网| 人妻人人澡人人爽人人| 精品一品国产午夜福利视频| 超色免费av| 精品少妇内射三级| 日韩视频在线欧美| 国产精品国产三级专区第一集| 久久97久久精品| 精品亚洲成国产av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 天堂8中文在线网| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久人妻熟女aⅴ| 大码成人一级视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 美女高潮到喷水免费观看| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 秋霞在线观看毛片| videosex国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 在现免费观看毛片| 在线天堂中文资源库| 99精品久久久久人妻精品| av不卡在线播放| 国产精品国产av在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产乱人偷精品视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 日韩av免费高清视频| 蜜桃国产av成人99| av.在线天堂| 国产免费视频播放在线视频| 国产av一区二区精品久久| 又大又黄又爽视频免费| 下体分泌物呈黄色| 看十八女毛片水多多多| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美 日韩 精品 国产| 国产欧美亚洲国产| 欧美最新免费一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久人人爽人人片av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 97在线人人人人妻| 国产福利在线免费观看视频| 国产亚洲最大av| 亚洲伊人色综图| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 两个人免费观看高清视频| 人人妻人人澡人人看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 欧美人与善性xxx| 中文字幕色久视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 国产av一区二区精品久久| 国产国语露脸激情在线看| 老司机在亚洲福利影院| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久久精品94久久精品| 久久久久久人人人人人| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜免费鲁丝| 丝袜喷水一区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产精品久久久人人做人人爽| av免费观看日本| 亚洲欧美一区二区三区国产| 色94色欧美一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩视频在线欧美| 看非洲黑人一级黄片| 下体分泌物呈黄色| 午夜福利免费观看在线| 久久久久人妻精品一区果冻| 天天影视国产精品| 一区二区三区精品91| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 黄色视频不卡| 十分钟在线观看高清视频www| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品.久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 男人添女人高潮全过程视频| 国产一区二区在线观看av| 国产精品一二三区在线看| 亚洲av日韩在线播放| 久久 成人 亚洲| 18禁国产床啪视频网站| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲少妇的诱惑av| 日本色播在线视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 高清不卡的av网站| 黄片小视频在线播放| 国产男女内射视频| 丝袜在线中文字幕| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 满18在线观看网站| 一二三四中文在线观看免费高清| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 黄色 视频免费看| 18在线观看网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产 精品1| 老汉色av国产亚洲站长工具| av一本久久久久| 久久久国产欧美日韩av| av免费观看日本| 亚洲精品日本国产第一区| 大陆偷拍与自拍| 久久青草综合色| 午夜福利,免费看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产深夜福利视频在线观看| 中文欧美无线码| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 在线天堂最新版资源| av国产精品久久久久影院| 午夜福利,免费看| www.熟女人妻精品国产| 日本欧美视频一区| 操美女的视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 男人操女人黄网站| 韩国高清视频一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 久久久久精品性色| 最近最新中文字幕大全免费视频 | av在线播放精品| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久影院123| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 丁香六月天网| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品久久久久久久久免| 欧美xxⅹ黑人| 国产一区二区 视频在线| av视频免费观看在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美在线一区亚洲| 无限看片的www在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 中文字幕av电影在线播放| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 高清在线视频一区二区三区| 一区二区三区精品91| 在线观看www视频免费| 18在线观看网站| 老司机在亚洲福利影院| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产在线视频一区二区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 又黄又粗又硬又大视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| svipshipincom国产片| 国产亚洲一区二区精品| 日韩一区二区视频免费看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜影院在线不卡| 日韩大片免费观看网站| 国产野战对白在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 免费看不卡的av| av一本久久久久| 午夜福利一区二区在线看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线观看一区二区三区激情| 各种免费的搞黄视频| 国产xxxxx性猛交| 亚洲综合色网址| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 女人精品久久久久毛片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 免费观看a级毛片全部| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产国语露脸激情在线看| 国产深夜福利视频在线观看| 女人精品久久久久毛片| 无遮挡黄片免费观看| av网站在线播放免费| 人妻 亚洲 视频| 久久ye,这里只有精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黑人欧美特级aaaaaa片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一区二区三区四区激情视频| 国产在线免费精品| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产成人精品在线电影| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产有黄有色有爽视频| 成年人午夜在线观看视频| 一级片免费观看大全| 麻豆乱淫一区二区| 中文欧美无线码| 如何舔出高潮| 精品国产乱码久久久久久小说| 自线自在国产av| 精品国产一区二区久久| 国产深夜福利视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲国产看品久久| 久久久久精品国产欧美久久久 |