HPVE 6/E 7 mRNA和HPVDNA檢測(cè)技術(shù)在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的診斷價(jià)值分析

薛鵬，沈潔，李莉，趙靜，陳汶，喬友林，江宇

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，北京10073002國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院流行病學(xué)研究室，北京100021

3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院婦女保健科，北京100026

4暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院科教及學(xué)生管理辦公室，廣州510630

宮頸癌是威脅女性健康的常見腫瘤。研究顯示，持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的主要致病因素[1-2]。目前，以Isomega HPV DNA為靶點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)已被世界廣泛應(yīng)用。HPV DNA檢測(cè)技術(shù)具有較高的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值[3]，但由于該檢測(cè)技術(shù)特異度較低，假陽性率較高，增加了不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診風(fēng)險(xiǎn)[4]，因此，尋找靈敏度和特異度更高的檢測(cè)技術(shù)已成為臨床亟待解決的問題。Aptima HPV是一種檢測(cè)HPV DNA致癌基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物E6/E7mRNA的檢測(cè)技術(shù)，可更有效地發(fā)現(xiàn)HPV的持續(xù)性感染，且與宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）關(guān)系更為密切[5]，有望成為宮頸癌篩查的主流方法。INNO-LiPA HPV Genotyping Extra（INNO-LiPA）是一種基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和反向探針雜交原理的HPV分型技術(shù)，可具體區(qū)分28種HPV型別，該方法已廣泛應(yīng)用于HPV疫苗和流行病學(xué)相關(guān)研究中，是一種靈敏度較高的檢測(cè)方法[6-7]。本研究以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較HPVE6/E7mRNA和HPV DNA兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)CIN 2級(jí)及以上（CIN2+）的診斷效能，以INNO-LiPA HPV結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)不一致樣本進(jìn)行差異性分析，并評(píng)價(jià)HPVE6/E7mRNA檢測(cè)結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室間的一致性，探討HPVE6/E7mRNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值及臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016—2017年中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院和北京大學(xué)第一醫(yī)院婦科門診體檢的健康者和住院的宮頸病變患者共212例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡23～65周歲；②既往無宮頸手術(shù)史。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期女性。所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集和處理

由各醫(yī)院婦科醫(yī)師采用宮頸細(xì)胞采樣刷收集宮頸脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞保存液（購自美國Hologic公司）中保存，分別送往北京市迪安中心實(shí)驗(yàn)室和北京市懷柔婦幼保健院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行盲法檢測(cè)，反饋結(jié)果后，不一致標(biāo)本由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。病理診斷由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院和北京大學(xué)第一醫(yī)院的病理科醫(yī)師在未知其他檢查結(jié)果的情況下根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）宮頸腫瘤組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，診斷結(jié)果包括正常、CIN1、CIN2、CIN3和宮頸癌。

1.3 檢測(cè)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 HPVDNA檢測(cè) 取1 ml保存液于標(biāo)本管中，高速離心10 min除去上清液，加入100 μl裂解液，混勻。采用干式恒溫器95℃加熱15 min，取2 μl的反應(yīng)液加入至反應(yīng)管中，再加入陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和質(zhì)控對(duì)照。采用FQD-96A型熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)的四種熒光檢測(cè)通道（FAM、CY5、ROX、VIC）檢測(cè)15種高危型HPV（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68）及內(nèi)參（人β血紅蛋白基因）的表達(dá)情況。Ct值≤65判定為陽性，Ct值＞65判定為陰性。

1.3.2 HPVE 6/E 7mRNA檢測(cè) 取1 ml保存液轉(zhuǎn)移至PANTHER樣本管內(nèi)，嚴(yán)格按照全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)PANTHER系統(tǒng)進(jìn)行前期準(zhǔn)備和檢測(cè)。檢測(cè)程序包括3個(gè)步驟，分別為靶標(biāo)捕獲、靶標(biāo)擴(kuò)增及雜交保護(hù)反應(yīng)。最終檢測(cè)結(jié)果根據(jù)該分析物信號(hào)/閾值（S/CO）進(jìn)行判定：S/CO值≥0.5為陽性，S/CO值＜0.5為陰性。該方法可定性檢測(cè)14種高危型HPV，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68，但不能區(qū)分具體型別。

1.3.3 INNO-LiPAHPV分型檢測(cè) 當(dāng)HPVE6/E7mRNA和HPV DNA檢測(cè)方法的判定結(jié)果不一致時(shí)，需進(jìn)行INNO-LiPA HPV分型檢測(cè)。INNO-Li-PA HPV檢測(cè)采用以PCR為基礎(chǔ)的LiPA，以SPF10為引物應(yīng)用反向雜交技術(shù)檢測(cè)HPV基因分型。該技術(shù)可以識(shí)別28種HPV型別，分別為HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、66、68、69、70、71、73、74和82。LiPA條帶上有固定的HPV型別特異性DNA寡核苷酸探針雜交，通過酶促反應(yīng)使條帶上結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)域顯色，再通過比色分析法判讀條帶。

1.4 觀察指標(biāo)

靈敏度=篩檢試驗(yàn)正確診斷陽性例數(shù)/金標(biāo)準(zhǔn)確診陽性例數(shù)×100%，特異度=篩檢試驗(yàn)正確診斷陰性例數(shù)/金標(biāo)準(zhǔn)確診陰性例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 9.4軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kappa檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的一致性。以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病理分級(jí)受檢者HPVDNA和HPVE 6/E 7 mRNA檢測(cè)陽性率的比較

病理結(jié)果顯示，正常133例，CIN1 8例，CIN2 45例，CIN3 25例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）1例 。HPVE6/E7mRNA檢測(cè)的陽性率為38.7%（82/212），與HPV DNA檢測(cè)的43.9%（93/212）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HPVE6/E7mRNA和HPV DNA的檢測(cè)陽性率均隨著病理分級(jí)的升高而增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=138.126、103.640，P＜0.01）。（表 1）

表1 不同病理分級(jí)受檢者HPV E 6/E 7 mRNA和HPV DNA檢測(cè)的陽性情況[ n（%）]

2.2 HPVE 6/E 7 mRNA和HPVDNA檢測(cè)方法對(duì)CIN 2+的診斷價(jià)值

病理結(jié)果顯示，212例受檢者中，71例確診為CIN2+，141例確診為CIN2級(jí)以下（＜CIN2）。HPVE6/E7mRNA檢測(cè)CIN2+的靈敏度為92.96%（95%CI：84.55%～96.95%），與 HPV DNA 檢 測(cè)CIN2+的靈敏度90.14%（95%CI：81.02%～95.14%）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.364，P＞0.05）。HPVE6/E7mRNA檢測(cè)CIN2+的特異度為88.65%（95%CI：82.86%～92.89%），高于HPV DNA 的79.43%（95%CI：72.02%～85.28%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.469，P＜0.05）。（表2）

表2 HPV E 6/E 7 mRNA和HPV DNA檢測(cè)與病理診斷結(jié)果的對(duì)照

2.3 不一致標(biāo)本的INNO-LiPAHPV檢測(cè)結(jié)果

HPVE6/E7mRNA和HPV DNA檢測(cè)結(jié)果不一致的標(biāo)本共17例，接受INNO-LiPAHPV檢測(cè)。病理診斷結(jié)果為＜CIN2的標(biāo)本中，14例標(biāo)本HPV DNA檢測(cè)為陽性，INNO-LiPA HPV檢測(cè)為陽性，而HPVE6/E7mRNA檢測(cè)為陰性；1例標(biāo)本HPV DNA檢測(cè)為陰性，INNO-LiPA HPV檢測(cè)為陰性，而HPVE6/E7mRNA檢測(cè)為陽性。病理診斷結(jié)果為CIN2+的標(biāo)本中，2例標(biāo)本HPV DNA檢測(cè)為陰性，INNO-LiPA HPV檢測(cè)為陽性，HPVE6/E7mRNA檢測(cè)為陽性。（表3）

表3 不一致標(biāo)本的HPV檢測(cè)結(jié)果及病理結(jié)果

2.4 HPVE 6/E 7 mRNA檢測(cè)結(jié)果的一致性

北京市迪安中心實(shí)驗(yàn)室和北京市懷柔婦幼保健院實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)212例標(biāo)本進(jìn)行HPVE6/E7mRNA檢測(cè)，陽性一致的標(biāo)本例數(shù)為78，陰性一致的標(biāo)本例數(shù)為121，總一致率為93.87%（95%CI：89.79%～96.38%），Kappa=0.872，一致性較好。

3 討論

宮頸癌的篩查方法主要包括細(xì)胞學(xué)和HPV檢測(cè)，但由于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)水平差異較大，難以建立以細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)且行之有效的篩查體系[8]。因HPV檢測(cè)技術(shù)診斷宮頸癌和癌前病變的特異度和陽性預(yù)測(cè)值均較低，會(huì)導(dǎo)致較多的假陽性結(jié)果和不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診，造成醫(yī)療資源的浪費(fèi)[9]。檢測(cè)HPV致癌基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物E6/E7mRNA能更有效地發(fā)現(xiàn)高危型HPV的持續(xù)性感染，診斷宮頸癌及癌前病變的特異度更高。E6/E7mRNA檢測(cè)技術(shù)在國外已成功用于宮頸癌的篩查[10-12]，但國內(nèi)針對(duì)該技術(shù)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)較少。因此，亟需評(píng)價(jià)HPVE6/E7mRNA在宮頸病變中的診斷價(jià)值，以及其在實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的一致性，探討其作為宮頸癌檢測(cè)技術(shù)的價(jià)值及意義。

本研究結(jié)果表明，HPVE6/E7mRNA和HPV DNA檢測(cè)CIN2+的靈敏度無明顯差異，但HPVE6/E7mRNA檢測(cè)的特異度高于HPV DNA檢測(cè)，與既往研究結(jié)果一致[13-15]，表明與HPV DNA檢測(cè)相比，HPVE6/E7mRNA檢測(cè)可更準(zhǔn)確地診斷真正的高危人群。此外，HPVE6/E7mRNA檢測(cè)的陽性率隨病理分級(jí)的升高而增加，表明HPVE6/E7mRNA可能與病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。這可能是因?yàn)椋S著HPV逐漸整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA中，E6/E7蛋白的表達(dá)水平升高，從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性程度增高[16]。

為進(jìn)一步探討HPVE6/E7mRNA和HPV DNA檢測(cè)結(jié)果的差異，將兩種方法檢測(cè)的不一致標(biāo)本進(jìn)行INNO-LiPA HPV分型檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14例標(biāo)本HPVE6/E7mRNA檢測(cè)陰性，但HPV DNA檢測(cè)陽性，INNO-LiPA HPV檢測(cè)結(jié)果也均為陽性，且涵蓋了HPV DNA檢測(cè)的HPV型別范圍。檢測(cè)不到E6/E7mRNA的原因很可能是因?yàn)镠PV處于感染早期，往往發(fā)生的是一過性感染，提示HPV感染很可能會(huì)自發(fā)清除[17]，此時(shí)HPV在細(xì)胞核內(nèi)處于游離狀態(tài)，E6/E7mRNA不表達(dá)或病毒載量低于其檢測(cè)下限，導(dǎo)致HPVE6/E7mRNA的檢測(cè)結(jié)果呈陰性。此外，3例HPV DNA檢測(cè)結(jié)果陰性而HPVE6/E7mRNA檢測(cè)結(jié)果為陽性的標(biāo)本中，1例標(biāo)本INNO-LiPA HPV檢測(cè)結(jié)果為陰性，這可能因?yàn)楦呶Ｐ虷PV整合后L1區(qū)缺失導(dǎo)致DNA斷裂[18]，而HPV DNA檢測(cè)以L1區(qū)為目標(biāo)，因此導(dǎo)致其檢測(cè)結(jié)果呈假陰性；另外2例標(biāo)本病理分級(jí)為CIN2+且INNO-LiPA HPV檢測(cè)結(jié)果為陽性，可能是因?yàn)镠PV的濃度較低，低于HPV DNA的檢測(cè)下限而未檢出，表明HPVE6/E7mRNA檢測(cè)CIN的結(jié)果可能更為可靠。

此外，本研究結(jié)果顯示，北京市迪安中心實(shí)驗(yàn)室和北京市懷柔婦幼保健院實(shí)驗(yàn)室采用盲法檢測(cè)同一批標(biāo)本的HPVE6/E7mRNA，總一致率達(dá)到了93.87%，Kappa=0.872，滿足了國際上HPV檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證指南的標(biāo)準(zhǔn)（一致率不低于87%，Kappa不低于0.5）[19-20]，表明HPVE6/E7mRNA檢測(cè)的穩(wěn)定性較好。但本研究納入的樣本量較少，研究結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生偏倚，仍需大規(guī)模、多中心、前瞻性的研究進(jìn)行驗(yàn)證，再進(jìn)一步推廣。

綜上所述，與HPV DNA檢測(cè)技術(shù)相比，HPVE6/E7mRNA檢測(cè)宮頸病變的特異度更具優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性檢測(cè)的一致率較高，有望成為中國宮頸癌HPV篩查的首選方法。