以丙酸鈣作抑菌劑制備獼猴桃酒工藝研究

周 文，舒學(xué)香，張崇軍，唐賢華

（1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830；2.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065）

獼猴桃發(fā)酵酒及其他果酒釀造過(guò)程中大多采用SO2作為抑菌劑，以防止雜菌生長(zhǎng)從而造成發(fā)酵異常甚至產(chǎn)生毒素[1-4]，但SO2可能破壞人體的酶活力，影響人體新陳代謝，對(duì)肝臟造成一定的危害，SO2在酒中存在是對(duì)人體健康的一種潛在威脅，而且過(guò)量攝入會(huì)刺激呼吸道粘膜組織，進(jìn)而誘發(fā)多種呼吸道炎癥[5]。因此其每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為0～0.7mg/kg，我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了SO2在果酒中的最高限量（≤0.25 mg/kg）[6]，然而在規(guī)定最大量的前提下，SO2在果酒中并不能充分的起到抗氧化及抗菌等作用[7-8]，所以尋找SO2的替代物是有必要的。

丙酸鈣具有一定的抗菌活性[9]，是一種常用的食品添加劑，在酸性條件下能夠抑制細(xì)菌和霉菌而對(duì)酵母菌無(wú)害，國(guó)標(biāo)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中為規(guī)定其在獼猴桃酒等果酒中的用量，但規(guī)定了在醬油、醋、面包等食品中的使用量不超過(guò)2.5 g/kg[6]，ADI不作限制性規(guī)定。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在獼猴桃果漿中添加0.6 g/L丙酸鈣可以起到良好的抑菌效果，且安全性更高[10]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定，以及通過(guò)頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用（headspacesolidphase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）和香氣成分分析評(píng)價(jià)，以獲得一種風(fēng)味優(yōu)良且對(duì)人體危害小的獼猴桃發(fā)酵酒非常有必要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅陽(yáng)獼猴桃（都江堰）：市售；丙酸鈣（食品級(jí)）：泰州市味香源食品添加劑有限公司；安琪葡萄酒高活性干酵母BV818：安琪酵母股份有限公司；偏重亞硫酸氫鉀、碳酸鈣（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；果膠酶、明膠（生化試劑）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；GCMS-QP2010型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、Essentia LC-16型液相色譜儀：日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取頭：美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 獼猴桃酒制備工藝

獼猴桃漿果→分選→清洗去皮→打漿→添加果膠酶→添加抑菌劑→調(diào)整pH→接種酵母→前發(fā)酵→倒罐→后發(fā)酵→澄清→降酸→陳釀→過(guò)濾→獼猴桃酒

添加果膠酶：獼猴桃果漿初始糖度16.5°Bx，初始pH 3.47；果膠酶添加量100 mg/L，于40℃恒溫處理1 d；

添加抑菌劑：以丙酸鈣為抑菌劑添加量為0.6 g/L，以SO2（偏重亞硫酸氫鉀按50%SO2當(dāng)量計(jì)）[11]為抑菌劑添加量為80 mg/L；

干酵母活化：活性干酵母中加入10倍含4%蔗糖的38℃溫水，活化30 min；

前發(fā)酵：接種后發(fā)酵至獼猴桃漿糖度5°Bx，結(jié)束前發(fā)酵進(jìn)行轉(zhuǎn)罐后發(fā)酵；

后發(fā)酵：后發(fā)酵溫度15℃，時(shí)間15 d；

澄清：按30 mg/L的量向獼猴桃原酒中加入明膠；

降酸：用碳酸鈣降酸至5～6 g/L（酒石酸計(jì)）；

陳釀、過(guò)濾：4℃陳釀30 d，過(guò)濾后得獼猴桃酒成品。

1.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

主發(fā)酵溫度優(yōu)化：調(diào)整獼猴桃果漿pH至3.5，接種量0.08%，分別于18℃、20℃、22℃、24℃、26℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行主發(fā)酵，對(duì)制得的獼猴桃酒分別進(jìn)行感官評(píng)分。

初始pH值優(yōu)化：接種量0.08%，用檸檬酸或碳酸鈣分別調(diào)整初始pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，于24 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行主發(fā)酵，對(duì)制得的獼猴桃酒分別進(jìn)行感官評(píng)分。

主發(fā)酵接種量?jī)?yōu)化：調(diào)整獼猴桃果漿pH至3.5，分別調(diào)整接種量為0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%，于24℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行主發(fā)酵，對(duì)制得的獼猴桃酒分別進(jìn)行感官評(píng)分。

（2）響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行研究和分析，并確定3因素3水平的最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，各因素及水平編碼見(jiàn)表1。

表1 獼猴桃酒制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for kiwi fruit wine production technology optimization

1.3.3 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

感官評(píng)分由5名專(zhuān)業(yè)人員按照表2中的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，滿分100分，每個(gè)酒樣得分取5人平均值。感官評(píng)價(jià)方法參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行[12]。

表2 獼猴桃酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of kiwi fruit wine

1.3.4 理化指標(biāo)檢測(cè)方法

酒精度、總糖、總酸、SO2含量[12]測(cè)定：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定。

丙酸鈣含量測(cè)定[13]：參照GB 5009.120—2016《食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測(cè)定》，采用液相色譜法測(cè)定。

1.3.5 HS-SPME-GC-MS條件[14-16]

樣品處理：取樣前先將萃取頭插入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）進(jìn)樣口，250℃老化2 h。將獼猴桃酒樣吸取5 mL裝入15 mL頂空瓶中，并迅速加入1.0 g NaCl，加蓋密封，置于40℃水浴鍋中平衡20 min。將老化好的萃取針插入頂空瓶，40℃水浴中萃取40 min后插入GC-MS進(jìn)樣口，于250℃解吸5 min。

色譜條件：色譜柱KB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫：初始溫度40℃保持2 min，以2℃/min的速率升溫至80℃后，以5℃/min的速率升溫至150℃后，再以10℃/min的速率升溫至250℃，保持5 min；以氦氣為載氣，流速1 mL/min，分流比1∶7。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；離子源溫度280℃；電子能量70 eV；掃描范圍：30～450 u。

數(shù)據(jù)處理：采集到的質(zhì)譜圖利用NIST08譜庫(kù)進(jìn)行檢索，對(duì)各色譜峰按面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行了發(fā)酵溫度、初始pH值、接種量對(duì)主發(fā)酵影響的單因素試驗(yàn)，其結(jié)果分別如圖1～圖3所示。

由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，獼猴桃酒的感官質(zhì)量隨之提升，當(dāng)溫度升至24℃時(shí)獼猴桃酒的質(zhì)量最好，當(dāng)溫度達(dá)到26℃時(shí)酒質(zhì)又有所下降。其主要原因在于，當(dāng)發(fā)酵溫度偏低時(shí)，酵母菌繁殖速度較慢，主發(fā)酵啟發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，從而導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，染雜菌機(jī)會(huì)增加，使獼猴桃酒發(fā)霉或酸度明顯增加。當(dāng)溫度超過(guò)24℃時(shí)，由于酵母增殖快，導(dǎo)致衰亡速度增加，發(fā)酵中止快產(chǎn)酸增加[11]，同時(shí)高級(jí)醇等副產(chǎn)物增多，導(dǎo)致酒質(zhì)下降。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)獼猴桃酒質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of main fermentation temperature on the quality of kiwi fruit wine

圖2 初始pH值對(duì)獼猴桃酒質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of initial pH on the quality of kiwi fruit wine

圖3 接種量對(duì)獼猴桃酒質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of inoculum on the quality of kiwi fruit wine

由圖2可知，初始pH值為3.5時(shí)發(fā)酵所得獼猴桃酒品質(zhì)最佳，當(dāng)初始pH值低于3.5時(shí)酵母菌的發(fā)酵作用受到了一定的抑制，且因?yàn)檎{(diào)酸加入了一定量的檸檬酸導(dǎo)致獼猴桃酒的酸度增加，口感變差。當(dāng)初始pH值超過(guò)3.5時(shí)，隨著初始pH值的升高獼猴桃酒品質(zhì)大幅下降，其主要原因在于，隨著初始pH值的升高丙酸鈣的抑菌效果急劇下降，在酸性條件下丙酸鈣游離產(chǎn)生的丙酸分子可穿透霉菌的細(xì)胞壁，抑制細(xì)胞內(nèi)酶的活性，從而阻礙霉菌等雜菌的增殖[17]，初始pH值越低產(chǎn)生的丙酸分子越多，抑菌效果越好。當(dāng)初始pH值達(dá)到5.0時(shí)可看到獼猴桃酒大量發(fā)霉。

由圖3可知，當(dāng)接種量＜0.08%時(shí)，隨著接種量增加獼猴桃酒的品質(zhì)逐漸變好，主要原因在于當(dāng)接種量較低時(shí)，發(fā)酵初始階段酵母菌沒(méi)有占據(jù)發(fā)酵優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致雜菌的生長(zhǎng)，酒的品質(zhì)變差。當(dāng)接種量＞0.08%以后獼猴桃酒的質(zhì)量趨于平穩(wěn)且略有下降，其原因是接種量增大，發(fā)酵后期酵母死亡自溶增加，給獼猴桃酒帶來(lái)了一定的酵母味。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Deign-Expert8.0.6軟件進(jìn)行了響應(yīng)面試驗(yàn)分析設(shè)計(jì)，其設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表3所示，回歸模型方差分析見(jiàn)表4。通過(guò)軟件對(duì)表3進(jìn)行回歸擬合得到感官評(píng)分（R）與影響發(fā)酵3因素發(fā)酵溫度（X）、初始pH值（Y）、接種量（Z）的回歸方程：

R=90.8-0.063X-0.19Y+1.38Z-0.62XY-4.96X2-3.21Y2-1.59Z2

表3 獼猴桃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization of kiwi fruit wine

通過(guò)軟件對(duì)模型進(jìn)行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，其結(jié)果如表4所示。由表4可知通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后得到的模型極顯著（P＜0.01），說(shuō)明該模型可信。失擬項(xiàng)P=0.1985，影響不顯著（P＞0.05），復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.980 6，僅有0.01%不能由該模型解釋?zhuān)旁氡?6.148＞4。綜合以上分析，可知該模型能夠很好的擬合試驗(yàn)結(jié)果[18-20]。由表4可以看出，一次項(xiàng)中X（發(fā)酵溫度）、Y（初始pH）影響不顯著（P＞0.05），Z（接種量）影響極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)X2、Y2、Z2均極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)XY、XZ、YZ均不顯著（P＞0.05），說(shuō)明影響發(fā)酵工藝的3個(gè)因素之間沒(méi)有明顯的交互作用。通過(guò)F值推斷試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的重要性，可知各因素對(duì)感官評(píng)價(jià)影響的主次順序是接種量＞發(fā)酵溫度＞初始pH。

借助Design-Expert 8.0.6軟件獲得主發(fā)酵溫度、初始pH和接種量對(duì)感官評(píng)分影響的三維響應(yīng)面曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)軟件分析，可以得出以丙酸鈣作為抑菌劑制備獼猴桃發(fā)酵酒的最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵溫度23.99℃，初始pH3.49，接種量0.09%，在此條件下制備的獼猴桃發(fā)酵酒感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為91.1。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

圖4 初始pH值、接種量以及發(fā)酵溫度交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of initial pH,inoculum and fermentation temperature on sensory score

2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)及理化指標(biāo)分析

根據(jù)實(shí)際操作條件，將發(fā)酵條件調(diào)整為主發(fā)酵溫度24℃，初始pH3.5，接種量0.09%，在此條件下以丙酸鈣為抑菌劑（A）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)該條件下制得的獼猴桃酒進(jìn)行了理化指標(biāo)分析，并與同樣條件下以SO2為抑菌劑（B）制得的獼猴桃酒進(jìn)行了對(duì)比分析，其結(jié)果如表5所示。

表5 最適條件下制得獼猴桃酒的理化指標(biāo)分析Table 5 Physicochemical indexes analysis of kiwi fruit wine produced under optimal conditions

從表5可以看出，分別以丙酸鈣和SO2作為抑菌劑制得的獼猴桃酒具有相似的感官評(píng)分，且酒精度、總糖、總酸三個(gè)主要理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果相近。說(shuō)明丙酸鈣可以替代傳統(tǒng)獼猴桃酒生產(chǎn)中使用的抑菌劑SO2，制得了獼猴桃酒具有相近的感官和理化性質(zhì)，為獼猴桃酒的生產(chǎn)提供了一種新的方法和思路。以丙酸鈣為抑菌劑制得的獼猴桃酒中丙酸鈣含量為1.625g/kg，符合我國(guó)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[6]中的要求。

2.4 香氣成分分析

采用頂空固相微萃取-氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPMEGC-MS）分別對(duì)以丙酸鈣和SO2作為抑菌劑制得的獼猴桃酒進(jìn)行香氣成分分析，其總離子流色譜圖如圖5所示。

從圖5可以看出，不同的獼猴桃酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS總離子圖譜極其相似，香氣成分的出峰時(shí)間幾乎完全相同，說(shuō)明兩種獼猴桃酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分組成差異不大，由此表明使用不同的抑菌劑對(duì)獼猴桃酒揮發(fā)性風(fēng)味成分組成影響不大。采用面積歸一化法，對(duì)檢測(cè)到的主要香氣成分對(duì)應(yīng)峰進(jìn)行定量分析，其結(jié)果如表6所示。

圖5 不同抑菌劑制得獼猴桃酒的香氣成分的GC-MS總離子流圖Fig.5 Total ions chromatogram of aroma components of kiwi fruit wine produced by different bacteriostats by GC-MS

表6 不同抑菌劑制得獼猴桃酒的香氣成分對(duì)照Table 6 Comparison of aroma components of kiwi fruit wine produced by different bacteriostats

從表6可以看出，兩種獼猴桃酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分組成類(lèi)似，兩者的共有成分有9種，其中以酯類(lèi)物質(zhì)為主，大多數(shù)酯類(lèi)具有令人愉悅的香氣，對(duì)構(gòu)成獼猴桃酒的典型香氣有重要作用[21-22]，如辛酸乙酯具有令人愉快的花果香氣、杏子香氣，癸酸乙酯具有葡萄的水果香氣[23]。以丙酸鈣為抑菌劑制備的獼猴桃酒丙酸乙酯、3-甲基丁酸、苯乙醇、苯甲酸甲酯、2-乙基苯酚、苯甲酸乙酯的含量更高一些，特別是丙酸乙酯增加較多，其主要原因在于丙酸鈣溶解于酸性溶液中生成丙酸，丙酸與酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)而生成大量丙酸乙酯，丙酸乙酯具有菠蘿香味，可用作食品加香劑，GB 2760—2014規(guī)定為允許使用的香料，常用作于配制朗姆酒、白酒、菠蘿型香精等。兩種酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分含量不同，說(shuō)明使用不同的抑菌劑制備獼猴桃酒對(duì)酒的風(fēng)味具有一定的影響。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出，以丙酸鈣作為抑菌劑制備獼猴桃發(fā)酵酒的最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵溫度24℃，初始pH值為3.5，接種量0.09%。在此優(yōu)化條件下，實(shí)際驗(yàn)證獼猴桃發(fā)酵酒的感官評(píng)分為91.5分。

以丙酸鈣為抑菌劑在最優(yōu)工藝條件下制得的獼猴桃酒與以SO2為抑菌劑制得的獼猴桃酒相比較，在酒精度、總糖、總酸三個(gè)主要理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果相近，說(shuō)明丙酸鈣可以替代傳統(tǒng)獼猴桃酒生產(chǎn)中使用的抑菌劑SO2。通過(guò)香氣成分比較發(fā)現(xiàn)，兩種獼猴桃酒主要揮發(fā)性風(fēng)味成分組成類(lèi)似，由于丙酸鈣的添加使獼猴桃酒中丙酸乙酯大量增加，不同抑菌劑制得獼猴桃酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分含量有差別導(dǎo)致風(fēng)味存在一定差別。

以丙酸鈣為抑菌劑制得的獼猴桃酒中丙酸鈣含量為1.625 g/kg，達(dá)到了我國(guó)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中的要求，說(shuō)明用此法生產(chǎn)獼猴桃酒是安全可行的。