羅氏核酸檢測(cè)系統(tǒng)的質(zhì)量控制

胡婷婷　蔣義　白穎　康香梅

[摘要] 病毒核酸檢測(cè)技術(shù)（NAT）是一項(xiàng)直接檢測(cè)病原體核酸的技術(shù)，隨著血站核酸檢測(cè)技術(shù)的全面覆蓋，質(zhì)量保證和質(zhì)量控制已成為核酸檢測(cè)的靈魂和核心。影響核酸檢測(cè)質(zhì)量的因素主要可分為檢測(cè)前、檢測(cè)中和檢測(cè)后三大因素，這些因素又與人員、儀器設(shè)備、材料、方法、環(huán)境等要素相互作用共同影響著核酸檢測(cè)的質(zhì)量。因此，單一因素的控制與質(zhì)量分析已然無法保證核酸檢測(cè)質(zhì)量，需要建立完善的質(zhì)量管理體系給予全流程控制，這樣還可以有效地預(yù)防經(jīng)輸血傳播病毒性疾病，降低經(jīng)輸血傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)。

[關(guān)鍵詞] 病毒核酸檢測(cè);技術(shù)質(zhì)量控制;質(zhì)量保證

[中圖分類號(hào)] R446.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-5654（2019）02（c）-0032-03

隨著血液核酸檢測(cè)工作在全國血液系統(tǒng)的全面深入，核酸檢測(cè)特異性強(qiáng)，靈敏度高，質(zhì)量體系的建立與完善就顯得尤為重要[1]。質(zhì)量控制的內(nèi)容涵蓋于得出檢驗(yàn)結(jié)果的所有步驟，包括從標(biāo)本收集、檢測(cè)直至報(bào)告結(jié)果簽發(fā)的整個(gè)檢驗(yàn)過程。長沙血液中心自2015年開展核酸血液篩查工作，選用國外診斷試劑羅氏血篩系統(tǒng)，采取6樣本混合檢測(cè)方案，現(xiàn)總結(jié)日常工作中對(duì)核酸檢測(cè)工作產(chǎn)生質(zhì)量影響的關(guān)鍵點(diǎn)，進(jìn)一步規(guī)范檢測(cè)人員對(duì)核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)的操作，提升檢測(cè)質(zhì)量，達(dá)到持續(xù)改進(jìn)的目的。

1? 測(cè)定前因素

1.1? 標(biāo)本采集

對(duì)采集工作人員進(jìn)行全員培訓(xùn)，先留取酶免管，再留取核酸管，采用低溫離心機(jī)離心，留樣后加蓋顛倒混勻8次以上，樣本在檢測(cè)前冷鏈運(yùn)輸?shù)臏囟仁?～10℃，整個(gè)采集過程做好質(zhì)量監(jiān)控。

1.2? 標(biāo)本接收

血液標(biāo)本的接收要求：①標(biāo)本與血液一一對(duì)應(yīng);②標(biāo)本質(zhì)量符合檢測(cè)項(xiàng)目技術(shù)要求，仔細(xì)核實(shí)標(biāo)本是否存在凝塊、未離心、溶血、乳糜、試管是否破損[2-4]，標(biāo)本量是否足量等現(xiàn)象，如有上述情況發(fā)生，進(jìn)行相關(guān)處理措施以后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，質(zhì)量不合格，抗凝劑的種類，采集管的順序、數(shù)量和方法都會(huì)影響血液樣本中核酸的檢出;③標(biāo)本信息具有可追溯性。

1.3? 實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室要做好關(guān)鍵儀器設(shè)備的維護(hù)、校準(zhǔn)包括核酸提取系統(tǒng)、擴(kuò)增判讀系統(tǒng)、微量加樣槍維護(hù)校準(zhǔn)。對(duì)維修后的加樣器、擴(kuò)增儀的光源、溫控系統(tǒng)等設(shè)備也要做好故障后的驗(yàn)證工作，對(duì)于紫外燈管也要定期監(jiān)測(cè)其輻射強(qiáng)度。我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)時(shí)需要特別注重設(shè)備的維護(hù)：①用75%乙醇重點(diǎn)擦拭Core-Tip金屬擋板，并放到正確的位置;②條碼夾僅供一次性使用，條碼夾與S-tube一一對(duì)應(yīng)，條碼夾需放到位;③打開CAP的工程師面板，觀察洗液接頭1和洗液接頭2有沒有大顆氣泡或管路的接頭處空出一段;④觀察注射器上端有沒有大型氣泡顆粒和黑色活塞上有無白色結(jié)晶;⑤試劑針針頭部有無液滴;⑥SPU的準(zhǔn)備（須上機(jī)前，上機(jī)后反復(fù)確認(rèn)），SPU須放置方向正確，確保每個(gè)SPU兩邊緊貼SPU架，上載儀器前對(duì)每個(gè)SPU兩邊分別目測(cè)核查，避免用蠻力拍擊SPU的蓋子（會(huì)導(dǎo)致S-tip卡死無法拔出導(dǎo)致機(jī)器停機(jī)）;⑦K-tip 及K-tube的放置應(yīng)注意，放置后迅速在Amplilink軟件上確認(rèn)是否有耗材識(shí)別錯(cuò)誤，K-tip及K-tube架可置于M-P的任意位置，K-tip及K-tube必須滿架上載，空架下載于CAP。

1.4? 理想的試劑和方法

羅氏核酸檢測(cè)試劑分為檢測(cè)試劑和對(duì)照試劑，試劑盒檢測(cè)試劑應(yīng)存放于專用試劑貯存區(qū)，以防試劑受到污染。試劑使用前要做好前批號(hào)的確認(rèn)，同時(shí)注意比較新舊批號(hào)之間變異系數(shù)的差異：要注意試劑穩(wěn)定性：不要冷凍試劑，2～8℃保存 MPX CS1，MPX CS2，MPX CS3和MPX CS4;開瓶有效期為20 d 2～8°C;累計(jì)使用時(shí)間;COBASR AmpliPrep 儀器中累計(jì)使用40 h，連續(xù)使用時(shí)間：COBASR AmpliPrep 儀器中連續(xù)24 h。應(yīng)對(duì)試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本收集、核酸提取、測(cè)定方法和儀器操作寫出“標(biāo)準(zhǔn)操作程序”。

1.5? 人員培訓(xùn)

“人”是一切工作的核心，針對(duì)核酸實(shí)驗(yàn)室工作人員的培訓(xùn)活動(dòng)應(yīng)該重點(diǎn)進(jìn)行，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程執(zhí)行，每一位工作人員都要有核酸實(shí)驗(yàn)室“無基因”或“無核酸”的概念，防止產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增結(jié)果，各區(qū)域的物品及實(shí)驗(yàn)記錄均為該區(qū)專用，不得交叉使用，了解核酸每一步驟制定的目的和意義，強(qiáng)化防治污染的意識(shí)。對(duì)因個(gè)人操作原因?qū)е碌膶?shí)驗(yàn)無效，應(yīng)納入人員評(píng)估過程，持續(xù)改進(jìn)，增加個(gè)人培訓(xùn)力度，同時(shí)應(yīng)該增加人員的外出進(jìn)修培訓(xùn)機(jī)會(huì)，學(xué)習(xí)前沿實(shí)用的工作經(jīng)驗(yàn)來指導(dǎo)實(shí)際工作，不斷提高工作人員的操作能力及數(shù)據(jù)分析能力。

2? 測(cè)定中因素

2.1? 室內(nèi)質(zhì)量控制

室內(nèi)質(zhì)量控制是指實(shí)驗(yàn)室工作人員為了決定當(dāng)批測(cè)定結(jié)果的有效性，報(bào)告是否能發(fā)出而采取的一系列工作。是對(duì)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的即時(shí)性評(píng)價(jià)。核酸檢測(cè)系統(tǒng)中每一個(gè)分析批均要測(cè)定一次質(zhì)控品，在核酸提取中，應(yīng)帶1份已知的弱陽性質(zhì)控標(biāo)本，其檢測(cè)結(jié)果是核酸提取和擴(kuò)增有效性的綜合反映，陰性對(duì)照無擴(kuò)增信號(hào)，陽性對(duì)照擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)在正常范圍之內(nèi)， 所有樣品內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增循環(huán)信號(hào)均在正常范圍。將濃度為200 IU/mL、2 000 IU/mL、2 000 IU/mL的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至接近檢測(cè)下限的2～5倍[5]，試驗(yàn)前充分混勻，監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)從加樣、核酸提取到擴(kuò)增的整個(gè)過程，室內(nèi)質(zhì)控品解凍后最好在72 h內(nèi)使用完，盡可能保證質(zhì)控品的穩(wěn)定性，要求質(zhì)控品擴(kuò)增信號(hào)在預(yù)期范圍內(nèi)，建立室內(nèi)質(zhì)控框架，觀察質(zhì)控品的穩(wěn)定性，對(duì)異常出現(xiàn)的質(zhì)控值，分析其原因，陽性質(zhì)控樣本失控的常見原因有：①核酸提取中的隨機(jī)誤差，如有機(jī)溶劑的去除不徹底、核酸提取中的丟失、所用耗材如離心管有 PCR抑制物、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等;②儀器的問題，如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、 孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等;③試劑的問題，如探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率、Taq酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活等[6]。

2.2? 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)

室間質(zhì)量評(píng)價(jià)主要是將通過實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量考評(píng)結(jié)果的比對(duì)，對(duì)既定項(xiàng)目檢驗(yàn)結(jié)果的一致性、準(zhǔn)確性進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，了解檢測(cè)結(jié)果差異，提出針對(duì)性改進(jìn)措施。目前該中心血液核酸檢測(cè)的室間質(zhì)評(píng)主要是做衛(wèi)生部、省臨檢中心室間質(zhì)評(píng)、澳大利亞室間質(zhì)評(píng)提供的相關(guān)標(biāo)本， 每次參加室間質(zhì)評(píng)后都對(duì)檢測(cè)結(jié)果做了及時(shí)的反饋，根據(jù)反饋結(jié)果與該室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，分析該實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。

3? 測(cè)定后因素

3.1? 質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)的建立

實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)的建立符合核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證指南、WS/T496-2017《臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量指標(biāo)》、IS015189《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》等規(guī)范的要求。我們實(shí)驗(yàn)室目前使用的檢測(cè)指標(biāo)主要有核酸和酶免陽性率、混檢陽性率、拆分陽性率、室內(nèi)質(zhì)控品確認(rèn)的批次數(shù)和失控率、核酸檢測(cè)設(shè)備的故障率、環(huán)境監(jiān)測(cè)陽性率及實(shí)驗(yàn)無效率和原因分析等[6]，并依據(jù)具體情況調(diào)整各項(xiàng)監(jiān)控指標(biāo)的監(jiān)測(cè)內(nèi)容，確保實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)檢測(cè)關(guān)鍵點(diǎn)均在監(jiān)控范圍內(nèi)。

3.2? 認(rèn)真審核測(cè)定結(jié)果，進(jìn)行無效原因分析

羅氏核酸檢測(cè)設(shè)備提取與擴(kuò)增的自動(dòng)化，提取好的核酸會(huì)通過中間的自動(dòng)化連接裝置轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)完成。羅氏核酸檢測(cè)試劑全部都是試劑盒形式，一方面減少了人為手工操作配置試劑的誤差，另一方面增加了對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行審核的要求，審核結(jié)果主要是對(duì)異常結(jié)果和擴(kuò)增曲線的分析利用。如內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)異常，靶標(biāo)曲線非典型，無核酸結(jié)果，匯集與拆分項(xiàng)目不一致，對(duì)照品及質(zhì)控品沒達(dá)到預(yù)期CT值，匯集陽性拆不出，這是否正常。對(duì)于COBASs201羅氏核酸檢測(cè)結(jié)果，反應(yīng)性結(jié)果優(yōu)先于其他結(jié)果，反應(yīng)性結(jié)果不能被拒絕，即便IC無效，反應(yīng)性pool將報(bào)告為反應(yīng)性，無效IC將會(huì)使無反應(yīng)性靶標(biāo)結(jié)果無效。針對(duì)該科2018年1—10月間羅氏核酸檢測(cè)系統(tǒng)中無效原因見表1，從表1分析可以看出，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)檢測(cè)無效的原因有很多，其中最為主要的是對(duì)照品的無效檢測(cè)，對(duì)此：①要加強(qiáng)人員操作方面的培訓(xùn)，嚴(yán)格遵守正規(guī)操作流程，對(duì)照品溫和倒置混勻3次（倒置需要等待2 s），并室溫平衡30 min;不要長期開蓋暴露在空氣中。②做好對(duì)照品的抽檢及確認(rèn)，試劑是否存在批間差異，試劑與質(zhì)控品是否匹配。

3.3? 清潔消毒

PCR實(shí)驗(yàn)強(qiáng)大的擴(kuò)增能力和檢測(cè)的敏感性致使極其微量的污染都會(huì)導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)，所以PCR實(shí)驗(yàn)過程中，防污染工作是一個(gè)不容忽視的問題，檢測(cè)完成后要注意環(huán)境，設(shè)備的清潔與消毒，包括：①酒精對(duì)設(shè)備、臺(tái)面、移液器、振蕩器、離心機(jī)、冰箱外及把手、生物安全柜面、進(jìn)行擦拭;②酒精對(duì)空噴灑，使其可能懸浮于空氣中的核酸片段進(jìn)行沉降，使其沉降于地面;③10% 84消毒液對(duì)地面、操作臺(tái)面進(jìn)行擦拭;④10 min后地面用清水處理一遍、臺(tái)面用清水處理兩遍;⑤紫外燈車對(duì)操作臺(tái)面進(jìn)行照射離開實(shí)驗(yàn)室;⑥屋頂紫外燈按照設(shè)定好的時(shí)間自動(dòng)進(jìn)行照射（22：00-24：00）;⑦廢棄物處理，包括一般包裝（試劑耗材包裝）、污染類（承載標(biāo)本的管類、參與標(biāo)本混合的試劑、擴(kuò)增產(chǎn)物）清潔消毒。

血液核酸檢測(cè)技術(shù)具有高度的敏感性，可大大縮短血液檢測(cè)窗口期，在提高血液安全性方面，降低輸血傳染病感染的風(fēng)險(xiǎn)有重大意義。該文就羅氏核酸檢測(cè)系統(tǒng)關(guān)鍵控制點(diǎn)做了初步討論，仍然需要不斷探索分析，只有完善質(zhì)量控制，健全質(zhì)量體系，才能保證核酸檢測(cè)工作準(zhǔn)確、可控的開展。

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