茶樹咖啡堿合成酶基因稀有等位變異TCS1g的篩選、克隆及功能

劉玉飛，金基強，姚明哲，陳亮

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茶樹咖啡堿合成酶基因稀有等位變異的篩選、克隆及功能

劉玉飛1,2，金基強1，姚明哲1，陳亮1

（1中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，杭州 310008；2中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

【目的】茶樹咖啡堿合成酶1（TCS1）是山茶屬（）茶組植物咖啡堿合成的關(guān)鍵酶，具有豐富的等位變異。從我國豐富的茶樹種質(zhì)資源中發(fā)掘稀有等位變異并研究其功能，深入解析茶樹咖啡堿合成機制，為低咖啡堿育種提供新的基因資源。【方法】利用特異引物TCS1P InDel F/R對673份茶樹資源中的等位變異進行鑒定；使用引物TCS1cDNAF/R，從含有新稀有等位變異的茶樹資源中克隆基因的cDNA全長序列；利用生物信息學、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和原核表達等方法研究新發(fā)現(xiàn)稀有等位基因的功能?！窘Y(jié)果】在部分大理茶（）資源中鑒定到一個新的稀有等位變異，命名為。從大理茶資源‘龍陵17’（LL17，含有的等位變異為和）中克隆了的編碼區(qū)序列全長為1 098 bp，編碼365個氨基酸，編碼蛋白的分子量和理論等電點分別為40.9 kD和5.1。序列比對結(jié)果表明，與、、、、的相似度在94.1%—99.2%；與具有可可堿合成酶活性（TS）的和編碼蛋白序列相似度均大于96.7%，而與同時具有TS和咖啡堿合成酶（CS）活性的TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f相似度都小于95.4%，且TCS1g第221位氨基酸殘基與TCS1b、TCS1c同為組氨酸（His），而TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f為精氨酸（Arg）。第221位氨基酸殘基位于TCS1g蛋白活性中心，該位點的突變（His突變?yōu)锳rg），可以導(dǎo)致TCS1g的等電點（5.05變?yōu)?.06）和親水性（-0.119變?yōu)?0.123）發(fā)生改變。此外，5′上游調(diào)控區(qū)域的比對結(jié)果顯示、、起始密碼子（ATG）比、、延后了15 bp。原核表達發(fā)現(xiàn)TCS1g具有TS活性，活性為44.3 pkat/mg，但未檢測到CS活性。qRT-PCR的結(jié)果表明LL17中等位變異有表達。LL17的咖啡堿和可可堿的含量分別為40.3 mg·g-1和5.4 mg·g-1?！窘Y(jié)論】鑒定并克隆了一個新的稀有等位變異，其在LL17中具有一定的表達水平，且其表達蛋白具有TS活性，而未檢測到CS活性；推測決定TCS1g僅具有TS活性的關(guān)鍵位點是第221位氨基酸殘基。

等位變異；咖啡堿合成酶；功能分析；嘌呤生物堿；茶樹

0 引言

【研究意義】咖啡堿（caffeine，Cf）是茶葉的重要功能成分之一，具有興奮和刺激神經(jīng)的作用[1-4]，但是過量的攝入會使一些敏感人群出現(xiàn)失眠等現(xiàn)象[5-7]。因此，保持茶葉應(yīng)有風味和營養(yǎng)價值的低咖啡堿茶和茶制品受到了特殊需求消費群體的青睞[8]。低咖啡堿茶樹育種是實現(xiàn)茶葉低（無）咖啡堿最經(jīng)濟、安全和有效的方法[9]。從我國豐富多樣的茶樹種質(zhì)中發(fā)掘咖啡堿合成酶稀有等位基因資源，探析其遺傳機制，對低（無）咖啡堿茶樹育種具有重要理論和實踐指導(dǎo)作用?！厩叭搜芯窟M展】咖啡堿的生物合成是以黃嘌呤核苷（xanthosine，XR）為底物，通過三步甲基化、一步脫核苷酸化的核心途徑來實現(xiàn)的[10-12]（圖1）。核心途徑第一步（-7）、第二步（-3）和第三步（-1）甲基化反應(yīng)均由-甲基轉(zhuǎn)移酶類（-methyltransferases，NMTs）催化完成，其甲基供體是-腺苷-L-甲硫氨酸（-adenosyl-L-methionine，SAM）[13]。茶樹咖啡堿合成酶（tea caffeine synthase，TCS）屬于NMTs，可以催化-3和（或）-1甲基化反應(yīng)。Kato等[14]和YONEYAMA等[15]分別克隆到一個（和）的cDNA全長，并通過原核表達發(fā)現(xiàn)TCS1具有催化-3和-1甲基化的活性，而TCS2不具有NMT活性。金基強等[16]克隆了6條茶樹咖啡堿合成酶的基因組全長（—），其中為假基因，而、、在嫩葉中表達量很低。以上研究均表明TCS1是催化茶樹咖啡堿生物合成后兩步甲基化的關(guān)鍵酶。JIN等[17]發(fā)現(xiàn)在茶組（Sect.）植物中具有多個等位變異，根據(jù)5′上游調(diào)控區(qū)域的插入/缺失突變在茶組植物中鑒定到6個等位變異（），并克隆了這6個等位變異的cDNA全長，其中、、分別與NCBI上已登錄的、（來源于滇緬茶，）和（來源于毛葉茶）的序列一致，蛋白重組試驗發(fā)現(xiàn)TCS1d、TCS1e、TCS1f與TCS1a（TCS1）都具有催化-3和-1甲基化的活性，而YONEYAMA等[15]研究發(fā)現(xiàn)ICS1（TCS1b）和PCS1（TCS1c）僅具有催化-3甲基化反應(yīng)的功能。具有多個等位變異是由茶樹咖啡堿合成酶基因的獨立進化和近期的快速演化機制導(dǎo)致[18-21]。也正是由于序列變異多樣，導(dǎo)致了我國茶樹資源嘌呤生物堿具有不同的分布模式：多數(shù)資源以咖啡堿為主（2.5%—4.5%）[16]，少數(shù)資源以可可堿[22-24]或茶葉堿[25]為優(yōu)勢組分?！颈狙芯壳腥朦c】是茶樹咖啡堿合成的關(guān)鍵基因，具有豐富的等位變異，以往研究主要對茶種植物中含有的等位變異進行了篩選，但對茶樹近源植物（多為野生茶樹資源）篩選較少，因此有必要對更多的茶樹近源植物進行鑒定，發(fā)掘新的稀有等位變異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過進一步篩選我國茶樹資源，從而確定是否還存在新的稀有等位變異；克隆新的稀有等位變異的基因序列，研究其序列特征和蛋白活性，進一步解析茶樹咖啡堿合成的機制，為低咖啡堿茶樹育種尋找新的優(yōu)異等位基因。

（1）7-甲基黃嘌呤核苷合成酶（黃嘌呤核苷N-甲基轉(zhuǎn)移酶）；（2）N-甲基核苷酶；（3）可可堿合成酶（單甲基黃嘌呤N-甲基轉(zhuǎn)移酶）：TCS1b（ICS1）、TCS1c（PCS1）；（4）咖啡堿合成酶（二甲基黃嘌呤N-甲基轉(zhuǎn)移酶）；（3-4）雙功能咖啡堿合成酶：TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f。SAM：S-腺苷-L-甲硫氨酸；SAH：S-腺苷-L-高半胱氨酸；Ribose：核糖。圖片參考文獻[10-12]

1 材料與方法

試驗于2016—2018年在中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所進行。

1.1 試驗材料

以國家種質(zhì)杭州茶樹圃采集的200份（多為地方品種和野生茶樹資源）和云南采集的473份茶樹資源（來源于臨滄古茶樹群體：野生、栽培大理茶，阿薩姆茶var.及其中間過渡型茶樹）為試驗材料，取一芽二葉新梢，迅速液氮固樣，并置于-80℃保存，待基因組DNA的提??；另采摘龍井43（LJ43，）、廣東可可茶（CCT，）和龍陵17（LL17，）春季第一輪一芽二葉新梢，一部分迅速液氮固樣，并置于-80℃保存，用于總RNA的提??；另一部分采用120℃熱風干燥5 min，75℃烘干，作為生化成分測定的樣品。

1.2 TCS1稀有等位變異的篩選

利用DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒（DP320-03，天根生化科技）進行茶樹基因組DNA的提取，提取完畢后所有DNA均稀釋至50 ng·μL-1。利用特異引物TCS1P InDel F/R（表1），對提取的基因組DNA進行PCR擴增，擴增結(jié)束后在2.5%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。擴增區(qū)域為起始密碼子ATG上游303 bp與第一外顯子67 bp處。

1.3 生化成分測定

采用高效液相色譜法（high performance liquidchromatography，HPLC）測定生化樣中生物堿含量，各樣品均獨立重復(fù)3次。待測樣品的前處理參照GB/T 8313—2018[26]，液相色譜測定條件參照金基強等[16]的測定方法。用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

1.4 總RNA的提取、cDNA的合成和TCS1等位變異cDNA全長的克隆

茶樹總RNA的提取采用RNA快速提取試劑盒（RN5301，北京艾德萊生物科技），并利用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（Kr116-02，天根生化科技）進行第一鏈cDNA的合成。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，獲取目的基因。參考JIN等[17]研究設(shè)計PCR擴增的引物TCS1cDNAF/R（表1）。

1.5 蛋白活性測定

表達載體pMAL-c5x和目標基因（添加酶切位點的引物TCS1gF/R見表1）同時進行雙酶切，酶切成功后進行重組連接、鑒定，以構(gòu)建蛋白活性測定的表達載體。將成功構(gòu)建的表達載體和pMAL-c5x空載體分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌株BL21(DE3) pLysS（CD701-03，全式金）的感受態(tài)細胞并進行陽性驗證。

陽性菌擴大培養(yǎng)到250 mL，然后利用IPTG（終濃度0.5 mmol?L-1）誘導(dǎo)蛋白表達：37℃，120 r/min，誘導(dǎo)4 h。蛋白純化和蛋白活性檢測參考JIN等[17]的方法進行，其中細胞破碎功率改為277 W。蛋白定量采用Bradford法進行（DQ101-01，全式金），每個樣品均獨立重復(fù)測定3次。

1.6 實時熒光定量PCR

以茶樹作為內(nèi)參基因（引物序列見表1）。其中TCS1-CS、TCS1-TS和TCS1-Total分別是研究表達蛋白同時具有可可堿和咖啡堿合成酶（caffeine synthase，CS）活性等位變異、表達蛋白僅具有可可堿合成酶（theobromine synthase，TS）活性等位變異和整體表達水平的引物。

Real-Time PCR反應(yīng)使用定量試劑盒（KK4601，Kapa Biosystems），反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，40個循環(huán)；60—95℃分析溶解曲線。應(yīng)用ABI sequence detection system（Applied Biosystems，USA）進行檢測，每個樣品做3個生物學重復(fù)。

表1 試驗引物及其序列

下劃線表示酶切位點 The underlines are restriction enzyme cutting sites

1.7 序列分析

利用DNAMAN軟件包對序列進行拼接；EXPASY（http://expasy.org/tools/）中的ProtParam工具對氨基酸序列進行基本的生物信息學分析；SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）對蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用ClustalW進行序列比對，EXPASY中的BoxShade輸出同源比對的結(jié)果；MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，選用Neighbor-joining法，Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000；EXPASY中的SWISS-MODEL進行蛋白建模，并用Swiss-PdbViewer[27]進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 TCS1等位變異的篩選

利用特異引物TCS1P InDel F/R擴增673份茶樹資源中等位變異的5′上游調(diào)控區(qū)域（目標片段長度為368 bp），從部分大理茶（）資源中擴增出一條620 bp左右的特異條帶，通過測序驗證，該條帶大小為617 bp。序列比對（圖2）顯示該片段與已往鑒定的序列差異明顯，長度長95—347 bp，相似度在52.3%—94.6%，因此將具有該片段的稀有等位變異命名為。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)、、的起始密碼子“ATG”均比和、、延后15 bp（圖2）。

2.2 TCS1gcDNA全長的克隆

通過等位變異的鑒定發(fā)現(xiàn)，具有這一等位變異的茶樹資源，同時還含有一個或多個其他類型的等位變異，為了更好地研究的功能，本研究選擇具有常規(guī)等位變異和特異等位變異的大理茶資源LL17為試驗材料。從LL17總cDNA中獲得了的全長cDNA序列，編碼區(qū)長度為1 098 bp，編碼365個氨基酸，生物信息學分析結(jié)果顯示TCS1g分子量為40.9 kD，理論等電點為5.1，酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）有50個，堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）有33個，其中含量最高的3種氨基酸是：亮氨酸（10.7%）、谷氨酸（8.8%）和絲氨酸（8.8%）。

與—的核酸序列相似度在94.1%—99.2%，與TCS1a—TCS1f的蛋白序列的相似度均大于90%，其中與具有TS活性的TCS1b、TCS1c相似度都大于96%（表2）。與咖啡中現(xiàn)已克?。∟CBI登陸）的編碼區(qū)序列的相似性在29.3%—39.8%，與可可中分離的具有可可堿合成酶功能的（AB096699）[15]的序列相似度為55.0%。利用茶樹、可可和咖啡中的cDNA序列進行系統(tǒng)發(fā)生樹分析（圖3），發(fā)現(xiàn)不同物種的獨立成簇，茶樹中的不同等位變異聚為兩類，Ⅰ類包括新克隆的和表達蛋白僅具有可可堿合成酶活性的、，Ⅱ類包括、、、。

對已經(jīng)克隆的—和新克隆的的氨基酸序列進行序列比對（圖4），結(jié)果顯示TCS1g與TCS1的其他等位變異一樣，都具有編碼蛋白的3個SAM結(jié)合域A、B和C以及一個保守域YFFF[17,28-29]。另外，TCS1b、TCS1c、TCS1g相比于TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f還有13個氨基酸殘基的變異（圖4）。TCS1g蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：47.4%為α-螺旋、13.2%為延伸鏈、4.9%為β-轉(zhuǎn)角、34.5%為無規(guī)則卷曲；通過同源建模的方式對TCS1g進行了蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模擬（圖5），綠色和紅色分別標注是TCS1g與甲基受體和甲基供體結(jié)合的氨基酸殘基。

圖2 TCS1g與TCS1其他6個等位變異5′上游調(diào)控區(qū)域的多序列比對

空心圓、空心正方形和空心三角分別標注山茶屬、咖啡屬和可可屬的N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因。TCS1g加粗突顯

表2 TCS1g與TCS1其他6個等位變異編碼區(qū)核酸序列（矩陣的上半部分）和蛋白序列（矩陣的下半部分）的相似性（%）比較

SAM的結(jié)合域A、B和C以及一個保守域YFFF用紅框標出[15,28-29]。與底物特異性結(jié)合的關(guān)鍵位點用籃框標出[15,17,30]。TCS1b、TCS1c、TCS1g相比于TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f的變異位點用棕黃色三角標出

2.3 TCS1g編碼蛋白活性的測定

在甲基供體SAM存在下，將重組酶制劑與底物7-甲基黃嘌呤或可可堿一起27℃孵育1 h后，通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，以7-甲基黃嘌呤為底物的反應(yīng)有可可堿的生成，以可可堿為底物的反應(yīng)中未檢測到有咖啡堿生成，說明TCS1g與TCS1b、TCS1c功能相似，都只有TS活性，不具有CS活性。測定結(jié)果（表3）顯示，TCS1g的TS活性為44.3 pkat/mg，約為對照TCS1c的2.5倍，但小于對照TCS1a的TS活性。

2.4 TCS1g的表達水平分析

實時熒光定量PCR結(jié)果（圖6）顯示，LL17（具有和兩種等位變異）中整體表達水平比LJ43低58.0%，比CCT高1.8倍。為了明確的表達水平，設(shè)計了引物TCS1-TS和TCS1-CS，來區(qū)分LL17中功能不同的和的表達水平，引物TCS1-TS用于檢測表達蛋白僅具有TS活性的基因：、，TCS1-CS用于檢測表達蛋白同時具有TS和CS活性的基因：。以僅具有等位變異的LJ43和僅具有的CCT分別作為引物TCS1-TS和TCS1-CS的陰性對照，圖6表明，使用TCS1-TS檢測LJ43和TCS1-CS檢測CCT時，表達水平均極低，說明設(shè)計的引物特異性高，能區(qū)分兩種不同功能的等位變異。定量結(jié)果（圖6）表明，LL17中（TCS1-TS檢測結(jié)果）有表達，但表達水平較低：只有對照CCT中表達量的34.5%，另外LL17中（TCS1-CS檢測結(jié)果）的表達也較低，為對照LJ43中的41.6%。

表3 TCS1g重組蛋白活性分析

TCS1a[17]和TCS1c[31]的酶活性結(jié)果來自以往發(fā)表文獻。ND表示未檢出。下同

TCS1a[17]and TCS1c[31]were taken from reference. ND, not detected. The same as below

黃色氨基酸殘基為139—287區(qū)間TCS1b、TCS1c、TCS1g與TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f不同的氨基酸殘基。綠色和紅色分別標注是與甲基受體和甲基供體結(jié)合的氨基酸殘基

2.5 具有TCS1g茶樹資源LL17生物堿的含量

為了明確具有等位變異的大理茶資源LL17（含有和兩個等位變異）生物堿含量，本研究通過HPLC法進行了測定（表4），可可堿和咖啡堿的含量分別為5.4 mg·g-1和40.3 mg·g-1。

TCS1-CS，TCS1-TS和TCS1-Total分別表示表達蛋白同時具有可可堿和咖啡堿合成酶活性的等位變異、表達蛋白僅具有可可堿合成酶活性的等位變異和整體TCS1的表達水平

雖然LL17具有可可堿合成酶基因，但是其生物堿分布模式與僅具有可可堿合成酶基因的CCT（高可可堿、無咖啡堿）不同，而是與僅具有的LJ43（可可堿和咖啡堿的含量分別為1.8 mg·g-1和31.2 mg·g-1）相似。編碼的蛋白能將大部分可可堿轉(zhuǎn)化生成咖啡堿，從而導(dǎo)致具有的茶樹資源沒有大量可可堿的積累，LL17具有這一等位基因，所以LL17沒能像CCT（只具有可可堿合成酶基因）那樣積累大量的可可堿。

表4 含等位變異TCS1g的茶樹資源LL17嘌呤生物堿的含量

3 討論

3.1 TCS1具有豐富的等位變異

本研究通過對673份茶樹資源進行篩選，鑒定到一個新的等位變異。與JIN等[17]克隆的、、、、、的氨基酸序列相似度均大于90%，核酸序列相似度均大于94%（表2），與茶樹中其他的相似度也都大于91%，而與咖啡中家族的基因序列的相似度均低于40%，與可可中分離的具有可可堿合成酶功能的的序列相似度約55%。以NCBI中已登錄的茶樹、咖啡和可可中的的cDNA序列構(gòu)建進化樹，結(jié)果表明不同物種的獨立成簇，而不是不同屬中相同功能的聚在一起。新克隆的具有可可堿合成酶功能的也同樣與茶樹中的聚在一起，這一新的聚類分析與前人[18-21,32]的結(jié)果相符，表明不同植物中咖啡堿的生物合成是獨立進化形成的。茶樹的獨立和近期快速的進化機制[20]導(dǎo)致了具有豐富的等位變異，本研究的發(fā)現(xiàn)也進一步表明了等位變異極其豐富。也正是由于序列變異多樣，導(dǎo)致TCS1酶活性多樣，從而形成了我國茶樹資源嘌呤生物堿具有不同的分布模式。

3.2 TCS1g編碼蛋白無咖啡堿合成酶活性的重要位點

氨基酸序列比對結(jié)果顯示，TCS1g的蛋白序列與TCS1b和TCS1c的相似性程度都大于96%，并且、、明顯聚為Ⅰ類（圖3），即TS類[17]（表達蛋白僅具有可可堿合成酶活性）。本研究原核表達蛋白的結(jié)果也表明TCS1g僅具有催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿的功能，不具有催化可可堿生成咖啡堿的功能，這與聚類結(jié)果相符；另外，、、、屬于Ⅱ類，即CS類（表達蛋白具有可可堿和咖啡堿合成酶活性）。TS類編碼的氨基酸序列相比于CS類的TCS1a、TCS1d、TCS1e（氮端缺少一個蘇氨酸殘基）、TCS1f的氮端缺少一個“ELATA”序列；此外，TS類編碼的氨基酸序列還有多個殘基的變異。YONEYAMA等[15]通過構(gòu)建雜交酶（TCS1a和TCS1c）發(fā)現(xiàn)決定TCS1蛋白底物結(jié)合特異性的區(qū)域是139—287這一段氨基酸殘基，說明這一區(qū)域僅有的4個氨基酸殘基（188、221、230和263位）的變異決定了TS類與CS類底物特異性。

分析發(fā)現(xiàn)188位的賴氨酸（Lys）-精氨酸（Arg）、230位的谷氨酸（Glu）-天冬氨酸（Asp）和263位的纈氨酸（Val）-異亮氨酸（Ile）這3個位點的變異均是同性質(zhì)氨基酸殘基的變異，對蛋白的等電點和親水性影響很小。另外，通過同源建模發(fā)現(xiàn)，這3個突變位點的氨基酸殘基都位于蛋白的外側(cè)，距離酶活性中心較遠，因此，推測其對蛋白結(jié)構(gòu)和功能影響不大。221位的組氨酸（His）突變?yōu)锳rg導(dǎo)致編碼蛋白的等電點（5.05變?yōu)?.06）和親水性（-0.119變?yōu)?0.123）都發(fā)生改變，圖5顯示221位氨基酸殘基位于酶活性的中心，以往研究指出221位的His突變?yōu)锳rg會改變酶與底物結(jié)合的位阻[17]。另外，YONEYAMA等[15]通過定點突變發(fā)現(xiàn)僅具有TS活性的TCS1c第221位氨基酸殘基（對應(yīng)于TCS1a的第225位氨基酸殘基的位置）由His突變?yōu)锳rg后，TCS1c不僅具有TS活性，還具有CS活性；李萌萌等[32]研究發(fā)現(xiàn)當?shù)?25位的Arg突變?yōu)镠is，TCS1a則不再具有CS活性。綜上所述，茶樹編碼蛋白的第221位氨基酸殘基（對應(yīng)于TCS1a的第225位氨基酸殘基的位置）的突變將直接決定其是否具有CS活性。本研究克隆得到的編碼蛋白的第221位氨基酸殘基也為His（對應(yīng)于TCS1a的第225位氨基酸殘基的位置），并且僅具有TS活性，所以根據(jù)以上分析，可以推斷第221位氨基酸殘基是導(dǎo)致TCS1g僅具有TS活性（不具有CS活性）的關(guān)鍵位點，其他位點的變異可能對蛋白活性的高低有影響。

3.3 TCS1稀有等位變異在低咖啡堿茶樹育種中的作用

利用特異引物TCS1P InDel F/R鑒定了673份茶樹資源具有的等位變異，發(fā)現(xiàn)這些茶樹資源中大多數(shù)都含有這一等位變異，而—以及類型的稀有等位變異只存在于個別的茶樹資源中。常規(guī)茶樹資源中的表達蛋白能將茶樹中的大部分可可堿轉(zhuǎn)化生成咖啡堿，這也是多數(shù)茶樹資源咖啡堿較高含量[17]的主要原因，所以在茶樹資源中很難直接篩選得到低咖啡堿植株，并且也很難利用常規(guī)的茶樹資源通過雜交育種的方式育成低（無）咖啡堿茶樹品種。另外，有報道通過理化方法降低茶葉中咖啡堿的含量[33]，但是這種方法生產(chǎn)的茶葉風味會發(fā)生變化，并且生產(chǎn)成本較高[34]。因此，利用特異的茶樹資源作為親本進行雜交育種是快速選育出綜合性狀優(yōu)良、低咖啡堿含量茶樹新品種的有效方法。

筆者課題組前期開發(fā)了有效的InDel標記，可以對茶樹資源具有的等位基因進行鑒定。JIN等[17]利用該標記發(fā)現(xiàn)具有多個等位變異（、、、、、），筆者通過進一步的鑒定又獲得了一個新的等位變異。其中只具有TS活性的等位變異（、、）和具有低轉(zhuǎn)錄水平的等位變異（）均是低咖啡堿茶樹育種可利用的優(yōu)異等位變異，具有這些有利等位變異的茶樹資源是低咖啡堿茶樹育種的優(yōu)異茶樹資源。本研究篩選到的多份茶樹資源都可以作為以后低咖啡堿雜交育種的親本。

4 結(jié)論

獲得了一個新的茶樹稀有等位變異的全長cDNA，其編碼蛋白的分子量為40.9 kD，理論等電點為5.1，具有催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿的能力，未檢測到催化可可堿生成咖啡堿的活性，TS活性大小為44.3 pkat/mg；TCS1g與TCS1b、TCS1c的序列相似度均大于96%，都屬于TS類；推測第221位氨基酸殘基是導(dǎo)致TCS1g僅具有TS活性（不具有CS活性）的關(guān)鍵性位點。

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（責任編輯 趙伶俐）

Screening, Cloning and Functional Research of the Rare Allelic Variation of Caffeine Synthase Gene () in Tea Plants

LIU YuFei1,2, JIN JiQiang1, YAO MingZhe1, CHEN Liang1

(1Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008;2Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【Objective】Tea caffeine synthase 1 (TCS1), a key enzyme in the caffeine biosynthesis pathway, shows a wide range of allelic variation withinsect.germplasm. Discovery of the specific alleles ofas the genetic basis of natural variation in caffeine levels will increase the understanding of the mechanism of caffeine synthesis and accumulation, and provide new genetic resources for improving caffeine content in tea plant. 【Method】An unique PCR primer set, namely TCS1P InDel F/R, was used to detectalleles in 673 accessions of tea germplasm. The primer set (TCS1cDNAF/R) was used to clone the full-length cDNA sequence of novelallele, whose function was subsequently validated by bioinformatics quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and prokaryotic expression analysis. 【Result】The novel rare allele,, was identified in the several germplasm of. Thesequence was obtained by using the accession ‘LL17’, which contained bothand. The CDS ofwas 1098 bp, encoding 365 amino acids with a calculated molecular weight of 40.9 kD and a theoretical isoelectric point 5.1. The sequence similarities betweenand,,,,e,ranged from 94.1% to 99.2%. The TCS1g showed a high level (>96%) of amino acid sequence identity with the alleles (and) which had only theobromine synthase (TS) activity, while it was slightly lower for other alleles (,,and) having both TS and caffeine synthase (CS) activity. The amino acid residue in position 221, located at the active center motif of TCS1, was histidine (His) in the TCS1g, as well as TCS1b and TCS1c, however it was arginine (Arg) for the others. The mutation (His to Arg) would change the isoelectric point and hydrophilicity from 5.05 to 5.06, and from -0.119 to -0.123, respectively. Meanwhile, the 5' upstream regulatory region of TCS1g, TCS1b and TCS1c was 15 bp longer than that of TCS1a, TCS1d, TCS1e and TCS1f. The results of prokaryotic expression analysis indicated that TCS1g had only TS activity (44.3 pkat/mg), and qRT-PCR analysis showed thewas expressed in the ‘LL17’. The contents of caffeine and theobromine in the ‘LL17’ were 40.3 mg·g-1and 5.4 mg·g-1, respectively. 【Conclusion】A novel rare allele of() was cloned, and the expression was detected in the ‘LL17’. TCS1g had TS activity, but no CS activity, which might be caused by the change of amino acid residue in position 221.

allelic variation; caffeine synthase; functional analysis; purine alkaloids; tea plant

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.10.010

2018-12-04；

2019-02-25

國家自然科學基金（31670685）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（CAASASTIP-2017-TRICAAS）

劉玉飛，Tel：18737616921；E-mail：chaye18@163.com。通信作者姚明哲，Tel：13588718222；E-mail：yaomz@tricaas.com。通信作者陳亮，Tel：13958093541；E-mail：liangchen@tricaas.com