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    芒果果實bHLH家族轉錄因子的生物信息學分析

    2019-06-11 11:14:48鄭斌文定青武紅霞鄒明宏劉恒
    熱帶作物學報 2019年2期
    關鍵詞:轉錄因子生物信息學芒果

    鄭斌 文定青 武紅霞 鄒明宏 劉恒

    摘? 要? bHLH家族作為植物中較大的轉錄因子家族之一,在真核生物生長發(fā)育調控中具有重要作用。本研究基于芒果果實轉錄組數據,利用生物信息學方法鑒定出87個bHLH家族蛋白,其中酸性蛋白所占比例較大,大部分為不穩(wěn)定蛋白,且均為不含信號肽的親水性蛋白,除CL10714.Contig1為膜結合轉錄因子外,其余均不含跨膜結構。芒果bHLH蛋白結構域有多個氨基酸位點保守性較高,87個芒果bHLH蛋白中73個(83.91%)具有E-box結合功能。GO分析發(fā)現芒果bHLH蛋白共注釋到生物學過程、細胞組分和分子功能3大類功能的17個亞類。進化樹分析發(fā)現芒果bHLH蛋白與擬南芥有較高的保守性,并基于進化樹對部分bHLH蛋白的功能進行了預測。本研究結果將為下一步芒果bHLH蛋白的功能研究奠定基礎。

    關鍵詞? 芒果;bHLH家族;轉錄因子;生物信息學

    中圖分類號? S667.7? ? ?文獻標識碼? A

    堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)轉錄因子為真核生物蛋白中的一個大家族[1],在生物的生長發(fā)育調控中起著極為重要的作用。bHLH轉錄因子于1989年首次在動物中發(fā)現,因含有bHLH結構域而得名[2]。bHLH結構域由大約60個氨基酸組成,分為堿性氨基酸區(qū)域(basic)和α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)(HLH),堿性氨基酸區(qū)位于bHLH結構域的N端,長度約為15個氨基酸,主要負責與DNA順式元件結合,HLH區(qū)位于該結構域的C-端,由大約40個氨基酸組成,具有形成二聚體的特性[2-4]。

    植物中bHLH轉錄因子是僅次于MYB的第二大轉錄因子家族[5],其參與調控抗逆、器官發(fā)育、激素響應及代謝物合成等多個生物學進程[6]。與對照相比,擬南芥中過表達bHLH122基因的株系對干旱、NaCl和滲透脅迫的抗性增強[7];Jiang等[8]發(fā)現bHLH轉錄因子參與了黃瓜果實長度的調控;在擬南芥中,bHLH基因BEE1、BEE2和BEE3參與對油菜素內酯的響應,且這3個基因在油菜素內酯的信號傳導中功能冗余[9];MdbHLH33參與調控蘋果花色素苷的生物合成[10]。

    基于高通量測序及生物信息學分析技術,人們已對一些植物的bHLH基因家族進行了挖掘、比較分析和功能預測,并對部分bHLH基因進行了功能分析?;诨蚪M信息,Geng等[11]在甜橙中發(fā)現56個bHLH轉錄因子,其中CsbHLH18通過調控抗氧化基因調節(jié)植株耐寒性及活性氧平衡。芒果素有“熱帶果王”之美譽,含有豐富的糖類、蛋白質、維生素、類胡蘿卜素和鈣質等營養(yǎng)成分,在我國主要分布在海南、廣西、云南、四川、廣東和福建等地,已成為我國熱區(qū)農業(yè)的支柱產業(yè)[12],但目前關于芒果bHLH轉錄因子的研究還鮮有報道。為此,本研究基于芒果果實轉錄組測序結果,利用生物信息學手段對bHLH家族基因進行鑒定和分析,為進一步探究芒果bHLH轉錄因子的功能奠定基礎。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料

    芒果蛋白序列來源于構建的轉錄組數據庫(GenBank accession SRP035450)。擬南芥bHLH家族氨基酸序列下載于擬南芥信息資源(TAIR)數據庫(http://www.arabidopsis.org/)。

    1.2? 方法

    1.2.1? 芒果bHLH家族蛋白的鑒定? 從Pfam 31.0[13]數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載HLH結構域種子文件PF00010和PF14215,利用HMMER 3.1b2[14]軟件分別構建Profile HMM(數值表格型隱馬可夫模型),基于Profile HMM分別檢索芒果轉錄組蛋白數據庫并對檢索結果進行整合去冗余,得到候選蛋白。將候選蛋白用SMART[15](http://smart.embl-heidelberg.de/)分析HLH結構域,同時用NCBI blast(https://blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)和植物轉錄因子數據庫[16](PlantTFDB)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)進行進一步分析鑒定,篩選出具有全長氨基酸序列的芒果bHLH轉錄因子。

    1.2.2? 芒果bHLH家族蛋白生物信息學分析? 基于篩選鑒定的芒果bHLH家族蛋白,利用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對其進行理化性質分析,并用在線軟件SOPMA[17](https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ sopma.html)分析其二級結構,信號肽的預測應用SignalP 4.1 Server[18](http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)軟件進行分析,最后采用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件完成跨膜結構分析。

    1.2.3? 芒果bHLH家族蛋白結構域分析? 使用BioEdit軟件對芒果bHLH家族蛋白結構域進行比對,將比對結果用在線軟件WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/cre ate.cgi)分析結構域序列標簽。

    1.2.4? 芒果bHLH家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構建及基序分析? 利用MEGA 6.0軟件內置的Clustal W程序對芒果bHLH家族蛋白的氨基酸序列進行比對分析,將比對結果采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,選用Poisson模型,并進行自舉評估(Bootstrap),重復次數為1000次,缺失值處理方式為配對狀態(tài)刪除(pairwise deletion),其他參數使用默認值[19]。運用MEME 4.11.02程序[20]分析芒果bHLH家族蛋白的基序,設定基序寬度為6~50,基序數量為5,其余參數為默認值。

    1.2.5? 芒果bHLH家族蛋白GO分析? 首先使用Blast2GO 4.0軟件[21]對芒果bHLH家族蛋白序列進行GO(gene ontology)注釋,然后用在線軟件WEGO[22](http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/ wego/index.pl)繪制GO功能分類圖。

    1.2.6? 芒果和擬南芥bHLH蛋白進化樹構建? 使用MEGA 6.0軟件采用最大似然法將芒果bHLH蛋白和擬南芥bHLH蛋白共同構建進化樹。

    2? 結果與分析

    2.1? 芒果bHLH家族成員的獲得

    基于從Pfam 31.0數據庫下載的種子文件PF00010和PF14215,使用HMMER 3.1b2軟件從芒果轉錄組49 117個蛋白序列中分別篩選出211個和86個候選蛋白序列,逐個進行結構域及同源比對分析,去除重復及非全長氨基酸序列,共獲得87個芒果bHLH家族蛋白序列(表1),其中最小的bHLH蛋白含89個氨基酸,最大的bHLH蛋白含944個氨基酸。

    2.2? 芒果bHLH家族蛋白特性分析

    對芒果bHLH家族蛋白進一步進行生物信息學分析(表1),理化性質分析發(fā)現:87個芒果bHLH家族蛋白的相對分子量在10.17~102.47 ku之間,其中含61個酸性蛋白(理論等電點<7)和26個堿性蛋白(理論等電點>7);不穩(wěn)定指數(Ⅱ)分析發(fā)現除Unigene21025和CL12 02.Contig3為穩(wěn)定蛋白外(Ⅱ<40),其余均為不穩(wěn)定蛋白(Ⅱ>40);平均疏水指數均小于0,為親水性蛋白。二級結構分析發(fā)現:芒果bHLH家族蛋白中無規(guī)卷曲和α-螺旋所占比例較大,其中50個為無規(guī)卷曲所占比例最大,36個為α-螺旋所占比例最大,CL5018.Contig2二級結構中α-螺旋和無規(guī)卷曲所占比例一致。87個bHLH家族蛋白均不含信號肽??缒そY構分析發(fā)現CL10714.Contig1含跨膜結構,為膜結合轉錄因子,其余bHLH蛋白均不含跨膜結構。

    2.3? 芒果bHLH蛋白結構域分析及分類

    使用BioEdit對87個芒果bHLH蛋白的結構域進行比對,并用WebLogo 3獲得芒果bHLH蛋白的結構域序列標簽(圖1)。分析發(fā)現,在芒果bHLH結構域的2個α-螺旋區(qū)內,23和54位點均為疏水性氨基酸亮氨酸(L),100%的20、44和51位點,98.85%的16位點以及97.70%的27位點為疏水性氨基酸(A、F、I、L、M、P、V、W或Y),而這些疏水性氨基酸對bHLH的蛋白二級結構的穩(wěn)定性起著關鍵作用[23]。

    在bHLH結構域的堿性區(qū)內,有多個關鍵位點用于識別并結合DNA特定堿基序列,其中9位點的谷氨酸(E)用于與DNA雙螺旋結構的大溝結合[23],分析發(fā)現,73個(83.91%)芒果bHLH結構域的9位點為谷氨酸(E),其中72個在9位點為谷氨酸(E)且12位點為精氨酸(R),而且研究發(fā)現具有9位點為E且12位點為R結構的bHLH蛋白具有識別并結合E-box序列(CANNTG)的功能[24],57個(65.52%)bHLH蛋白結構域在5位點為組氨酸(H)或賴氨酸(K)、9位點為谷氨酸(E)且13位點為精氨酸(R),而在植物中該結構被證實用于識別并結合G-box[25]。在14個9位點不是谷氨酸(E)的bHLH結構域中,有3個bHLH結構域的堿性區(qū)內含5個及以上堿性氨基酸(R、K或H),這3個bHLH蛋白可能在非E-box序列處與DNA結合[4]。11個bHLH結構域9位點不是谷氨酸(E)且堿性區(qū)內含5個以下堿性氨基酸(R、K或H),該類bHLH蛋白不具有結合DNA功能[26]。

    2.4? 芒果bHLH家族蛋白進化樹及基序分析

    通過MEGA 6.0軟件構建芒果bHLH家族蛋白的系統(tǒng)進化樹。由圖2可知,在進化樹中,相同類型的bHLH蛋白聚在一起,且相近分支的bHLH序列長度及結構域位置相近。

    3? 討論

    植物bHLH蛋白參與抗逆、生長發(fā)育、生物合成及信號傳導等生理生化過程[35]?;谏镄畔W分析技術,目前已從一些植物如擬南芥[36]、水稻[37]、人參[38]、西瓜[39]、茶樹[40]、葡萄[41]、蘋果[42]等分別鑒定出162、167、169、96、120、110、175個bHLH蛋白。

    本研究基于芒果果實轉錄組數據,鑒定出87個bHLH家族蛋白,其中酸性蛋白所占比例較大,大部分為不穩(wěn)定蛋白,且均為不含信號肽的親水性蛋白,此現象與‘短柄櫻桃[43]等多種植物的bHLH家族蛋白相似。除CL10714.Contig1為膜結合轉錄因子外,其余bHLH蛋白均不含跨膜結構,推測CL10714.Contig1與芒果對環(huán)境的脅迫響應有關[44]。大部分芒果bHLH家族蛋白二級結構中無規(guī)卷曲所占比例最大,該結果與云南紅皮梨bHLH轉錄因子一致[45]。

    芒果bHLH蛋白結構域有多個氨基酸位點保守性較高,且保守位點與西瓜[39]和蓮[46]bHLH蛋白的分析結果相似。87個芒果bHLH蛋白中的73個(83.91%)具有E-box結合功能,57個(65.52%)具有G-box結合功能,該結果與擬南芥(60.54%)和水稻(56.89%)[37]的分析結果相似。

    進化樹上相近分枝的芒果bHLH的基序組成相同,序列長度及結構域位置相近,與擬南芥bHLH的分析結果相似[27]。

    芒果bHLH蛋白共注釋到GO分類中生物學過程、細胞組分和分子功能3大類功能的17個亞類,其中56.32% bHLH蛋白注釋到結合功能。

    對芒果和擬南芥bHLH蛋白共同構建的進化樹分析發(fā)現,芒果bHLH蛋白與擬南芥有較高的保守性,大部分芒果bHLH蛋白與擬南芥不同亞組的bHLH蛋白聚在一起,推測芒果bHLH蛋白與相近的擬南芥bHLH蛋白具有相似的功能,該分析將為下一步芒果bHLH蛋白的功能分析提供參考?;诖朔椒ǎ珻hen等[47]發(fā)現與擬南芥AtbHLH112同源的水稻OsbHLH068在參與鹽脅迫響應時與AtbHLH112功能一致,參與花期調控時與AtbHLH112功能相反。

    bHLH蛋白參與植物的多種生命活動,本研究從芒果轉錄組數據中鑒定87個bHLH家族蛋白,為今后芒果bHLH家族蛋白的研究提供了基礎。由于轉錄組數據的局限性,所鑒定的僅為芒果bHLH家族的部分蛋白序列,因此,芒果bHLH家族蛋白還有待進一步挖掘和研究。本研究僅對部分芒果bHLH蛋白進行了功能預測,其具體功能有待進一步驗證。

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