β-catenin及EZH 2陽性表達在原發(fā)性肝細胞肝癌中的診斷價值△

曾東，馮艷玲，鄭葉，楊月香，石雨涵

上海市（復旦大學附屬）公共衛(wèi)生臨床中心病理科，上海2015080

原發(fā)性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種高病死率的疾病，是較為常見的肝臟惡性腫瘤之一，嚴重威脅患者的生命安全[1]。但HCC在發(fā)病早期不易確診，且多被患者忽視，因此有效的早期篩查是降低HCC致死風險的主要手段[2]。隨著醫(yī)療水平的進步，血液相關因子診斷受到重視。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是診斷原發(fā)性HCC的特異性腫瘤標志物，但部分肝硬化患者的AFP表達水平也會出現(xiàn)異常增高，同時20%的晚期肝癌患者直至病死前，AFP的表達仍處于較低水平[3]。β-聯(lián)蛋白（β-catenin）、zeste 2多梳抑制復合物2亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）和信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）均為肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要調節(jié)因子，在肝癌的診療中扮演重要角色，因此為了選擇能夠輔助AFP確診HCC的血液相關因子，本研究采用β-catenin與EZH2聯(lián)合診斷后再聯(lián)合AFP的診斷方案，取得了較佳的診斷效果，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至2019年1月于上海市（復旦大學附屬）公共衛(wèi)生臨床中心接受檢查的疑似HCC的患者92例。納入標準：所有患者均具有肝炎病史，無淋巴結轉移，無其他合并癥。排除標準：伴嚴重黃疸、遠處轉移；凝血功能障礙；伴嚴重感染。92例患者中，經穿刺病理檢查確診HCC 50例，肝硬化23例，肝血管瘤19例。50例HCC患者中，男性31例，女性19例；年齡46～68歲，平均（54.5±5.3）歲；TNM分期[4]：Ⅰ期18例，Ⅱ期32例。42例非HCC患者中，男性25例，女性17例；年齡44～69歲，平均（53.8±6.0）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究通過上海市（復旦大學附屬）公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會審查，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

所有HCC患者于入院時采集清晨空腹靜脈血2 ml并儲存至-80℃冰箱，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（購自美國Sigma公司）檢測β-catenin和EZH2的濃度，采用美國貝克曼庫爾特全自動生化分析儀檢測AFP的表達情況，AFP＞25ng/ml定義為陽性。50例HCC患者均于術后取腫瘤組織和相應癌旁組織（距腫瘤邊緣1 cm），23例肝硬化患者采用手術穿刺方法取肝硬化組織，19例肝血管瘤患者采用穿刺方法取正常肝組織。所有組織石蠟包埋后，采用免疫組織化學法測定β-catenin、EZH2和STAT3的陽性表達情況[5]。

1.3 免疫組織化學結果判定

每例標本隨機選擇10個高倍視野（×400），分別計數(shù)100個腫瘤細胞，判斷β-catenin、EZH2和STAT3蛋白在各組織中的陽性表達情況。陽性表達指數(shù)為陽性細胞所占百分比評分及細胞質染色強度評分相加。陽性細胞所占百分比評分：無陽性細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。細胞質染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分。陽性表達指數(shù)＞3分為陽性，≤3分為陰性。

1.4 觀察指標

以穿刺病理檢查結果為“金標準”，分析各指標診斷HCC的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值和Kappa值。靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%，特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%，準確度=（真陰性+真陽性）例數(shù)/（真陽性+真陰性+假陽性+假陰性）例數(shù)×100%，陽性預測值=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陽性）例數(shù)×100%，陰性預測值=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陰性）例數(shù)×100%。本研究采用βcatenin和EZH2聯(lián)合診斷，兩種診斷指標均為陽性則判為陽性，否則為陰性；β-catenin和EZH2聯(lián)合診斷后的結果再與AFP聯(lián)合診斷，前者結果與AFP中有一個為陽性即可判為陽性，否則為陰性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 β-catenin、EZH 2、AFP對HCC的診斷價值

β-catenin單獨診斷HCC的準確度、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、Kappa值分別為67.4%、78.0%、54.8%、67.2%、67.6%、0.33，EZH2單獨診斷HCC的上述指標分別為66.3%、70.0%、61.9%、68.6%、63.4%、0.32；二者與AFP聯(lián)合診斷HCC的上述指標分別為89.1%、90.0%、88.1%、90.0%、88.1%、0.78。（表1）

表1 β-catenin、EZH 2單獨及聯(lián)合AFP診斷HCC與病理診斷結果的對照

2.2 不同組織中 β-catenin及EZH 2陽性表達情況的比較

HCC組織中β-catenin和EZH2陽性表達率均高于正常組織、肝硬化組織和癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；肝硬化組織中β-catenin和EZH2陽性表達率均高于正常組織和癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同組織中 β-catenin及EZH 2陽性表達情況的比較[ n（%）]

2.3 血漿與HCC組織中 β-catenin及EZH 2表達的相關性

HCC組織中β-catenin陽性表達及陰性表達患者的血漿β-catenin表達水平分別為（315.0±27.8）、（96.2±11.2）ng/L，HCC組織中EZH2陽性表達及陰性表達患者的血漿EZH2表達水平分別為（632.5±99.5）、（169.3±22.9）ng/L。經Pearson相關性分析可知，血漿中β-catenin及EZH2的表達情況與HCC組織中陽性表達情況均呈正相關（r=0.638、0.920，P＜0.05）。2.4 HCC組織中STAT 3與 β-catenin及EZH 2表達的相關性

經Pearson相關性分析可知，HCC組織中STAT3的表達與β-catenin及EZH2的表達均呈正相關（r=0.652、0.423，P＜0.05）。（表3）

表3 HCC組織中STAT 3、 β-catenin及EZH 2的表達情況

3 討論

β-catenin在人類的胚胎發(fā)育和腫瘤形成中具有重要的作用[6]。當細胞接受外界條件刺激時，β-連環(huán)蛋白 1（catenin beta 1，CTNNB1）基因表達上調，使下游因子β-catenin表達升高，隨后β-catenin被絲氨酸磷酸化激活，提高腫瘤細胞的轉移能力和侵襲能力[7]。而EZH2是多梳抑制復合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的甲基化酶亞基，其過表達和突變均可以誘發(fā)、促進腫瘤的發(fā)生和進展[8]。而上述兩種因子雖然在多種惡性腫瘤中高表達，但二者是否能夠作為早期篩查指標，且組織和血漿中的表達關聯(lián)性研究鮮有報道。AFP是診斷HCC的常用指標，但仍有20%的HCC患者出現(xiàn)漏診[9]。因此，本研究將β-catenin與EZH2先聯(lián)合診斷后再與AFP聯(lián)合進行HCC的診斷，結果發(fā)現(xiàn)該方案診斷靈敏度、特異度、準確度均在80%以上，且Kappa值＞0.6，與二者單獨診斷相比，診斷價值高。HCC組織中β-catenin與EZH2的陽性表達率均高于癌旁組織、肝硬化組織和正常肝組織，提示β-catenin和EZH2在原發(fā)性HCC組織中的陽性表達率較高，聯(lián)合診斷HCC具有一定輔助指導意義。但通常情況下，臨床實踐中會選擇更方便的診斷方式，而組織取材過于繁瑣且會對患者造成創(chuàng)傷，可接受度不高[10]。血液檢查是常用的檢查方式，因此本研究觀察了HCC患者組織和血液中β-catenin和EZH2表達的相關性，發(fā)現(xiàn)二者在血漿和組織中的表達均呈正相關，且相關性較強，提示血液中β-catenin和EZH2的表達也可以作為HCC的輔助診斷手段。

STAT3是信號轉導及轉錄激活因子家族的重要成員，在多種腫瘤細胞中被激活且過表達[11]。本研究中STAT3與β-catenin和EZH2表達均呈正相關。提示β-catenin和EZH2在HCC中高表達可能與STAT3有關。有研究顯示，STAT3可能旁作用于WNT經典信號通路從而激活β-catenin的表達[12]。相似地EZH2能夠通過加強STAT3的磷酸化使其過表達，從而促進腫瘤細胞生長[13]。還有研究顯示，EZH2能夠通過激活STAT3從而增強腎細胞癌的侵襲能力[14]。

綜上所述，β-catenin和EZH2在原發(fā)性HCC組織中表達水平較高，可以作為原發(fā)性HCC的輔助診斷手段，能夠提高AFP診斷的準確度，且STAT3可能參與了β-catenin和EZH2的高表達過程。