啤酒活性干酵母凝血質(zhì)提取研究

田小海 王莘

摘要 [目的]研究并優(yōu)化啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的提取工藝。[方法]生長曲線法確定其培養(yǎng)時間，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，應(yīng)用低溫和葡聚糖凝膠（SephadexG-75）對凝血質(zhì)進行純化。[結(jié)果]啤酒活性干酵母最佳培養(yǎng)時間為9 d，凝血質(zhì)提取優(yōu)化工藝參數(shù)為乙醇濃度85%、提取溫度35? ℃、第1次丙酮體積（丙酮∶粗提液）為0.7、恒溫磁力攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)為600 r/min，凝血質(zhì)提取量可以達到1 000 mL活化液0.660 g，純化率為13%。[結(jié)論]從啤酒活性干酵母可提取凝血質(zhì)，方法簡單易實現(xiàn)，降低凝血質(zhì)動物來源的生成成本，具有極大的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞啤酒活性干酵母;凝血質(zhì);提取;純化

中圖分類號TS262.5+4文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0147-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.047

凝血系統(tǒng)是人體發(fā)揮內(nèi)源性或外源性凝血途徑的物質(zhì)基礎(chǔ)，凝血物質(zhì)一般可分為經(jīng)典凝血和激肽2個系統(tǒng)[1]。凝血質(zhì)屬于經(jīng)典凝血系統(tǒng)中的凝血因子Ⅲ，當凝血因子Ⅲ與其受體Ⅶa結(jié)合后，可通過啟動外源性凝血途徑而發(fā)揮凝血作用[2]。

凝血質(zhì)來源較為廣泛，主要有中藥、動物和微生物等。前人的研究主要集中在2種來源的凝血質(zhì)的提取，一種是從中藥中進行凝血質(zhì)分離和提取，另一種是從試驗動物的血液中進行提取和純化。中藥來源的凝血質(zhì)分離提取過程復(fù)雜、純化困難，獲取量少限制了其應(yīng)用;動物源性的凝血質(zhì)為優(yōu)質(zhì)凝血質(zhì)，但難于從動物體內(nèi)大量獲得，試驗動物獲取凝血質(zhì)生產(chǎn)成本較高，也限制了其應(yīng)用;微生物來源的凝血質(zhì)主要存在于半知菌綱的真菌中，啤酒活性干酵母中凝血質(zhì)含量豐富，容易擴大培養(yǎng)，分離提取及純化工藝相對容易，是獲得凝血質(zhì)的理想來源，但微生物來源的凝血質(zhì)的提取研究較少。筆者主要通過對啤酒活性干酵母的生長曲線的測定確定凝血質(zhì)提取的時間，通過醇浸提，脫水后乙醚提取，再通過丙酮沉淀的方法進行研究，達到優(yōu)化提取方案的目的。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。湖北安琪酵母公司提供安琪啤酒活性干酵母。

1.1.2試劑。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、鐵粉、瓊脂、蒸餾水、不同濃度的乙醇、無水硫酸鈉、乙醚、丙酮、考馬斯亮藍G-250、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、二巰基乙醇、四甲基乙二胺、過硫酸銨、鹽酸、甘氨酸、磷酸鹽緩沖溶液等。

1.1.3儀器。高壓蒸汽滅菌箱、光照培養(yǎng)箱、無菌操作臺、恒溫水浴箱、多循環(huán)水式真空泵、恒溫磁力攪拌器、搖床、離心機、分析天平、搖床、pH計、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機、分光光度計（可見光和紫外光）、冰箱、超聲波振蕩器、電泳儀、Sephadex G-75。

1.1.4培養(yǎng)基。

活化培養(yǎng)基[3]：葡萄糖2.5 g、蒸餾水100 mL，121.3 ℃，103.4 kPa，滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖40 g、蛋白胨和瓊脂各10 g、酵母膏5 g，加水至500 mL，121.3 ℃，103.4 kPa，滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[4-5]：葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 2 g、微量Fe粉，加水至500 mL，121.3 ℃，103.4 kPa，滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1啤酒活性干酵母活化和擴大培養(yǎng)[4-6]。

1.2.1.1菌種活化。2.5 g葡萄糖置于250 mL三角瓶中，加水100 mL，溶解后于電爐加熱煮沸，冷卻至35 ℃，即得活化液，121.3 ℃，103.4 kPa，滅菌20 min。啤酒活性干酵母0.2 g，35 ℃條件下加入活化液中，自然冷卻至30 ℃后，置于30 ℃水浴中活化2 h。

1.2.1.2斜面保存。取活化后菌種，在無菌操作臺進行斜面接種，培養(yǎng)7 d，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3擴大培養(yǎng)。取適量冷凍保存的菌種，接入40 mL（250 mL三角燒瓶）液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～30 ℃搖床振蕩（150 r/min）培養(yǎng)24 h，可用于凝血質(zhì)的提取分離。

1.2.2啤酒活性干酵母生長曲線的測定[7]。

250 mL活化液分別對生長1～12 d的啤酒活性干酵母進行測定，從培養(yǎng)24 h后開始，每間隔24 h收集一次菌體，由于離心效果差，采用靜置沉降的方法收集菌體[8]，測定前采用200目篩網(wǎng)對發(fā)酵液進行過濾，50 ℃以下對過濾得到的菌體進行烘干處理后進行稱重，根據(jù)稱重結(jié)果以發(fā)酵天數(shù)為橫坐標、干菌體量為縱坐標繪制曲線，即為生長曲線。

1.2.3啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的提取方法[9]。

啤酒活性干酵母干菌體在一定溫度下，通過一定濃度的乙醇浸提，獲得提取液;提取液在一定溫度下經(jīng)過濃縮，獲得膏狀物;膏狀物經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，再經(jīng)過乙醚提取，獲得乙醚提取液;乙醚提取液進行濃縮，獲得濃縮物;濃縮物經(jīng)丙酮沉淀后，獲得凝血質(zhì)粗品。250 mL活化液對乙醇濃度、提取溫度、轉(zhuǎn)速、丙酮濃度影響因素采用正交試驗L9（34） 確立最佳提取條件。

1.2.4啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的純化方法[10]。

除去脂類物質(zhì)，如麥角固醇、卵磷脂等可以采用乙醚揮發(fā)和低溫沉淀除去。

準確稱取SephadexG-75 2.0 g置于燒杯中，加入250 mL雙蒸水溶脹48 h;取直徑為2 cm、高60 cm層析柱，關(guān)閉出口后加入5 mL磷酸鹽緩沖溶液，緩慢加入溶脹好的凝膠顆粒，同時打開出口使其緩慢沉積。緩慢注入磷酸鹽緩沖溶液，達到柱平衡后將溶解在磷酸鹽中的凝血質(zhì)粗品溶液緩慢加入凝膠柱，不斷用磷酸鹽緩沖溶液洗脫，同時收集洗脫液進行干燥處理，即可得到純化的凝血質(zhì)。

2結(jié)果與分析

2.1啤酒活性干酵母活化及擴大培養(yǎng)結(jié)果

啤酒活性干酵母經(jīng)活化后保存的菌種接種于活化液12～16 h即可獲得較多菌體，為了便于試驗過程的進行，一般培養(yǎng)24 h后開始使用菌體。

2.2啤酒活性干酵母的生長曲線

對培養(yǎng)1～12 d的啤酒活性干酵母設(shè)定3個重復(fù)，分別烘干菌體后取平均值，根據(jù)具體的干菌體量制作其生長曲線見圖1。

凝血質(zhì)是啤酒活性干酵母生長繁殖過程中的初級代謝產(chǎn)物。因此，隨著菌體生成量的增多，凝血質(zhì)的產(chǎn)量也隨之增加，其凝血質(zhì)提取的最佳時期為8～10 d[11]，試驗中確定第9天啤酒活性干酵母菌量最多，250 mL活化液最多可獲得1.27 g干菌量。

2.3啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的提取

通過正交試驗結(jié)果（表2）分析，各項影響因素的最佳水平組合為A2B2C2D1，即乙醇濃度為85%、提取溫度35 ℃、攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)600 r/min、丙酮濃度為70%。4種影響因素的重要性排序為A>B>D>C，即乙醇濃度最重要，其次為提取溫度，再次為丙酮濃度，最后為攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)。

優(yōu)化工藝后采用85%乙醇、35 ℃、600 r/min、丙酮濃度為70%的條件下再次提取粗品凝血質(zhì)的量為0.165 g。1 000 mL活化液提取凝血質(zhì)粗品量達0.660 g。

2.4啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的純化

2.4.1啤酒活性干酵母凝血質(zhì)除脂類物質(zhì)。

將凝血質(zhì)粗品置于-14 ℃冰箱中過夜，即可除去凝血質(zhì)粗品中含有的少量麥角固醇和卵磷脂，使用冷凍干燥機可迅速干燥。

2.4.2啤酒活性干酵母凝血質(zhì)經(jīng)葡聚糖凝膠純化。

將0.660 g粗品凝血質(zhì)經(jīng)SephadexG-75可純化為凝血質(zhì)成品，可獲得純化的凝血質(zhì)0.085 8 g，使得啤酒活性干酵母純凝血質(zhì)的純化率達13%。

3討論與結(jié)論

3.1啤酒活性干酵母的培養(yǎng)

對啤酒活性干酵母的培養(yǎng)也嘗試利用酒糟中的成分以及糖廠的廢糖蜜等作為培養(yǎng)基進行培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^正交試驗確定蛋白飼料水、DDGS水、廢糖及酵母泥的最佳配比[12]，在培養(yǎng)原料上節(jié)省資源，便于擴大培養(yǎng)和投入實際生產(chǎn)。但由于培養(yǎng)的效果沒有達到預(yù)期，因此，該試驗中仍然采用了經(jīng)典的酵母菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件簡單，酵母菌對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分要求不高，僅在大量培養(yǎng)時消耗大量的葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等成分。

3.2啤酒活性干酵母生長曲線的測定

由于凝血質(zhì)為啤酒活性干酵母生長繁殖過程中產(chǎn)生的初級代謝產(chǎn)物，因此，菌體的量越多，所含有的凝血質(zhì)越多，測定其生長曲線非常必要。對啤酒活性干酵母生長曲線的測定可以采用干法或濕法2種測定方法。由于濕法測定中對于發(fā)酵液過濾的效果不能完全一致，因而導(dǎo)致測定結(jié)果不夠準確。但采用干法測定時，一定保證在烘干處理過程中溫度不能太高，否則會破壞蛋白質(zhì)的生物活性，導(dǎo)致其出現(xiàn)熱變性，因此溫度要嚴格控制在50 ℃以下。

3.3凝血質(zhì)提取過程中各種試驗因素的影響

培養(yǎng)后獲得的啤酒活性干酵母細胞壁的破壞可以采用多種方法處理，可以采用破壁效果較好的破壁機處理，效果較好;采用超聲波破碎會使得細胞壁破壞不均勻，嚴重的會破壞細胞內(nèi)蛋白成分，輕微的又不能起到破壁作用，效果不好;研缽研磨僅適合實驗室的小規(guī)模試驗，不適合擴大生產(chǎn)。因此，該試驗采用破壁機處理。

乙醇濃度過低（75%）浸提效果不好，濃度過高，會產(chǎn)生大量的難于與蛋白質(zhì)分離的物質(zhì)，且會造成乙醇的浪費。提取的溫度過低，不利于凝血質(zhì)的釋放，溫度過高，容易造成凝血質(zhì)的部分活性的破壞或喪失。一次丙酮濃度過高會造成浪費，但如果濃度過低則會導(dǎo)致其中殘留的乙醚無法徹底除去。磁力攪拌器轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)數(shù)高低的影響較小，但如果轉(zhuǎn)數(shù)過高容易造成溫度升高，要采用恒溫磁力攪拌器處理。因此，凝血質(zhì)提取過程中各種試驗影響因素的具體參數(shù)為：乙醇濃度85%;提取溫度35 ℃;一次丙酮濃度70%;轉(zhuǎn)數(shù)為600 r/min。

3.4凝血質(zhì)提取及純化比較

啤酒活性干酵母發(fā)酵9 d干菌體量達1.270 g/250 mL活化液，凝血質(zhì)的提取量為0.165 g/250 mL活化液，提取率達12.992%，與文獻[13]中的提取率提高5百分點;純化后凝血質(zhì)量為0.215 g/250 mL，純化率達13%，與文獻[13]中的純化率提高4百分點。因此，試驗達到了提取優(yōu)化和純化改進的效果。

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