復(fù)合酶法輔助提取漆樹籽粕多糖及抗氧化作用研究

姜洪芳，石寶俊，束成杰，張鋒倫，張衛(wèi)明

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京211111)

漆樹(RhussuccedaneaL.)是漆樹科(Anacarkiaceace)漆樹屬(Toxicodendron)的落葉喬木或灌木，是我國(guó)的一種重要經(jīng)濟(jì)樹種，主要分布在貴州、四川、云南、湖北、陜西等地，距今已有2 000余年的栽培歷史。漆籽是漆樹的果實(shí)，年產(chǎn)量約為200萬(wàn)噸，由糖類、纖維、粗蛋白、脂肪、水分和灰分等組成，油脂含量較高，可以從漆籽皮和漆籽仁中分別提取得到漆蠟和漆籽油。漆蠟中含有三甘油酯、游離脂肪酸和游離脂肪醇，品質(zhì)較高，價(jià)格低廉，可以代替棕櫚蠟和芳香蠟用于高檔化妝品行業(yè)[1]。漆油富含不飽和脂肪酸，其中亞油酸含量在60%以上，亞油酸具有調(diào)整血脂和抗動(dòng)脈硬化作用，能減少冠心病的發(fā)病率和死亡率，具有很高的保健功能[2]。作為重要的化工原料漆籽油還可用于制備生物柴油。漆籽的資源利用已引起各界的高度重視，漆籽加工漆蠟(油)后，剩余部分的漆籽餅粕年產(chǎn)量約為100萬(wàn)噸，含有36%糖類，30%粗纖維，20%粗蛋白，5%脂肪，其中的多糖類物質(zhì)進(jìn)一步提取、分離精制可以作為日用化學(xué)品、食品等原料，以期提高漆籽資源的綜合效益及增加漆樹籽粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

多糖是由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖因其充足資源和低毒高效的藥理活性廣泛應(yīng)用于食品和藥物領(lǐng)域[3-4]。目前已從植物中分離得到數(shù)百種多糖，大量的藥理實(shí)驗(yàn)表明，多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抑菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)胃腸功能、降低膽固醇，幫助身體組織結(jié)構(gòu)再生和修復(fù)，促進(jìn)傷口愈合等作用[5-7]。

多糖的提取方法有水提法、堿提法和酶提法等，其中酶提法是利用酶對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞作用，使存在于細(xì)胞內(nèi)部的多糖釋放出來(lái)，從而提高了多糖的得率。本實(shí)驗(yàn)采用纖維素酶和木瓜蛋白酶輔助法對(duì)漆樹籽粕進(jìn)行酶解后，結(jié)合陳虹霞等回流提取工藝[8]，研究了漆樹籽粕多糖的酶解最佳條件及對(duì)羥自由基和DPPH的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漆樹籽2017年10采集于陜西安康平利，自然晾干、粉碎成粉末，備用；纖維素酶(酶活性15 U/mg) (上海耕奔生物技術(shù)有限公司)；木瓜蛋白酶(酶活性80萬(wàn)U/g) (廣西龐博生物工程有限公司)；石油醚、乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、DPPH、過(guò)硫酸鉀、甲醇、抗壞血酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水自制。

T6-新世紀(jì)紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；PHS-3TC精密數(shù)顯酸度計(jì)(上海天達(dá)儀器儀器有限公司)。離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；HH-4恒溫水浴鍋(上海江星儀器有限公司)；FD-1冷凍干燥儀(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入蒸餾水溶解并定容到50 mL，得到0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.9 mL的1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL的試管中，補(bǔ)加蒸餾水至終體積為1.0 mL，分別加入1.0 mL 5%的苯酚，搖勻后，加入3.5 mL的濃硫酸，迅速振蕩搖勻，室溫下靜置25 min，在490 nm處測(cè)吸光度。繪制吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合線性回歸方程?；貧w方程Y=9.508 1X-0.013 9，相關(guān)系數(shù)R=0.999 3。葡萄糖在28～193 μg區(qū)間具有良好的線性關(guān)系。

1.2.2 熱回流浸提漆樹籽粕多糖

漆籽粉末，加入料液比1∶10(g∶mL)的石油醚在70 ℃下，提取4次，每次3 h，過(guò)濾，濾液合并，真空濃縮為漆蠟。濾渣干燥，即為漆樹籽粕。取漆樹籽粕10 g，放入500 mL燒瓶中，按20∶1的料液比加入蒸餾水，在50 ℃ 水中浸泡1 h，升溫至90 ℃提取0.5 h，冷卻至適宜溫度，加入適量酶溶液，酶解提取1 h。然后升溫至90℃提取1h過(guò)濾，得到濾液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60 ℃真空濃縮至50 mL，加入無(wú)水乙醇，與多糖水溶液的體積比約為25∶1，在4 ℃下靜置24 h，離心(4 000 r/min)得到沉淀，再用乙醚、丙酮(體積比約為10∶1)洗多糖沉淀兩次，最后將沉淀冷凍干燥得到各多糖提取物。按照1.2.1的方法在490 nm下測(cè)定吸光度。漆樹籽粕多糖得率(%)=(多糖的質(zhì)量/原料的質(zhì)量)×100。

1.2.3 木瓜蛋白酶、纖維素酶單因素試驗(yàn)

漆樹籽粕細(xì)胞壁、膜由多糖和蛋白質(zhì)組成， 采用木瓜蛋白酶和纖維素酶能夠水解蛋白和纖維素， 破壞細(xì)胞壁、膜結(jié)構(gòu)，使多糖易于從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。

1.2.3.1 木瓜蛋白酶單因素試驗(yàn)

90 ℃熱水提取0.5 h后，適當(dāng)冷卻，加入適量木瓜蛋白酶溶液，考察酶用量(為漆樹籽粕粉重量的0.1%、0.2%、0.5%、1% 、1.5%、2%)，酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)，酶解反應(yīng)pH值(4、5、6、7、8)，酶解反應(yīng)時(shí)間(0.5、1、2、3、4 h)對(duì)漆樹籽粕粗多糖得率的影響。

1.2.3.2 纖維素酶單因素試驗(yàn)

90 ℃熱水提取0.5 h后，適當(dāng)冷卻，加入適量纖維素酶溶液，酶解提取1h為固定條件，考察酶用量(為漆樹籽粕粉重量的0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%)，酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)，酶解反應(yīng)pH值(3.5、4、4.5、5、5.5、6)，酶解反應(yīng)時(shí)間(0.5、1、2、3、4 h)對(duì)漆樹籽粕粗多糖得率的影響。

1.2.4 漆樹籽粕多糖對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定

將漆樹籽粕多糖提取物用蒸餾水配制成0.05～50 mg/mL的濃度梯度，以Vc作為對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取1 mL樣品溶液，加入1 mL濃度為10 mmol/L的FeSO4溶液，混合均勻后加入2 mL濃度為2.5 mmol/L的過(guò)氧化氫和1 mL濃度為10 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，于510 nm處測(cè)其吸光度，空白對(duì)照對(duì)蒸餾水代替樣品溶液[9]。對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

其中：A0為反應(yīng)體系中不含樣品，即以1 mL 65%乙醇代替樣品的吸光度值；

A1為反應(yīng)體系中含有樣品的吸光度值；

A2為反應(yīng)體系中含有樣品,但以2.00 mL蒸餾水代替H2O2的吸光度值。

1.2.5 漆樹籽粕多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

分別移取不同濃度的樣品及對(duì)照品溶液2.00 mL，加入0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液2.00 mL，混勻15 s后，放置30 min，以2 .00mL不同濃度樣品或?qū)φ掌啡芤杭尤?.00 mL甲醇為參比，于517 nm測(cè)吸光度，記為A1，每個(gè)試樣作三次平行測(cè)定，取其均值，同時(shí)移取2.00 mL 65%乙醇加入2.00 mL 0.5mM DPPH甲醇溶液，混勻15 s后，放置30 min，以2.00 mL 65%乙醇加入2.00mL甲醇為參比，于517 nm測(cè)吸光度，記為A0[10]，并根據(jù)下述公式計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 木瓜蛋白酶單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶用量

木瓜蛋白酶加入量分別為漆樹籽粕重量的0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%，酶解溫度為45 ℃ ，結(jié)果見圖1。

圖1顯示，隨著蛋白酶用量的增加，多糖得率也逐漸增加，酶用量大于1%后提取率增加趨于平緩。考慮酶的成本及提取效果，宜將蛋白酶用量確定為1%。

2.1.2 酶解溫度

90 ℃熱水提取0.5 h后，加入適量木瓜蛋白酶溶液，酶用量為漆樹籽粕重量的1%，分別于40、45、50、55、60 ℃ 下酶解提取1 h， 結(jié)果見圖2。

圖1 木瓜蛋白酶用量對(duì)多糖得率的影響

圖2 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

圖2顯示， 酶解溫度對(duì)漆樹籽粕多糖的提取有顯著影響。在50 ℃ 時(shí)，多糖得率最高。

2.1.3 酶解反應(yīng)pH值

木瓜蛋白酶濃度為1%，將酶解反應(yīng)的pH值分別控制在4、5、6、7、8，在50 ℃ 下酶解反應(yīng)1 h，結(jié)果見圖3。

圖3 木瓜蛋白酶反應(yīng)pH值對(duì)多糖得率的影響

圖3顯示，酶反應(yīng)的pH值對(duì)香菇多糖的提取有很大影響，pH值在6～7之間時(shí)多糖的提取率最高?？紤]生產(chǎn)實(shí)際，可選用自然條件下的pH值。

2.1.4 酶解反應(yīng)時(shí)間

控制木瓜蛋白酶用量為1%， 自然pH值(約6.5)，在50 ℃下分別反應(yīng)0.5、1、2、3、4 h，結(jié)果見圖4。

圖4 木瓜蛋白酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

圖4顯示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率也隨之增加，當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)1 h后，得率的增幅趨于平緩。考慮實(shí)際生產(chǎn)情況，酶解作用1 h較為適宜。

2.2 纖維素酶單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶用量

控制纖維素酶濃度分別為漆樹籽粕重量的0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%，酶解溫度為40 ℃ ，結(jié)果見圖5。

圖5 纖維素酶用量對(duì)多糖得率的影響

圖5顯示，隨著纖維素酶用量的增加，漆樹籽粕多糖得率也隨之增加，酶濃度超過(guò)0.5% 后得率的增幅很小。因此，纖維素酶濃度確定為0.5%比較適宜。

2.2.2 酶解溫度

90 ℃熱水提取0.5 h后，加入適量纖維素酶溶液，使酶濃度為漆樹籽粕重量的0.5%，分別于35、40、45、50、55 ℃ 下酶解提取1 h，結(jié)果見圖6。

圖6顯示，酶反應(yīng)溫度在45 ℃時(shí)多糖得率最高。但在35～55 ℃ 范圍內(nèi)，提取結(jié)果無(wú)顯著差異， 因此實(shí)際生產(chǎn)中也可根據(jù)需要選擇溫度。

2.2.3 酶解反應(yīng)pH值

纖維素酶濃度為0.5%，將酶解反應(yīng)的pH值分別控制在3.5、4、4.5、5、5.5、6，在45 ℃下酶解反應(yīng)1 h， 結(jié)果見圖7。

圖6 纖維素酶反應(yīng)溫度對(duì)多糖得率的影響

圖7 纖維素酶反應(yīng)pH值對(duì)多糖得率的影響

圖7顯示，pH值對(duì)酶解提取效果有很大影響，pH值在4.5～5.0之間時(shí)，多糖得率最高。

2.2.4 酶解反應(yīng)時(shí)間

控制纖維素酶濃度為0.5%，pH值為5.0，在45 ℃下分別反應(yīng)0.5、1、2、3、4 h， 結(jié)果見圖8。

圖8 纖維素酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

圖8顯示，隨著酶解時(shí)問(wèn)的延長(zhǎng)，多糖提取率逐漸增加。當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)1h時(shí)，多糖得率增幅較小，因此酶解時(shí)間可確定為1 h。

2.3 漆樹籽粕多糖的抗氧化作用

2.3.1 漆樹籽粕多糖對(duì)羥基自由基的清除能力

活性物質(zhì)的抗氧化作用歸因于各種反應(yīng)機(jī)制，如清除自由基、還原能力，阻止連鎖啟動(dòng)及螯合催化反應(yīng)過(guò)程中所需的金屬離子等。羥自由基被認(rèn)為是氧化應(yīng)激損傷主要原因，其很容易穿過(guò)細(xì)胞膜，與碳水化合物、蛋白質(zhì)和DNA等大多數(shù)生物大分子反應(yīng)[11]。不同濃度的VC和漆樹籽粕多糖提取物對(duì)羥基自由基的清除能力如圖9所示。漆樹籽粕多糖提取物對(duì)羥基自由基具有較強(qiáng)的清除能力，10 mg/mL 的漆樹籽粕多糖和Vc 對(duì)羥自由基清除率分別為62.6% 和92.5%，漆樹籽粕多糖提取物對(duì)羥自由基的IC50值為8.16 mg/mL。說(shuō)明漆樹籽粕多糖能夠有效清除或阻止羥自由基反應(yīng)，將羥自由基轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的物質(zhì)[12]。

圖9 漆樹籽粕多糖對(duì)羥自由基的清除能力

2.3.2 漆樹籽粕多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其溶液具有特征的紫紅色團(tuán)吸收峰，當(dāng)其單電子在517 nm附近有強(qiáng)吸收(顯深紫色)。當(dāng)有機(jī)清除劑存在時(shí)，單電子被配對(duì)，吸收消失或減弱，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析。利用該方法研究漆樹籽粕多糖提取物的抗氧化能力。由圖10可知，對(duì)DPPH自由基的清除率與漆樹籽粕多糖的濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度從0.05 mg/mL增加至10 mg/mL時(shí)，清除率隨著濃度的增大顯著增強(qiáng)。當(dāng)濃度在10 mg/mL時(shí)，清除率為56.86%，清除效果低于VC，其IC50值為6.83 mg/mL。以上數(shù)據(jù)可以說(shuō)明漆樹籽粕多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖10 漆樹籽粕多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

3 結(jié) 論

在漆樹籽粕提取中加入木瓜蛋白酶和纖維素酶進(jìn)行輔助提取，能夠顯著提高多糖得率。纖維素酶的最佳酶解條件是：酶濃度是漆樹籽粕粉重量的0.5%，酶解溫度45 ℃ ，pH值4.5～5.0，酶解反應(yīng)1 h。木瓜蛋白酶的最佳酶解條件是：酶用量是漆樹籽粕粉重量的1%，酶解溫度50 ℃，pH值6～7， 酶解反應(yīng)1 h。在此條件下漆樹籽粕多糖得率為2.371%，與不加酶的漆樹籽粕多糖空白相比，多糖得率增加23.87%。研究漆樹籽粕多糖對(duì)羥自由基和DPPH自由基的清除能力，并與VC進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明漆樹籽粕多糖具有一定的抗氧化活性,其清除能力低于VC。當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為62.6%，IC50為8.16 mg/mL。當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為56.86%，IC50值為6.83 mg/mL。