黃精多糖提取工藝、結(jié)構(gòu)及藥理活性研究進(jìn)展

施吉祥，徐希明，余江南

(江蘇大學(xué) 藥學(xué)院, 藥物/基因轉(zhuǎn)運(yùn)與組織工程研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

黃精為百合科黃精屬草本植物，始載于《名醫(yī)別錄》，是我國傳統(tǒng)藥材和食材。黃精種類繁多，國內(nèi)現(xiàn)存31種，中國藥典中收錄了滇黃精(PolygonatikingianumColl.et Hemsl)、多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)和黃精(PolygonatumsibiricumRed.)三種；由于其形貌不同，也分別被稱為“大黃精”、“姜形黃精”和“雞頭黃精”。除藥典指明的三種外，其余種類的黃精藥用價(jià)值全然不同。在我國，滇黃精主要生產(chǎn)在云南、貴州等地；黃精主要產(chǎn)自東北，西北以及河南、湖北等地；多花黃精則在華東地區(qū)、中南地區(qū)等地較為常見[1]。

黃精性甘，味平。能滋腎潤肺，補(bǔ)脾益氣?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃精具有降血糖[2]、降血脂[3]、抗衰老[4-5]、抗炎[6]、抗腫瘤、抗輻射、免疫促進(jìn)等功效，在治療糖尿病、結(jié)核病、心血管系統(tǒng)疾病等疾病中具有良好應(yīng)用價(jià)值。黃精中主要含有：黃精多糖、甾體皂苷、蒽醌類化合物、生物堿[7]、強(qiáng)心苷等多種成分。其中黃精多糖的含量最高，且具有豐富的藥理活性。本文對近10年來國內(nèi)外對黃精多糖的提取工藝、結(jié)構(gòu)及生物活性研究進(jìn)行綜述，以期為黃精多糖進(jìn)一步的構(gòu)效關(guān)系研究提供參考。

1 黃精多糖的提取工藝

植物多糖的提取一般按去雜質(zhì)、破細(xì)胞壁和多糖提取三個(gè)步驟進(jìn)行。黃精多糖多富集于黃精的根中，藥典中也規(guī)定用根部入藥，故而需要先將黃精根洗凈、切片、干燥、粉碎后才能用于提取。為消除脂肪或皂苷對后續(xù)提取分離操作的影響，可先用石油醚、乙醇將脂類物質(zhì)分離，處理后的藥材粉末自然烘干或加熱烘干散去有機(jī)溶劑后進(jìn)行后續(xù)操作，脫脂的同時(shí)需要兼顧操作安全和環(huán)境保護(hù)。

植物細(xì)胞擁有一層維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁，其主要由果膠、纖維素和半纖維素組成，能有效保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境。要從胞漿中釋放多糖，就必須進(jìn)行破壁處理，不同的破壞細(xì)胞壁方法決定了不同的提取方法。破壞植物細(xì)胞壁的方式有高溫、酸堿、超聲、酶解等。

1.1 熱水提取法

熱水提取法(Hot water extraction，HWT)又稱煎煮法，是將藥材加水煎煮取汁的方法，通過持續(xù)高溫可使植物細(xì)胞壁軟化而破裂，進(jìn)而釋放出多糖。

熱水提取具有滲透性好、浸出率高、安全環(huán)保、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，是一種傳統(tǒng)有效的提取手段。熱水提取的對象需要水溶性好且具有一定的濕、熱穩(wěn)定性，能在一段時(shí)間內(nèi)忍受高溫而不發(fā)生結(jié)構(gòu)的明顯變化。

李麗[8]通過單因素實(shí)驗(yàn)確定料液比、提取時(shí)間、提取溫度以及提取pH的適宜范圍，用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)料液比和提取溫度是影響提取率的主要因素。在料液比為1∶20(g/mL)，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為80 ℃，pH為7時(shí)，提取率最大，為8.984%。郭未艷[9]通過正交試驗(yàn)考察了滇黃精多糖提取率的影響因素，結(jié)果表明各因素對多糖得率的影響順序依次為：提取溫度>提取時(shí)間>提取次數(shù)>料液比，得出的最佳提取工藝是料液比1∶15(g/mL)，重復(fù)3次，提取2 h，提取溫度80 ℃，提取率為11.76%。陳鋼[10]根據(jù)單因素影響實(shí)驗(yàn)，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比為因變量，多糖提取率為自變量，通過中心復(fù)合設(shè)計(jì)法進(jìn)行多元回歸擬合，分析得出提取溫度對提取工藝有極其顯著的影響，提取時(shí)間與料液比也較顯著，各因素對黃精多糖得率的影響順序?yàn)椋禾崛囟?提取時(shí)間>料液比。最終確定料液比為1∶21.5(g/mL)，提取溫度為73.5 ℃，提取2.64 h時(shí)有最大提取率，為12.25%。

綜上，不同文獻(xiàn)中對提取率與提取溫度、提取時(shí)間、料液比相關(guān)性的結(jié)論不統(tǒng)一，但提取溫度都控制在70-80 ℃，提取時(shí)間也都控制在2-8 h，可能的原因是當(dāng)提取溫度過高或是提取時(shí)間過長時(shí)，多糖發(fā)生損失，提取率不增反降。另外，因追求較高提取率而忽略能源的高倍損耗也不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，建議在用熱水提取法提取黃精多糖時(shí)，提取溫度設(shè)為70～80 ℃，加熱時(shí)間控制在2～8 h，以保證一定水平的多糖提取率和結(jié)構(gòu)完整性。

1.2 輔助提取法

為了能在提高提取率的同時(shí)，縮短提取時(shí)間或降低提取溫度，可將水提法與其它輔助手段結(jié)合，主要原理是通過外力加快細(xì)胞壁的破壞。

1.2.1 超聲輔助提取

超聲輔助提取法(ultrasound-assisted extraction，UAE)通過機(jī)械化學(xué)作用使植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)瞬間破裂釋放出有效成分，同時(shí)增加不混溶相之間的傳質(zhì)效率。與傳統(tǒng)的熱水提取方法相比，超聲輔助提取法可以提高提取率，節(jié)省操作時(shí)間，簡化操作流程[11]。徐艷[12]用超聲波細(xì)胞粉碎儀對黃精中多糖進(jìn)行提取獲得的多糖同水煎法、稀堿浸提法相比顏色淺，雜質(zhì)少，純度高。侯雙菊[13]在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以黃精多糖的提取率為響應(yīng)值應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波強(qiáng)化法提取參數(shù):超聲時(shí)間、提取次數(shù)和固液比，以提高多糖的提取效率，得出最佳提取條件為超聲時(shí)間2.6 min，提取次數(shù)2次，固液比為1∶23(g/mL)。在此條件下,與傳統(tǒng)的熱水提取法相比，黃精多糖的得率由11.685%提高至15.587%。

綜上，使用超聲輔助提取法，免去了加熱過程，大大縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率，但由于設(shè)備條件的限制，目前尚未用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

1.2.2 微波輔助提取法

微波輔助提取法(Microwave assisted extraction，MAE)提取多糖時(shí)，兩種主要機(jī)制同時(shí)發(fā)揮作用。一種是通過電磁波穿透細(xì)胞壁對內(nèi)外溶液進(jìn)行輻射，溶劑與細(xì)胞液吸收微波后將其轉(zhuǎn)化為熱能，并迅速升溫，使得乳化粘度降低，植物細(xì)胞外壁被破壞，有效成份從細(xì)胞內(nèi)部中釋放出來，被周圍的溶劑所溶解。另一種是分子旋轉(zhuǎn)，中和Zeta電位，從而提高提取率[14]。與傳統(tǒng)方法相比，微波提取法具有許多優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗妮^少的時(shí)間就能獲得較高的提取率，并且不會改變提取物的性質(zhì)[15]。

李志濤[16]等人通過正交試驗(yàn)研究了微波輔助提取黃精多糖時(shí)影響提取率的因素大小順序?yàn)椋何⒉ㄝ椪展β?物料粒度>微波輻照時(shí)間>料液比，確定優(yōu)化提取工藝條件：微波輻照功率為350 W，物料粒度為0.150 mm，微波輻照2 min，料液比為1: 30(g / mL)，提取率為10.57%。胡芳[17]等人同樣以正交試驗(yàn)考察了微波輔助提取法的工藝條件，發(fā)現(xiàn)最佳工藝為：黃精除雜后的粉末浸泡60 min后,按料液比1: 50(g / mL)、微波功率450 W，處理5 min，提取率為11.82%。

綜上，微波輔助提取法最大的優(yōu)勢在于縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率，但其所需的料液比較高，后續(xù)處理較為麻煩。

1.2.3 酶提取法

酶輔助提取(Enzyme assisted extraction，EAE)的基本原理是通過降低體系中的活化能，通過選取不同活性的酶在溫和的環(huán)境中將植物壁中的纖維素和果膠水解，從而破壞細(xì)胞壁釋放活性成分。用酶輔助提取法應(yīng)考察酶的類型和濃度，反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度，pH值和植物粉碎的粒度大小[18]。該提取方法溫和，不僅降低了對設(shè)備的腐蝕，而且減少了對有害溶劑的需求，縮短了提取時(shí)間。此外，在較低溫度下就可實(shí)現(xiàn)提取，降低了能耗。常用的酶有纖維素酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶、半纖維素酶、果膠酶等。酶輔助提取法的優(yōu)勢越來越受到人們的關(guān)注，用酶輔助提取植物多糖的報(bào)道也越來越多，對新酶的開發(fā)利用也有著廣闊的前景。

楊德[19]等通過響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取黃精多糖，所得最佳提取參數(shù)為酶解溫度54.8 ℃，酶解99 min，料液比1∶22.4(g/mL)，纖維素酶添加量3%。在這些條件下，多糖得率為11.22%。李智慧[20]等用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取黃精多糖，發(fā)現(xiàn)最佳提取工藝條件如下：纖維素酶添加量為黃精質(zhì)量的0.25%(g/g)，酶解120 min，酶解溫度為49 ℃，酶解pH為4.6，料液比1∶7.2(g/mL)，黃精多糖提取率可達(dá)(16.3±0.5)%。苑璐[21]等采用復(fù)合酶解法優(yōu)化黃精多糖的提取工藝，最終確定pH為5.0，酶解溫度為50 ℃，料液比為1∶20，加酶量為1.5 g/dL，酶解2 h，沸水浸提2 h時(shí)，提取率可達(dá)21.55%，為普通水提法得率的2.75倍；相比前者優(yōu)化的纖維素酶輔助提取，提取率提高了5.25%。

綜上，酶輔助提取法最大的優(yōu)勢是對料液比的需求不高，提取溫度也比較溫和，不需要加入額外的儀器設(shè)備；但若用于大規(guī)模生產(chǎn)，所需的用酶量也會隨之提升，如何將滅活的酶徹底除去是需要考慮的問題。

1.2.4 其他輔助提取法

除上述幾種方法外，其他被報(bào)道的黃精多糖提取方法見表1。

表1 黃精多糖的其他幾種輔助提取法

2 黃精多糖的結(jié)構(gòu)特征

多糖的結(jié)構(gòu)特征可由分子量、單糖組成、單糖序列、糖苷鍵的構(gòu)型和位置、糖鏈分支的類型和聚合度、空間構(gòu)型等方面表征[28]。多糖結(jié)構(gòu)的研究有初級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)[29]研究兩部分。其中，初級結(jié)構(gòu)又稱一級結(jié)構(gòu)，是指將多糖置于二維平面中解析得出的構(gòu)型，而多糖在空間中的立體構(gòu)象則被稱為高級結(jié)構(gòu)。其中，研究最多的是一級結(jié)構(gòu)，屬于多糖一級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)特征有分子量、單糖組成、糖苷鍵類型等。一級結(jié)構(gòu)可通過化學(xué)分析方法結(jié)合現(xiàn)代儀器分析手段進(jìn)行解析(詳見表2)，化學(xué)分析法包括甲基化、高碘酸氧化、Smith降解法等。一般認(rèn)為，多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)特征緊密相關(guān)[30]。對多糖初級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的探索能幫助人們更深入研究多糖的生物活性功能。表3為文獻(xiàn)中關(guān)于黃精多糖結(jié)構(gòu)的報(bào)道。得出的初步結(jié)論是：黃精多糖中多含β-吡喃環(huán)，分子量分布范圍在2.2到360 KDa之間，黃精多糖的單糖組成中一般含有葡萄糖和半乳糖中的一種或兩種。研究表明，同一黃精屬的各個(gè)物種含有多種多糖成分，遺傳背景、生長條件和收獲季節(jié)均可能是導(dǎo)致這種變化的原因，而提取分離等方式的改變亦會對黃精的多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。因此，為了讓黃精多糖的研究更有價(jià)值，可以通過規(guī)范市場，設(shè)立黃精種植基地，建立黃精多糖的提取分離純化標(biāo)準(zhǔn)，以減小得到的各黃精多糖結(jié)構(gòu)上的差異性，使黃精多糖藥理活性的發(fā)揮更加穩(wěn)定，市場地位得到提高。

表2 多糖結(jié)構(gòu)的現(xiàn)代分析手段

表3 文獻(xiàn)中報(bào)道的黃精多糖的結(jié)構(gòu)

注：NA:Not Available文獻(xiàn)中沒有提及。

3 黃精多糖的藥理活性

黃精多糖具有多種藥理活性，其相關(guān)研究詳見表4。

3.1 抗氧化活性

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)以超氧化物陰離子(·O2-)，羥自由基(·OH)和過氧化氫的形式存在，由正常代謝過程或藥物和外源性因素產(chǎn)生，是引發(fā)致癌、缺血再灌注損傷和炎癥的介質(zhì)[47-49]，此外這些活性氧能夠減緩衰老和預(yù)防阿爾茨海默病。人體能夠主動(dòng)防御抗氧化劑和修復(fù)氧化損傷，但無法完全防止氧化損傷，需要有抗氧化劑幫助清除活性氧和抑制活性氧的產(chǎn)生，加工食品中常用的合成抗氧化劑有BHA、BHT和TBHQ，然而考慮到這些合成抗氧化劑的安全性，可替代的天然抗氧化劑具有很好的開發(fā)前景。

研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖能顯著提高內(nèi)源性抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，抑制過氧化物MDA和LF的含量[50]，對羥自由基和超氧化物陰離子具有直接清除作用[51]。當(dāng)濃度大于0.05 mg/mL時(shí)，硫酸酯化黃精多糖對超氧陰離子自由基的清除率顯著高于黃精多糖[52]，說明結(jié)構(gòu)的改變可能會影響黃精多糖的抗氧化活性。

3.2 降血糖活性

糖尿病是由胰島素分泌不足或外周組織對胰島素不敏感導(dǎo)致的代謝紊亂，其特征為持續(xù)性高血糖[53]?？蓪⑻悄虿》譃镮型糖尿病(T1DM)，Ⅱ型糖尿病(T2DM)，妊娠期糖尿病(GDM)和其他類型的疾病。

現(xiàn)如今，糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的上升可能是由于現(xiàn)代生活水平的逐步提高和與之俱增的就業(yè)壓力所致[54]。數(shù)據(jù)顯示，亞洲地區(qū)II型糖尿病流行的比例很高[55]，其中青少年患II型糖尿病的人數(shù)比例正日益增加。西藥降糖速度快，是糖尿病患者的首選，但用西藥降糖，病情易復(fù)發(fā)，尤其對一些慢性并發(fā)癥缺乏有效的解決辦法，且服用化學(xué)合成藥會引發(fā)許多副作用[56]，近年來，人們嘗試從天然植物中開發(fā)無毒且高效的降糖藥物，如苦瓜[57]，黃芪[58]和黃精等。中草藥治療糖尿病，取材方便，療效穩(wěn)定，并能結(jié)合辨證靈活的組方[59]，但其有效成分、作用機(jī)制及療效驗(yàn)證等方面仍有不足，是現(xiàn)在研究的方向。

研究表明，黃精多糖對正常小鼠血糖水平無明顯影響，但可顯著降低腎上腺素誘發(fā)的高血糖小鼠血糖值，同時(shí)降低腎上腺素模型小鼠肝臟中cAMP的含量[60]。黃精多糖還可提高STZ糖尿病大鼠模型的胰島素敏感性，抑制胰島細(xì)胞凋亡，下調(diào)Caspase-3表達(dá)[61]，降低NO和NOS水平[62]。此外，陳婷婷[63]等人發(fā)現(xiàn)黃精多糖能降低糖尿病大鼠心肌TLR4、NF-κB和MIF蛋白表達(dá)，對糖尿病大鼠心肌炎癥具有保護(hù)作用。Wang Y[64]等人指出黃精多糖能通過降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠高血糖癥狀和氧化應(yīng)激，延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變和白內(nèi)障的發(fā)展。通過降低腎臟組織轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、型膠原(Col-I)蛋白表達(dá)，黃精多糖能對糖尿病大鼠腎臟起到保護(hù)作用[65]。

3.3 抗腫瘤

近年來，研究者將腫瘤與炎癥聯(lián)系到一起[66]，雖然非可控性炎癥不是腫瘤等復(fù)雜疾病的起始誘因，但很多腫瘤都是在炎癥部位被誘發(fā)，炎癥與某些腫瘤之間存在著緊密的聯(lián)系。Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)能選擇性的識別病原體中的病原相關(guān)的保守結(jié)構(gòu)，預(yù)先激活天然免疫，是宿主固有免疫的重要激活劑，其中TLR4在對抗細(xì)菌感染中發(fā)揮著核心的作用。

Long等[67]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在用黃精多糖對雌性57BL/6小鼠治療后，腫瘤重量明顯下降，抑瘤率提高，臟器指數(shù)升高。此外，CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞比例和血清細(xì)胞因子水平均有明顯改善。黃精多糖通過激活TLR4受體和下游MAPK/NF-κB信號通路發(fā)揮抗肺癌的免疫增強(qiáng)作用。

表4 黃精多糖的藥理活性

4 小結(jié)與展望

黃精多糖的提取工藝、結(jié)構(gòu)及其藥理活性已取得一定的研究成果，但是由于黃精來源以及提取分離純化方式的不一致，導(dǎo)致研究重復(fù)性不高，工作量較大，難以有進(jìn)一步的突破，希望通過結(jié)構(gòu)修飾早日解析出黃精多糖的構(gòu)型關(guān)系，將植物多糖的研究推上新的臺階。