SMAD1基因的沉默和過表達及對秦川牛原代成肌細胞生肌的影響

寧越，米雪，陳星伊，邵建航，昝林森,2

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SMAD1基因的沉默和過表達及對秦川牛原代成肌細胞生肌的影響

寧越1，米雪1，陳星伊1，邵建航1，昝林森1,2

（1西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2國家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100）

【目的】為了探索秦川牛（）SMAD1基因在成肌細胞分化過程中的分子作用機制，通過研究沉默、過表達該基因后對牛原代成肌細胞分化及成肌相關基因表達量的影響，以期為BMP信號通路在牛肌肉組織生長發(fā)育過程中的作用機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)Genbank牛（NM_001077107.2）已知序列設計并合成靶向沉默SMAD1基因的干擾序列si和陰性對照siRNA-NC。以秦川牛原代成肌細胞cDNA為模板，利用PCR技術克隆獲得SMAD1基因CDS序列，構建腺病毒過表達穿梭載體pDC316-mCMV-EGFP-b。將腺病毒基因組質粒和腺病毒載體穿梭質粒共轉染到HEK 293細胞中，通過Cre-loxp重組酶獲得重組腺病毒。獲得的攜帶目的基因的腺病毒標記為AD-b，重組質粒pDC316-EGFP標記為AD-NC，用做對照組病毒，利用LaSRT法測定腺病毒的滴度。將獲得的干擾序列si和過表達腺病毒AD-b分別侵染秦川牛原代成肌細胞，采用實時熒光定量PCR檢測SMAD1基因和成肌標志基因、、的mRNA水平，并觀察對細胞分化融合情況的影響?！窘Y果】成功獲得了1條能有效沉默SMAD1基因siRNA，將其轉染秦川牛原代成肌細胞后進行人工誘導分化，相比對照組，SMAD1基因分別下調了75.4%（誘導1d，<0.01）、66.7%（誘導3d，<0.01）、60.0%（誘導6d，<0.01）、54.7%（誘導9d，<0.01）。此外，還成功構建了秦川牛SMAD1基因的腺病毒過表達穿梭載體，獲得了滴度為1×1010pfu/mL的過表達重組腺病毒AD-b。與對照組相比，高滴度過表達病毒AD-b侵染秦川牛原代成肌細胞0、1、3、6、9d后，與對照組相比，SMAD1基因的表達水平分別上調了2.10倍（誘導1d）、3.19倍（誘導3d）、105.3倍（誘導3d），<0.01）和144倍（誘導9d，<0.01）；結合肌管形成過程的變化和實時熒光定量結果證明，SMAD1基因促進原代成肌細胞分化和肌管形成，并顯著上調成肌標志基因、、的表達。【結論】獲得了能有效沉默秦川牛原代成肌細胞表達的特異性的干擾序列si，以及可成功實現(xiàn)過表達SMAD1基因的腺病毒介導的體外表達載體，可正向調控成肌細胞的分化和肌管形成過程。

SMAD1基因；RNAi；腺病毒載體；原代成肌細胞；肌管形成；秦川牛

0 引言

【研究意義】秦川牛（）是我國著名的地方黃牛品種，具有耐粗飼、抗逆性（?。┖谩⑷赓|好的優(yōu)點，但仍存在生長慢、產肉量低且脂肪沉積欠佳等缺點[1]。隨著人們生活水平的不斷提高，牛肉供應緊缺，提高牛肉的產量、質量成為當務之急[2-4]?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，骨骼肌生長和肌內脂肪含量對畜禽的產肉性能和肉質有著至關重要的影響。TGF-β（transforming growth factor-β）信號通路主要參與調節(jié)細胞生長、增殖、分化、遷移和凋亡，可介導組織與器官的正常生長和發(fā)育（胚胎發(fā)育、骨骼器官形成）、機體的免疫反應等生物過程，其在抑制脂肪細胞和成肌細胞分化中的作用十分重要[5-6]。SMAD蛋白家族作為細胞內重要的信號轉導蛋白，直接參加與TGF-β超家族成員TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）、活化素等多個成員的信號轉導[7]。目前，共有8種SMAD成員被報道（SMAD1-8），按照結構和功能可分為3類[8-10]。第一類，特異性SMADs（亦稱receptor- activated SMAD，R-SMADs），包括SMAD1、2、3、5、8，其中SMAD1、5、8能被BMP-Ⅰ型受體（ALK1、2、3、6）磷酸化而激活，參與BMP信號通路；而SMAD2、3能被活化素或者TGFβ-Ⅰ型受體（ALK4、5）和孤兒Ⅰ型受體（ALK7）激活，作為TGF-β信號通路的直接作用底物，可對成肌因子及成肌分化過程起關鍵作用。第二類，共有型SMADs（common SMAD, C-SMAD），即SMAD4，它能與激活的R-SMADs形成異源的多聚復合物，轉錄到細胞核內調控下游基因。第三類，抑制型SMADs（Ⅰ-SMADs），包括SMAD6、7，它們能抑制R-SMADs和C-SMAD復合物的活性。【本研究切入點】BMP信號通路作為調控骨/軟骨形態(tài)發(fā)生的重要通路而被熟知。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SMAD1/5/8通過參與BMP信號通路對調控肌肉量有著十分重要的作用[11]。試驗發(fā)現(xiàn)，在鼠的骨骼肌細胞細胞核中定位到SMAD1、SMAD5、SMAD8蛋白，并且通過成年在鼠骨骼肌細胞中敲除SMAD1/5/8基因兩周后，觀察到其肌肉量減少了20%。此外，還有試驗證實，BMP-SMAD1/5/8通路可通過與activin/ myostatin–SMAD2/3通路競爭SMAD4從而促進肌肉量及成肌分化過程[12]?！緮M解決的關鍵問題】鑒于SMAD1基因的重要功能，本試驗以秦川牛背最長肌組織為試驗材料，克隆秦川牛SMAD1基因，設計合成了RNA干擾序列、構建了腺病毒過表達載體，獲得了具有干擾能力的RNA序列si和對有過表達能力的腺病毒AD-b，研究其在秦川牛成肌細胞分化過程中的調控作用，為進一步研究該基因和BMP信號通路在秦川牛肌肉組織生長發(fā)育過程中發(fā)揮的作用奠定基礎。

1 材料與方法

本研究于2016年9月至2018年4月在西北農林科技大學國家肉牛改良中心完成。

1.1 試驗材料

秦川牛第1代原代成肌細胞[13]、背最長肌組織（第12—13肋骨間）均凍存于西北農林科技大學國家肉牛改良中心種質資源庫。所用試劑有：pDC316-mCMV- EGFP載體質粒、JM109感受態(tài)細胞、Polyfectine轉染試劑均購自百恩維生物科技有限公司（中國，深圳）；DNA Polymerase、質粒小提試劑盒、Trans2K Plus II DNA Marker購自全式金生物技術有限公司（中國，北京）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Endo-free Plasmid Kit購自Omega Bio-tek股份有限公司（美國）；T4 DNA 連接酶、限制性內切酶I、I購自NEB有限公司（中國，北京）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）、胰蛋白酶Trypsin 0.25% EDTA、Lipofectamine? 3000購自Invitrogen公司（美國）；青鏈霉素雙抗購自Gibco（美國）；腺病毒純化試劑盒ViraBind購于Cell Biolabs公司（美國）；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with DNA Eraser反轉錄試劑盒、SYBR? Primix ExTMⅡ試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術有限公司（中國，北京）。

1.2 生物信息學分析

登錄NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載包括牛（）等9種動物的SMAD1氨基酸序列（表1）。利用DNAMan 6.0軟件進行蛋白序列多重比對。

表1 9種物種SMAD1氨基酸序列信息

1.3 誘導分化秦川牛原代成肌細胞

復蘇第1代的秦川牛原代成肌細胞，差速貼壁兩次后進行傳代培養(yǎng)至第3代，將細胞按2×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，使用未誘導分化培養(yǎng)基（20%FBS+DMEM/F12）培養(yǎng)。待細胞融合率達到80%后用含2%HS的分化培養(yǎng)基進行誘導分化培養(yǎng)，隔日換液。

1.4 沉默秦川牛SMAD1基因

1.4.1 設計并合成siRNA 按照siRNA設計原則，以Genbank上牛SMAD1基因mRNA序列（NM_ 001077107.2），應用Invitrogen公司在線設計工具（https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）設計1條靶向沉默SMAD1基因的siRNA前體寡核苷酸序列和1條陰性對照序列（表2）。

表2 siRNA序列

1.5 過表達牛SMAD1基因

1.5.1 構建秦川牛SMAD1基因腺病毒過表達載體 用Primer 5.0軟件根據(jù)牛SMAD1基因mRNA序列設計特異性引物（表3），并在引物中引入酶切位點I和I。以原代成肌細胞cDNA為模板擴增CDS區(qū)序列，產物長1 452 bp。PCR體系為：含模板的DNA 100ng、正反向引物各4μL、dNTP Mix（2.5mmol·L-1）4μL、polymerase 1μL、5×buffer 10μL，用滅菌蒸餾水補足50μL。PCR擴增條件：95℃ 3 min；95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30 個循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR產物經雙酶切（I和I）回收后與pDC316-mCMV-EGFP真核表達載體大片段進行連接，22℃反應2h。反應體系為：目的片段6μL、pDC316-mCMV-EGFP大片段2μL、10×DNA Ligase Buffer 1μL、T4 DNA Ligase 1μL。將上述連接產物取10μL與100μL JM109感受態(tài)細胞均勻混合，冰浴30min后42℃熱激45s，再立即冰浴2min，加入預熱至室溫的400μL LB培養(yǎng)基后37℃搖床培養(yǎng)1h，以4 000r/min離心1min后棄去400μL培養(yǎng)上清，再用移液器將剩余100μL吹打混勻后涂布于LB平板上（氨芐抗性含100μg·mL-1），37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。次日挑取2個單克隆菌落并接種到5ml含氨芐抗性的LB培養(yǎng)液（氨芐濃度為100μg·mL-1）中，250r/min，37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜，用小量質粒抽提試劑盒抽提質粒，質粒經I和I雙酶切鑒定無誤后，送上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

表3 PCR引物序列

1.5.2 pDC316-mCMV-EGFP-b和對照腺病毒包裝 將293細胞接種在6孔板中培養(yǎng)，細胞匯合度達到70%—80%，用轉染試劑Polyfectine轉染質粒，具體步驟參照說明書進行。轉染后觀察出毒跡象，即細胞收縮變圓，伴有細胞脫落。在大部分細胞病變并從培養(yǎng)瓶壁脫落后，作為病毒母液P1進行收毒。

擴增病毒AD-b。擴增培養(yǎng)HEK 293細胞，當細胞達到80%—90%匯合度時加入P1代病毒AD-b。在病毒侵染48h后收集細胞，在-80℃/37℃下冷凍/解凍3次，離心（10 000×g，10min）收集病毒上清，標記為P2。用P2代病毒以相同方法擴增病毒至P3代，再通過腺病毒純化試劑盒對P3代病毒純化。

PCR鑒定目的基因。收集P2代病毒，在沸水孵育10分鐘后立即置于冰上。短暫離心后，取上清液作模板進行PCR反應。PCR鑒定條件與擴增目的基因相同。

1.5.3 病毒生物學滴度的測定 在滴度測定前一天將HEK 293細胞接種到48孔板中。用DMEM完全培養(yǎng)基10倍梯度稀釋病毒。具體做法如表4：在96孔板每孔中加入90μL培養(yǎng)基，向第一橫排孔中加入待測病毒原液各10μL，混勻后取10μL混合液轉至第二橫排孔，如此稀釋至第八橫排孔。取稀釋好的病毒混合液10μL加入相應的48孔板中。侵染48h后，通過熒光顯微鏡計數(shù)熒光細胞情況。在最高稀梯度m的孔數(shù)出N個帶熒光的細胞，則病毒滴度為N×10m/mL（m為稀釋梯度），若N>10，則需繼續(xù)稀釋。

表4 病毒濃度梯度

1.5.4 測定腺病毒侵染細胞最佳MOI值 復蘇實驗室保存的第1代秦川牛原代成肌細胞，傳代培養(yǎng)后，將細胞以1×104個/孔鋪板至兩個24孔培養(yǎng)板中。分別加入不同劑量的腺病毒（MOI分別為25、50、75、100、125和150），每個處理設置3個重復，48 h后根據(jù)細胞的生長情況及綠色熒光的表達情況來確定最佳的侵染濃度。

1.5.5 腺病毒侵染秦川牛原代成肌細胞復蘇第1代秦川牛原代成肌細胞，傳代培養(yǎng)到第3代時，將細胞以2×105個/ 孔鋪至6孔培養(yǎng)板中，使用增殖培養(yǎng)基（20%FBS+ DMEM/F12）培養(yǎng)。試驗共設計2個處理組，AD-b，AD-NC。當原代成肌細胞匯合度達到90%時，根據(jù)測定的MOI值加毒，12h后換成成肌細胞誘導分化培養(yǎng)基；侵染48h后，替換成分化培養(yǎng)基并隔天換液。在培養(yǎng)的第0、1、3、6、9天時收集細胞，提取總RNA并觀察細胞分化融合情況。

俄羅斯一黨制向多黨制的過渡始于1991年葉利欽上臺執(zhí)政，其頒布的使俄羅斯政府機關非黨化的總統(tǒng)令亦使黨的新體制于蘇共二十八大期間得以確立。多黨制、政治多元化則在1993年獲得通過的俄羅斯聯(lián)邦憲法中被進而確認。自此在俄羅斯，多黨制得以合法化。

1.6 細胞總RNA的提取及反轉錄PCR

用Trizol試劑提取處理第0、1、3、6、9天的成肌細胞總RNA，-80保存。用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計測定提取的細胞RNA的質量。將質量符合要求的RNA用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with DNA Eraser反轉錄試劑盒進行反轉，反應得到的cDNA第一鏈保存于-20℃冰箱。

1.7 實時熒光定量PCR 檢測

各取1μg RNA，用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA。用SYBR?Primix ExⅡ試劑盒進行實時定量PCR，反應體系為20 μL，其中SYBR?Primix ExⅡ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 6 μL。反應在7500 Real Time PCR儀（ABI公司）上進行，具體循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，循環(huán)40次。熔解曲線程序為： 95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個樣品進行3次試驗重復。以GAPDH基因為內參，檢測SMAD1基因及肌分化標志基因的表達。引物相關參數(shù)見表3。

1.8 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤（mean±SE）”表示，利用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析，用檢驗（-test）對不同試驗處理之間的差異進行顯著性分析，*＜0.05為差異顯著，**＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 物種間SMAD1蛋白質序列比對

對反芻動物、單胃動物等9種不同物種的蛋白質序列多重比較結果顯示：牛（）與山羊（）、綿羊（）、人（）、狗（）、豬（）SMAD1蛋白質序列的相似性極高，均為99%；與小鼠（）、大鼠（）、雞（）SMAD1蛋白質序列的相似性稍低，分別為98%、97%和96%。因此，不難看出SMAD1蛋白序列在各物種間十分保守（圖1）。

2.2 檢測沉默效率

提取si轉染牛原代成肌細胞第0、1、3、6、9天的細胞總RNA進行qRT-PCR。結果顯示，與對照組相比，在轉染si后，SMAD1基因分別被下調了75.4%、66.7%、60.0%、54.7%（＜0.01，圖2）。結果表明，通過RNA干擾技術可有效降低成肌細胞SMAD1基因的mRNA水平，且沉默效率至少可持續(xù)至第9天。

100%一致性氨基酸位點用白色背景標注，0%一致性的位點使用黑色背景標注，具體保守性在下方line圖中

圖2 siSMAD1干擾效率檢測

2.3 構建pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1腺病毒載體

以秦川牛成肌細胞cDNA為模板，利用PCR技術擴增SMAD1基因CDS區(qū)序列，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，條帶清晰且符合預期（圖3-A）。將PCR產物膠回收后克隆到pDC316-mCMV-EGEP載體上，構建pDC316-mCMV-EGFP-b腺病毒載體。質粒雙酶切（I和I）后經電泳鑒定，得到5 803bp和1 452bp兩條條帶，所得線性化質粒和目的片段大小符合預期（圖3-B），同時測序結果也顯示pDC316-mCMV-EGFP-b腺病毒載體構建成功。

2.4 包裝、擴繁pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1和對照腺病毒

共轉染攜帶目的基因的重組質粒pDC316- mCMV-EGFP-b和骨架質粒到HEK293細胞中，在倒置熒光顯微鏡下觀察到（圖4 A-C）：轉染1d后有大量綠色熒光蛋白（GFP）表達；9d后出現(xiàn)彗星狀的熒光聚集現(xiàn)象；在12—14d后大部分細胞病變并從培養(yǎng)瓶壁脫落，將其收集為病毒母液P1。為了獲得強侵染能力的病毒，通過反復“侵染-凍融-收集”對病毒AD-b進行大量擴繁[14]。圖4-D是第3代純化后的腺病毒侵染細胞48 h時GFP表達情況。腺病毒滴度采用LaSRT法測定為1×1010pfu/mL。

A：秦川牛SMAD1基因CDS區(qū)序列PCR產物；B：pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1質粒酶切鑒定結果。M1：DL2000 DNA marker；M2：Trans2K plus marker；泳道1,2為SMAD1基因在兩種成肌細胞cDNA中的PCR產物；泳道3為pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1的NheI和NotI雙酶切鑒定結果

A：轉染目的質粒到293細胞24h，GFP表達情況；B：轉染9天后，病變細胞開始出毒，綠色熒光呈現(xiàn)葡萄串樣的聚集現(xiàn)象；C：AD-bSMAD1轉染14d以及AD-NC轉染12d時，大部分細胞收縮變圓，開始從培養(yǎng)瓶壁脫落，將其收集為病毒母液P1；D：高滴度病毒（P3）侵染293細胞48h，GFP表達情況。原始放大倍數(shù)：40× (OLYMPUS IX71, 比例尺：200 μm)

2.5 測定腺病毒侵染細胞最佳MOI值

復蘇的秦川牛原代成肌細胞經培養(yǎng)后得到的第3代細胞，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)多呈短梭形或多角形，細胞核呈圓形或橢圓形。將其鋪至24孔培養(yǎng)板中，分別侵染不同劑量的腺病毒。48 h后在顯微鏡下觀察到AD-b，AD-NC的MOI值（multiplicity of infection, 侵染復數(shù)）分別為100和25時細胞GFP表達量較多且尚未出現(xiàn)明顯病變，因此確定此濃度為最佳侵染濃度。

2.6 檢測過表達效率

腺病毒AD-b侵染秦川牛前體成肌細胞第1、3、6、9天后，在熒光顯微鏡下觀察到95%以上的細胞可成功表達GFP。分別提取各時期細胞的總RNA，利用實時熒光定量PCR檢測SMAD1基因的表達水平，結果顯示SMAD1基因的表達量較對照組分別上調了約2.10倍（誘導1d）、3.19倍（誘導3d）、105.3倍（誘導6d，＜0.01）和144倍（誘導9d，＜0.01，圖5）。上述結果說明所包裝的過表達腺病毒可有效升高SMAD1基因的mRNA水平，且過表達效率可至少持續(xù)至第9天。

2.7 SMAD1基因促進秦川牛成肌細胞分化

顯微鏡觀察轉染si第6天的牛原代成肌細胞發(fā)現(xiàn)，處理組細胞的肌管形成過程較對照組明顯受損，所形成的肌管更小、更短、更少（圖6-A）。腺病毒AD-b侵染并誘導成肌細胞分化6天時，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，AD-b侵染組的細胞肌管的更大、更長、更多（圖6-B）。由實時熒光定量PCR結果知（圖6-C），與siRNA-NC相比，si處理組的肌分化標志基因，和的mRNA水平均顯著下降（＜0.01）。反之，與對照組AD-NC相比，AD-b組的成肌標志基因，和的mRNA水平均顯著升高（圖6-D，＜0.01）。以上結果表明，SMAD1基因能夠有效的正向調控秦川牛原代成肌細胞分化。

圖5 AD-bSMAD1過表達效率檢測

3 討論

大理石花紋作為衡量牛肉品質的重要指標，主要受到肌肉和脂肪含量的比例影響。一直以來，人們對BMP信號通路的研究主要集中在骨的形成發(fā)育過程上，但自2013年起，其在調控肌肉發(fā)育上的重要功能開始為人們了解。研究證明，BMP信號通路在調控成年后的肌肉量變化的重要作用主要是由SMAD1/5/8完成的[11-12]，且這條新的信號通路可以同廣泛存在的TGF-β通路的activin/myostatin– SMAD2/3軸競爭結合SMAD4。這種競爭作用，一方面可以降低activin/ myostatin–SMAD2/3的作用濃度，減少其對肌肉發(fā)育的抑制作用；另一方面可以增加BMP-SMAD1/5/8的優(yōu)勢作用。獲得優(yōu)勢的SMAD1/5/8磷酸化后可同SMAD4結合，進而將信號從細胞膜轉錄至細胞核內進而調控下游靶基因的轉錄，從而促進肌肉發(fā)育。

牛SMAD1基因定位在其17號染色體，編碼區(qū)長1 398個堿基，共編碼465個氨基酸。本試驗主要通過在秦川牛成肌細胞中下調、上調SMAD1基因表達量，觀察其對肌管融合過程及研究標志基因在肌生成過程中作用，從而研究該基因在成肌分化中的重要作用。與傳統(tǒng)的基因工程技術相比，RNA干擾（RNAi）是一種高效、穩(wěn)定、特異性強的干擾技術。因此本試驗首先設計并篩選到一條有效的siRNA。試驗發(fā)現(xiàn)，轉染可有效下調目的基因的表達量，在轉染后的第1、3、6、9天分別下調了75.4%、66.7%、60.0%、54.7%（＜0.01）。說明所合成的si可持續(xù)穩(wěn)定、高效得下調基因的mRNA水平，且該沉默水平可至少維持9d。另外，為了從另一角度研究基因功能，采取將外源基因導入真核細胞從而實現(xiàn)過表達目的基因以觀察相關生理過程的變化。與脂質體介導的化學試劑轉染法、電轉移、核轉移等物理方法相比，這種過表達方法能直接將目的基因插入到病毒基因組中，再利用病毒的侵染性實現(xiàn)目的基因在真核細胞內的過表達，最大程度的保護細胞保持良好狀態(tài)而不受損傷。20世紀中期，重組腺病毒載體作為一個新興的表達載體，開始應用于表達外源基因。與其他病毒載體系統(tǒng)相比，腺病毒載體系統(tǒng)可以有效地侵染原代細胞，并且可以侵染分裂期、非分裂期和增殖緩慢的細胞以及體內組織，更易獲得高滴度病毒、可攜帶大片段外源基因而不與宿主基因組整合等[15-19]。腺病毒載體的這些優(yōu)點使其成為細胞試驗最常用的病毒載體之一，也是基因表達和傳遞的主要候選載體[14, 20]。本試驗采用秦川牛原代成肌細胞所提的RNA進行反轉錄，以得到的cDNA為模板，在高保真酶的作用下成功克隆得到秦川牛SMAD1基因編碼區(qū)序列。為了更好地研究SMAD1基因在秦川牛肌肉的生長發(fā)育中的調控作用，本試驗選用Ad5腺病毒改造的AdMaxTM重組腺病毒包裝系統(tǒng)，而不是前期使用的AdEasyTMAdenoviral Vector System。前期使用的這種腺病毒包裝系統(tǒng)需要將目的基因線性化后轉染到含有骨架載體pAd-Easy-1的.BJ5183大腸桿菌感受態(tài)中，再在細菌中實現(xiàn)腺病毒的重組[21-22]。而本試驗采用的AdMaxTM系統(tǒng)是由Ad5腺病毒改建，不需要多次連接，可直接將共轉染到HEK293細胞中的腺病毒載體穿梭質粒和骨架質粒在重組酶的作用下產生重組腺病毒，病毒包裝不需要不斷傳代就可獲得高滴度和高侵染效率的腺病毒[14, 23]。包裝成功的病毒擴繁到第三代時滴度可達到1×1010pfu/mL。按MOI值（AD-b，AD-NC分別為100和25）侵染秦川牛原代成肌細胞第6和9天時，與對照組相比，SMAD1基因的表達水平顯著上調了105.3倍（＜0.01）和144倍（＜0.01）。由此獲得了可有效調控基因表達的工具，si和AD-b，為下一步研究SMAD1基因在成肌分化過程中的作用奠定了強有力的基礎。

A：轉染siSMAD1并誘導分化6天時牛原代成肌細胞分化融合情況；B：侵染腺病毒AD-bSMAD1并成肌誘導分化6天時秦川牛原代成肌細胞分化融合情況；C：沉默SMAD1后肌分化標志基因的mRNA水平檢測；D：過表達SMAD1后肌分化標志基因的mRNA水平檢測。原始放大倍數(shù)：40× (OLYMPUS IX71, 比例尺：200 μm)

骨骼肌分化是一類由多種信號通路和轉錄因子調控的復雜的級聯(lián)反應[24-26]。成肌因子能夠誘導肌肉干細胞的激活和終末分化，在成肌增殖和分化中發(fā)揮重要作用。在成肌發(fā)生的早期階段，甚至是在增殖的成肌細胞分化前，MyoD和Myf5作為成肌分化的早期決定因子首先被激活。MyoD在骨骼肌衛(wèi)星細胞的自我更新和增殖方面起到至關重要的作用[27]。已有研究表明，在肌衛(wèi)星細胞中缺失 MyoD，會使衛(wèi)星細胞更傾向于自我的更新交替，而不會進行細胞的融合形成肌管[28]。MyoD被激活后可進而調控下游成肌基因MyoG的表達，是在成肌終末分化期起決定性作用的轉錄因子，進而促進肌管的形成[29-32]。最新研究表明，SMAD1對成年后肌肉量的調控十分關鍵，但其具體的調控機制及在肌肉形成過程中的功能還不甚清楚。為了更好地研究SMAD1基因的作用機制，本試驗利用前期獲得的有效RNA干擾序列和高滴度腺病毒侵染秦川牛原代成肌細胞，通過對SMAD1基因mRNA水平表達量及細胞分化融合情況觀察，發(fā)現(xiàn)SMAD1基因的表達量在轉染si后的誘導分化1—9d內均極顯著低于對照組，但是誘導1—6d的干擾效率在60%以上，而第9天的干擾效率有所下降（為54.7%），此外，在誘導第6天時成肌細胞的分化過程已呈現(xiàn)出明顯的細胞表型（具體表現(xiàn)為肌管融合過程明顯受損，所形成的肌管更小更少更短）；而過表達SMAD1基因后其mRNA水平從細胞誘導分化的第六天開始顯著上調且超過100倍，對照組相比，所形成的肌管與更多、更長。因此，綜合干擾、過表達SMAD1基因后其mRNA水平和細胞表型的變化來看，誘導分化第6天都是一個很重要且有效的時間點，可以作為后續(xù)檢測標志基因的時間點。另外，實時熒光定量PCR結果證明，SMAD1基因可正向調控成肌基因、的表達。以上結果提示，很有可能參與了成肌分化的早期/終末期調控，是成肌分化的一個正向調控基因。而對、的準確調控機制仍需進一步探究。

4 結論

本研究成功篩選到靶向沉默秦川牛SMAD1基因的RNA干擾序列si，同時成功構建了秦川牛SMAD1基因過表達重組腺病毒載體。通過在秦川牛原代成肌細胞中沉默、過表達SMAD1基因，檢測相關標志基因的轉錄表達，證實SMAD1基因可正向調控原代成肌細胞分化。

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（責任編輯 林鑒非）

Silencing and Overexpressing SMAD Family Member 1 () Gene and Its Effect on Myogenesis in Primary Myoblast of Qinchuan Cattle ()

NING Yue1, MI Xue1, CHEN XingYi1, SHAO JianHang1, ZAN LinSen1,2

(1College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2National Beef Cattle Improvement Center, Yangling 712100, Shaanxi)

【Objective】The aims of the present study were to investigate molecular function ofgene in the bovine myoblast cell differentiation and to explore its role in the growth and development of Qinchuan cattle for beef production.【Method】SMAD1 gene was silenced and overexpressed through RNA interference and adenovirus recombinant over expression vector containingThe negative control siRNA-NC and RNA interference specific targeted SMAD1 gene (si) were designed and synthesized against the bovinemRNA sequence (CDS), which was obtained by RT-PCR using cDNA of Qinchuan cattle myoblast as template, and then, which was inserted into a shuttle vector pDC316-mCMV-EGFP to construct the over expression of adenovirus shuttle vector pDC316-mCMV-EGFP-b. Adenovirus genome plasmid and adenovirus shuttle vectors were cotransfected into HEK293 cell line to pack and obtain recombinant adenovirus. Adenovirus containing target gene was named as AD-b,whilepDC316-EGFP was used as a reference vector and was considered as control group "AD-NC". Their titers were tested by using LaSRT method. Bovine myoblast were transfected with siand AD-b, the mRNA level of SMAD1 gene and myogenesis-related genes, such as,and, were detected by real-time quantitative PCR, and the impact on myotube formation was observed. 【Result】The mRNA level of SMAD1gene transfected with siRNA was reduced 75.4% (induced differentiation for 1 day,<0.01), 66.7% (induced differentiation for 3 days,<0.01), 60.0% (induced differentiation for 6 days,<0.01), 54.7% (induced differentiation for 9 days,<0.01), respectively, compared with the siRNA-NC. The optimum titer of AD-binfectious was found at 1×1010pfu/mL. The expression levels ofwere rapidly increased 2.10 (induced differentiation for 1 day), 3.19 (induced differentiation for 3 days), 105.3 (induced differentiation for 6 days,<0.01) and 144 (induced differentiation for 9 days,<0.01) times of the control group after infected by AD-b, respectively. In addition, both myotube formation and qRT-PCR results proved that SMAD1 gene promoted myoblasts differentiation and myotube formation, as well as the mRNA expression level of,and. 【Conclusion】We could conclude from the present study thatSMAD1 gene performed its function in the myoblast differentiation and myotube formation. Based upon these findings, SMAD1 gene could be used as potential marker for the breed improvement of Qinchuan cattle through marker assisted selection for beef production.

mothers against decapentaplegic homolog 1 gene (); siRNA; adenovirus vector; primary myoblast; myotube formation; Qinchuan cattle

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.10.014

2018-12-06；

2019-02-26

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0501700）、國家肉牛牦牛產業(yè)技術體系（CARS-37）、陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃（2016KTCL02-15）

寧越，E-mail：ningyueny@163.com。通信作者昝林森，E-mail：zanlinsen@163.com