橡膠樹(shù)COP9家族基因的克隆及表達(dá)分析

吳紹華 張世鑫 鄧小敏 陳月異 田維敏

摘? 要? COP9信號(hào)小體（CSN）是進(jìn)化上保守的蛋白復(fù)合體，在茉莉酸信號(hào)途徑中起著重要的作用。橡膠樹(shù)的乳管是一種特化的細(xì)胞器，是天然橡膠合成和儲(chǔ)存的場(chǎng)所。現(xiàn)有的證據(jù)表明橡膠的生物合成可能受到茉莉酸信號(hào)途徑的調(diào)控，但是對(duì)于茉莉酸信號(hào)途徑調(diào)控天然橡膠的生物合成還了解的不夠。本研究采用RACE技術(shù)結(jié)合RT-PCR從膠乳中克隆了8個(gè)CSN基因的全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)與擬南芥的相似性，分別命名為HbCSN1～HbCSN8。熒光定量PCR結(jié)果顯示，8個(gè)CSN基因均能在樹(shù)皮、不同發(fā)育時(shí)期的葉片、膠乳、雄花和雌花中表達(dá)，其中HbCSN5在膠乳中的表達(dá)量最高，其他成員在葉片中的表達(dá)量最高。而且，部分HbCSNs基因在膠乳中的表達(dá)受到割膠和茉莉酸甲酯處理的上調(diào)表達(dá)。因此，推測(cè)這些上調(diào)表達(dá)的成員可能參與膠乳的茉莉酸信號(hào)途徑。

關(guān)鍵詞? 巴西橡膠樹(shù);COP9信號(hào)復(fù)合體;基因克隆和表達(dá)分析;進(jìn)化樹(shù)分析

中圖分類號(hào)? S794.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

COP9信號(hào)小體（COP9 signalosome）又稱CSN復(fù)合體，是一種進(jìn)化上高度保守的多亞基蛋白復(fù)合體[1-2]。最初是鄧興旺等生物學(xué)家于1992年在擬南芥光形態(tài)建成的研究的過(guò)程中，采用T-DNA標(biāo)簽技術(shù)，分離篩選到一系列突變體，這些突變株由于相應(yīng)基因的缺失導(dǎo)致暗中的生長(zhǎng)植物呈現(xiàn)出一種類似于光下生長(zhǎng)的狀態(tài)，并克隆了COP1基因。隨后，他們又克隆了其他COP成員[3-6]。CSN也在多種有機(jī)體中相繼被發(fā)現(xiàn)，并且證實(shí)CSN復(fù)合體參與調(diào)控多個(gè)重要的生物過(guò)程。在高等真核生物，COP9信號(hào)小體由8個(gè)CSN成員組成，分別命名為CSN1～CSN8，其中6個(gè)亞基CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN7和CSN8含有PCI（Proteasome， COP9 signalosome and eIF3）結(jié)構(gòu)域[7]。另外2個(gè)亞基CSN5和CSN6含有MPN（Mpr1-Pad1-N-terminal）結(jié)構(gòu)域[6， 8]。在植物中，CSN一個(gè)主要的功能就是參與蛋白的降解。作為泛素-蛋白酶降解系統(tǒng)的組分，CSN通過(guò)移除cullin蛋白中的NEDD8（neural precursor cell- expre ssed developmentally downregulated-8，植物中也稱為RUB（RELATED TO UBIQU IT IN））來(lái)調(diào)控cullin- RING E3泛素連接酶的活性[8-12]。通過(guò)這種方式，CSN與SCF（SKP1-CUL1-F-box-type CRLs）復(fù)合體協(xié)作參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝調(diào)控中起著重要的作用。如CSN與SCFTIR1互作參與植物生長(zhǎng)素信號(hào)途徑[10， 13];CSN與SCFUFO互作參與花發(fā)育[14];CSN與SCFCOI1互作參與茉莉酸信號(hào)途徑[15-16];CSN與SCFSLY1互作參與赤霉素的信號(hào)途徑[17-18];CSN與SCFCFK1互作參與種子的發(fā)育[19]。

在天然橡膠生產(chǎn)中，人們通過(guò)有規(guī)律地重復(fù)切割橡膠樹(shù)樹(shù)干樹(shù)皮（割膠），切斷樹(shù)皮中的乳管，多次收集從乳管傷口處流出的乳汁狀的膠乳來(lái)提煉橡膠。割膠顯著促進(jìn)橡膠樹(shù)膠乳的合成，割膠樹(shù)的膠乳內(nèi)源茉莉酸含量顯著高于未開(kāi)割樹(shù)，橡膠合成效率顯著高于未開(kāi)割樹(shù)，外施茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）促進(jìn)膠乳的生物合成，并鑒定了茉莉酸信號(hào)途徑的核心環(huán)節(jié)HbCOI1- HbJAZ3-HbMYC2及其對(duì)法尼基焦磷酸合酶和小橡膠粒子膜蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[20]。這些結(jié)果表明，割膠促進(jìn)橡膠生物合成與激活茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑有密切聯(lián)系。為了進(jìn)一步豐富和了解茉莉酸信號(hào)途徑在橡膠生物合成中的作用，本文克隆了COP9信號(hào)小體的8個(gè)CSN成員并進(jìn)行了組織特異性表達(dá)分析及割膠和茉莉酸甲酯處理的基因表達(dá)模式。

1? 材料與方法

1.1? 植物材料及處理

巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）為熱研73397品系，種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)場(chǎng)。組織特異性表達(dá)的樣品的采集：于同一天分別采集3株樹(shù)的樹(shù)皮、古銅期葉、淡綠期葉、成熟期葉、膠乳、雄花和雌花混合后置于液氮中用于RNA的提取。割膠處理樣品的采集：選取3株8 a樹(shù)齡的未開(kāi)割樹(shù)，采用S/2 d/3（1/2樹(shù)圍，3 d 1刀）的割制進(jìn)行連續(xù)割4刀，收集每刀的膠乳樣品于RNA提取液中用于RNA的提取。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）處理樣品的采集：參照郝秉中等[21]的方法，用0.07% MeJA分別處理橡膠樹(shù)萌條第三伸長(zhǎng)單位，于處理后2 h、4 h、8 h、1 d、2 d、3 d劃破受傷部位的樹(shù)皮采集膠乳，每一處理分別采集9株萌條的膠乳混合于RNA提取液中用于RNA的提取，對(duì)照為滅菌水處理萌條的膠乳樣品。

1.2? 方法

1.2.1? RNA的提取及cDNA的合成? 采用RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技（北京）有限公司，北京）提取不同組織樣品的RNA，并采用試劑盒附帶的DNase I進(jìn)行痕量DNA的消化。采用NanoDrop 2000 （Thermo Fisher Scientific， USA） 測(cè)定RNA的濃度，并用RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Fisher Scientific， USA）對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.2.2? HbCSN基因的克隆? 將擬南芥AtCSNs的序列同熱研8-79的轉(zhuǎn)錄組序列（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE59981.）[22]進(jìn)行同源性比對(duì)，獲得8個(gè)HbCSNs的unigene序列。這8個(gè)unigene序列缺失5′端序列，HbCSN1、HbCSN2、HbCSN4和HbCSN6缺失3′端序列。為了獲得完整的全長(zhǎng)cDNA序列，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech， USA）試劑盒對(duì)HbCSNs序列進(jìn)行了RACE（rapid-amp lification of cDNA ends）實(shí)驗(yàn)，引物如表1。對(duì)于5′-RACE，采用試劑盒附帶的5′-CDS primer A和SMARTer II A oligonucleotide對(duì)1 g總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得用于5′-RACE的cDNA。對(duì)于3′-RACE，采用3′-RACE CDS Primer A按照試劑盒說(shuō)明對(duì)1 g總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得用于3′-RACE的cDNA。以獲得5′-RACE和3′-RACE cDNA為模板，采用PrimeSTAR Max Premix （TaKaRa， Dalian， China）進(jìn)行5′和3′端序列的擴(kuò)增。將獲得的5′和3′端序列與unigene序列進(jìn)行拼接，并設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.3? 生物信息學(xué)及進(jìn)化樹(shù)分析? 采用NCBI網(wǎng)站上的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.html）對(duì)獲得的HbCSNs全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的預(yù)測(cè)，并翻譯成氨基酸。用Conserved Domain Search Service（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行氨基酸保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。利用PSORT（http：// psort.hgc.jp/form.html）對(duì)氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。采用基因結(jié)構(gòu)顯示在線系統(tǒng)GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）[23]對(duì)8個(gè)橡膠樹(shù)CSN成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥的AtCSN蛋白序列，首先用Clustal W進(jìn)行序列多重比對(duì)，再利用MEGA 4.0軟件，選擇neighbour-joining（NJ）模型，并進(jìn)行1000次Bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，構(gòu)建HbCSNs蛋白序列與擬南芥CSN蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用ProtParam tool （http：//web.expasy.org/ protparam/）評(píng)估HbCSNs蛋白的分子量及理論等電點(diǎn)（pI）。

1.2.4? 熒光定量PCR分析? 不同組織樣品及不同處理樣品第一鏈cDNA稀釋10倍用作模板采用Maxima SYBR Green qPCR Master Mixes （Thermo Scientific Inc.， USA）試劑基于CFX384 System （Bio-Rad Laboratories Inc.， USA）平臺(tái)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。10 μL反應(yīng)體系中，包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Premix、10 μmol/L上游引物和下游引物（表1）各0.3 μL、滅菌水補(bǔ)足10 μL。每1個(gè)PCR反應(yīng)重復(fù)3次，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán);循環(huán)完后進(jìn)行產(chǎn)物溶解曲線分析。利用CFX manager 3.0軟件自動(dòng)進(jìn)行基線和Cq值分析，以HbActin （GenBank HQ260674.1）作為內(nèi)參基因[24-26]，采用CFX384系統(tǒng)中2ΔΔCq算法進(jìn)行基因的相對(duì)定量表達(dá)分析。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用one-way ANOVA對(duì)處理及對(duì)照進(jìn)行差異顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? COP9家族基因HbCSNs的克隆及特征分析

通過(guò)比對(duì)分析，在橡膠樹(shù)熱研8-79中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)匹配COP9家族基因的unigene，經(jīng)過(guò)ORF（open reading frame）分析，發(fā)現(xiàn)這8個(gè)unigene不具有完整的閱讀框，因此進(jìn)行了5′-RACE，3′-RACE分析，通過(guò)拼接及RT-PCR擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證，獲得了8個(gè)具有完整閱讀框的COP家族基因，根據(jù)與擬南芥的同源性，我們將這8個(gè)成員

分別命名為HbCSN1～HbCSN8，并將HbCSN1～ HbCSN8的全長(zhǎng)cDNA序列登陸NCBI，GenBank登錄號(hào)分別為KX156270～KX156277。以熱研73397的基因組中CSN基因序列為依據(jù)，采用GSDS2.0分析了HbCSN1～HbCSN8的基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明橡膠樹(shù)中的CSN基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)均是由多個(gè)外顯子及多個(gè)內(nèi)含子組成（圖 1）。COP家族基因HbCSN1～HbCSN8的ORF長(zhǎng)594～1320 bp，編碼197～439個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量（molecular weight，MW）介于22.641～ 51.395 ku之間，理論等電點(diǎn)pI介于4.98～6.26之間。根據(jù)NCBI的CDD保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN7和HbCSN8具有PCI結(jié)構(gòu)域，HbCSN5和HbCSN6具有MPN結(jié)構(gòu)域（表2）。HbCSNs蛋白序列的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3被定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi);HbCSN4和HbCSN6被定位于葉綠體中;HbCSN5和HbCSN7被定位于細(xì)胞核中;HbCSN8被定位于微體（過(guò)氧物酶體）中。

HbCSN1～HbCSN8與擬南芥CSN基因家族的同源性比對(duì)顯示，橡膠樹(shù)CSN與擬南芥CSN的同源性在65.97%～88.38%之間，其中HbCSN2與AtCSN2的同源性最高，達(dá)到88.38%;HbCSN3與AtCSN3的同源性最低，達(dá)到65.97%（表2）。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，HbCSN1～HbCSN8分別與擬南芥AtCSN1～AtCSN8蛋白的親緣關(guān)系較近，聚為一類（圖2）。

2.2? HbCSNs組織特異性表達(dá)分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了8個(gè)HbCSNs基因在橡膠樹(shù)樹(shù)皮、不同發(fā)育時(shí)期的葉片、膠乳、雌花及雄花中的表達(dá)量。結(jié)果顯示，8個(gè)HbCSNs基因均能在樹(shù)皮、古銅期葉、淡綠期葉、成熟期葉、膠乳、雄花和雌花中檢測(cè)到表達(dá)，其中HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN6和HbCSN8基因在淡綠期葉片中的表達(dá)量最高，其次是成熟期葉片;HbCSN5在膠乳中的表達(dá)量最高，HbCSN7在成熟期葉片中的表達(dá)量最高（圖3）。

2.3? 割膠處理對(duì)膠乳中HbCSNs基因表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN5、HbCSN7和HbCSN8基因的表達(dá)量在割膠后顯著上調(diào)，其中HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN7和HbCSN8基因第2、3、4刀的表達(dá)量與第1刀相比，表達(dá)量的上升達(dá)到極顯著水平;HbCSN5基因第3、4刀的表達(dá)量與第1刀相比，表達(dá)量的上升達(dá)到極顯著水平。相反，HbCSN6基因的表達(dá)量在割膠的第2、3刀后顯著下調(diào)。HbCSN2基因的表達(dá)量不受割膠的影響（圖4）。

2.4? 外施茉莉酸甲酯（MeJA）處理對(duì)膠乳中HbCSNs基因表達(dá)的影響

熒光定量表達(dá)分析顯示，除了HbCSN2和HbCSN7的表達(dá)不受MeJA處理的外，其他6個(gè)HbCSNs基因的表達(dá)量在不同處理時(shí)間表達(dá)上調(diào)，其中HbCSN1、HbCSN3、HbCSN6和HbCSN8基因的表達(dá)在MeJA處理8 h后顯著上調(diào)，1 d后達(dá)到最高，在2 d后降下來(lái)。而且，HbCSN1的基因表達(dá)量上升的幅度最大，MeJA處理8 h和1 d后的表達(dá)量約是對(duì)照的2倍。HbCSN4和HbCSN5基因分別在MeJA處理1 d和4 h后上調(diào)表達(dá)（圖5）。

3? 討論

氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，橡膠樹(shù)HbCSN1～HbCSN8與擬南芥AtCSNs相似，其中HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN7、HbCSN8分別和AtCSN1、AtCSN2、AtCSN3、AtCSN4、AtCSN7、AtCSN8結(jié)構(gòu)相似，均具有PCI結(jié)構(gòu)域;HbCSN5、HbCSN6分別和AtCSN5、AtCSN6結(jié)構(gòu)相似，均具有MPN結(jié)構(gòu)域。PCI結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑OP9蛋白復(fù)合體的組裝是必須的，這是因?yàn)镻CI結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了多亞基復(fù)合物中蛋白與蛋白互作的穩(wěn)定性[27-28]。MPN結(jié)構(gòu)域可以細(xì)分為具有生物活性的MPN+和無(wú)活性的MPN[29]。CSN5含有MPN+結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)嵌入式的金屬蛋白酶基序JAMM（Jab1/ MPN/Mov24），JAMM基序作為CSN異肽酶的催化中心起作用[1， 9， 30-32]。CSN6含有非活性MPN結(jié)構(gòu)域，缺少JAMM基序，但是可能參與調(diào)控JAMM活性[33-34]。橡膠樹(shù)HbCSNs與擬南芥的AtCSNs具有相似的結(jié)構(gòu)域，可能具有與擬南芥相似的功能。

Feng等[15]采用免疫共沉淀和凝膠過(guò)濾分析在擬南芥體內(nèi)證實(shí)CSN3、CSN4、CSN5和CSN6與SCFCOI1具有直接的聯(lián)系，基因組表達(dá)圖譜分析表明，JA引發(fā)的基因組表達(dá)在很大程度上依賴于COI1的劑量，更重要的是COI1依賴性JA應(yīng)答基因要求CSN起作用，而且CSN的豐度對(duì)于JA響應(yīng)具有重要的作用，據(jù)此推測(cè)CSN與SCFCOI1在體內(nèi)相互作用介導(dǎo)JA的響應(yīng)。本研究中，MeJA處理能顯著上調(diào)HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN5和HbCSN8基因的表達(dá)豐度，HbCSNs表達(dá)豐度的上調(diào)是否也與JA的響應(yīng)相關(guān)還需要進(jìn)一步的研究。CSN不僅參與調(diào)節(jié)茉莉酸的響應(yīng)，可能還參與調(diào)控茉莉酸的合成和植物應(yīng)對(duì)食草動(dòng)物及病原體的傷害[35]。在擬南芥，一種具有環(huán)狀單鏈基因組DNA的雙生病毒，通過(guò)CSN介導(dǎo)的SCF E3連接酶復(fù)合體的脫氫化抑制JA信號(hào)[16]。因此，CSN基因可能介導(dǎo)JA信號(hào)反應(yīng)調(diào)控植物的發(fā)育和防衛(wèi)反應(yīng)。在本研究中，橡膠樹(shù)8個(gè)CSN基因在多個(gè)組織中均能檢測(cè)到表達(dá)，表明CSN可能參與了多種生理及發(fā)育的進(jìn)程。在膠乳中，HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN5和HbCSN8表達(dá)受割膠和MeJA處理顯著上調(diào)。這些基因的表達(dá)模式與JA信號(hào)途徑相關(guān)成員HbCOI1[36]、HbJAZ1[37]和HblMYC1[23]的表達(dá)模式相似。而且，有證據(jù)表明割膠和JA處理與天然橡膠的生物合成顯著相關(guān)[20， 38]，由此推測(cè)CSN可能參與膠乳的JA信號(hào)途徑，但是其具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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