淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ通過(guò)BMP/Runx2/Osx信號(hào)通路促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究

訾慧 范穎 蔣寧 谷麗艷 董秀

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110847

骨質(zhì)疏松癥是一種增齡性病變，隨著人口老齡化，增齡導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥及其骨折的發(fā)病率逐年上升，并成為嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。中醫(yī)認(rèn)為“腎藏精生髓主骨”，腎主藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨。中醫(yī)認(rèn)為“腎藏精生髓主骨”，腎主藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨。腎中精氣旺盛則骨就強(qiáng)壯，否則反之。“腎精”也擔(dān)負(fù)成年組織修復(fù)的功能。如《靈樞·海論》云：“髓海有余，則輕勁多力；自過(guò)其度，髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無(wú)所見(jiàn)，懈怠安臥”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，干細(xì)胞是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，以骨髓組織中含量最為豐富。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一種多能間充質(zhì)干細(xì)胞，在一定條件下可以向成骨方向分化，可能受多種信號(hào)通路調(diào)控，其中BMP/Runx2/OSX信號(hào)通路是與骨形成密切相關(guān)的通路，能促進(jìn)成骨分化[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力與分化方向體現(xiàn)了骨髓的功能，因此認(rèn)為補(bǔ)“腎”可以提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力[2-3]。

淫羊藿為中醫(yī)臨床補(bǔ)腎壯骨常用藥材，淫羊藿苷為其主要有效成分，具有明顯的促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的活性[4-6]。淫羊藿苷口服給藥后，在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物如淫羊藿素、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷Ⅱ等，且原型藥物生物利用度較低[7]。賈曉斌等[8]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷經(jīng)口給藥發(fā)揮主要功效的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為其代謝產(chǎn)物，翟遠(yuǎn)坤等[9]曾報(bào)道淫羊藿苷的代謝產(chǎn)物具有強(qiáng)于其本身的生物活性。筆者[10]前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，淫羊藿次苷I與其原型藥物淫羊藿苷相比，有更好的促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的生理活性。本文通過(guò)體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞系統(tǒng)，研究淫羊藿次苷Ⅰ和淫羊藿次苷Ⅱ?qū)MP/Runx2/OSX信號(hào)通路的影響，探討其可能作用機(jī)制，同時(shí)比較兩者的作用強(qiáng)度，為開(kāi)發(fā)新藥和發(fā)掘中醫(yī)藥潛在價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，USA)；甘油磷酸鈉、磷酸化抗壞血酸(ASAP)、地塞米松、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自Sigma公司；MEM-α細(xì)胞培養(yǎng)液(GIBCO 12571-063)、堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)測(cè)定試劑盒(AE91640Ra，批號(hào)：201512)；骨鈣素(BGP)檢測(cè)試劑盒(AE90937Ra，批號(hào): 201512)；Ⅰ型膠原蛋白測(cè)定試劑盒(AE90739Ra，201512)；BMP-2測(cè)定試劑盒(AE90181Ra，201512)；NOGGIN重組蛋白(Peprotech公司，美國(guó))；β-甘油磷酸鈉和茜素紅(美國(guó)Sigma-Aldrich)；類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；RNAisoReagent、TaqDNA 聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EasyDilution 稀釋液均購(gòu)自TaAaRa 公司，引物由TaAaRa 公司設(shè)計(jì)合成。

藥品：淫羊藿次苷I(批號(hào)：121020)和淫羊藿次苷Ⅱ(批號(hào)：121117)均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司(純度大于98%)。

1.2 儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(THERMO FORMA 3110)、酶標(biāo)儀(BIO-TECK Synergy H1)；蛋白核酸分析儀(DU640，美國(guó)貝克曼)；低溫高速離心機(jī)(MR1822，法國(guó)Jouan SA)。

1.3 方法及檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及分組：大鼠BMSCs購(gòu)于廣州賽業(yè)有限公司，批號(hào)： 090405B01。采用胰蛋白酶消化法進(jìn)行大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代。

實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組：DMEM+10 mL/dL胎牛血清(含100 U/mL青、鏈霉素)，即基礎(chǔ)培養(yǎng)液；②陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組： DMEM +10 mL/dL胎牛血清(含 100 U/mL青、鏈霉素)+0.1 mol/L地塞米松+50μg/mL維生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，即成骨誘導(dǎo)液；③抑制劑組：成骨誘導(dǎo)液+1μg/mL Noggin；④淫羊藿次苷Ⅰ組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+淫羊藿次苷Ⅰ1×10-5mol/L；⑤抑制劑+淫羊藿次苷Ⅰ組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+淫羊藿次苷Ⅰ1×10-5mol/L+1μg/mL Noggin；⑥淫羊藿次苷Ⅱ組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+淫羊藿次苷Ⅱ1×10-5mol/L；⑦抑制劑+淫羊藿次苷Ⅱ組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+淫羊藿次苷Ⅱ1×10-5mol/L+1μg/mL Noggin。

1.3.2ALP 活性測(cè)定：采用ELISA法于成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)第6、9、12天檢測(cè)ALP水平。具體方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，顯色后于酶聯(lián)儀450 nm處測(cè)定光密度D(λ)值，空白調(diào)零，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的光密度值在回歸方程上計(jì)算對(duì)應(yīng)的樣品濃度以μg/L表示。

1.3.3礦化結(jié)節(jié)染色：將BMSCs 細(xì)胞接種后，使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，放置于5.0% CO2，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行上述各組藥物干預(yù)，誘導(dǎo)14 d 以后將待測(cè)孔的培養(yǎng)基吸出，用茜素紅染色方法染色，在倒置顯微鏡下觀察。

1.3.4測(cè)定蛋白表達(dá)量：BGP、Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)、BMP-2蛋白濃度。采用ELISA法于成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)第12天，檢測(cè)BGP、COL-Ⅰ、BMP-2含量，具體方法按試盒說(shuō)明進(jìn)行。用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸收度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的實(shí)際濃度以μg/L表示(按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。

1.3.5檢測(cè)基因表達(dá)量：藥物干預(yù)48 h，提取細(xì)胞RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因(ALP、BGP、Osterix、Runx2)表達(dá)量。RT-Real Time PCR 所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-Real Time PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences for real time RT-PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)ALP活性的影響

ELISA法檢測(cè)各組在第6、9、12天ALP的水平。與空白對(duì)照組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組細(xì)胞內(nèi)ALP水平均有升高(P<0.05)，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞裂解液中ALP水平逐漸上升，第12天達(dá)到最高水平，達(dá)到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組的80%以上。相應(yīng)抑制劑組，BMSCs ALP活性明顯降低。淫羊藿次苷Ⅰ組與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，ALP活性在第9、12天，前者明顯強(qiáng)于后者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

2.2 對(duì)細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響

礦化結(jié)節(jié)的出現(xiàn)是鑒定成骨細(xì)胞分化成熟的特征性標(biāo)志，典型的礦化結(jié)節(jié)呈紅褐色?？梢钥吹?，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組(B)的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目最多，連接成片，且體積較大；淫羊藿次苷Ⅰ組(C)和淫羊藿次苷Ⅱ組(D)的礦化結(jié)節(jié)均較空白對(duì)照組(A)多，且體積明顯增大，其中淫羊藿次苷Ⅰ組的礦化結(jié)節(jié)多于淫羊藿次苷Ⅱ組。抑制劑組(E)的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組，且體積偏小，礦化水平降低；淫羊藿次苷Ⅰ+抑制劑組(F)及淫羊藿次苷Ⅱ+抑制劑組(G)組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于相應(yīng)的淫羊藿次苷Ⅰ組及淫羊藿次苷Ⅱ組，且體積偏小，礦化水平降低。如圖1所示。

表2 各組內(nèi)第6、9、12 天的BMSCs ALP活性比較 Table 2 Comparison of ALP activity between each group on day 6, 9, and 12 after osteogenic induction

注：與空白對(duì)照組同期比較，★P<0.05；與相應(yīng)各組第6天比較，*P<0.05；與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組同期比較，△P<0.05；淫羊藿次苷Ⅰ組與淫羊藿次苷Ⅱ組同期比較，▲P<0.05；抑制劑組與相應(yīng)藥物組即⑤組與④組、⑦組與⑥組相比，□P<0.05。

圖1 各組對(duì)細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響(茜素紅染色，×40) A：空白對(duì)照組； B：陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組；C：淫羊藿次苷Ⅰ組；D：淫羊藿次苷Ⅱ組；E：抑制劑組；F：淫羊藿次苷Ⅰ+抑制劑組；G：淫羊藿次苷Ⅱ+抑制劑組(放大倍數(shù)×40)Fig.1 Effects on mineralized nodule in BMSCs in each group (Alizarin red staining, ×40). A: Blank control group; B: Positive transformation solution group; C: Icariin I group; D: Icariin II group; E: Inhibitor group; F: Icariin I + inhibitor group; G: Icariin II + inhibitor group (×40)

2.3 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中BGP、COL-Ⅰ、BMP-2蛋白表達(dá)的影響

BGP、COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在第12天達(dá)到了高峰值。與空白對(duì)照組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組細(xì)胞BGP、COL-Ⅰ、BMP-2表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照液組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組各因子蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其活性已達(dá)到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組的80%以上；相應(yīng)抑制劑組細(xì)胞BGP、COL-Ⅰ、BMP-2表達(dá)量均顯著降低，即⑤組與④組相比及⑦組與⑥組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，淫羊藿次苷Ⅰ對(duì)促進(jìn)BGP蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于淫羊藿次苷Ⅱ，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì) COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表達(dá)量，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳如表3。

組別BGP COL-1 BMP-2 ①空白對(duì)照組26.304±0.2456.121±0.3717.225±0.128②陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組51.263±0.661★12.371±0.316★11.833±0.233★③抑制劑組25.688±0.635△5.379±0.152△5.0285±0.129★△④淫羊藿次苷Ⅰ組44.879±0.919★△▲10.507±0.251★△9.548±0.193★△⑤淫羊藿次苷Ⅰ+抑制劑組33.359±1.424★△□7.578±0.259★△□7.239±0.149★△□⑥淫羊藿次苷Ⅱ組40.951±0.919★△10.145±0.326★△9.364±0.099★△⑦淫羊藿次苷Ⅱ+抑制劑組32.515±1.233★△□7.358±0.176★△□7.223±0.091△□

注：與空白對(duì)照組比較，★P<0.05；與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組比較，△P<0.05；淫羊藿次苷Ⅰ組與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，▲P<0.05；抑制劑組與相應(yīng)藥物組即⑤組與④組、⑦組與⑥組相比，□P<0.05。

2.4 對(duì)BMSCs骨向分化過(guò)程中BMP/RunX2/OSX信號(hào)通路相關(guān)因子ALP、BGP、Osterix、Runx2 mRNA表達(dá)的影響

淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均可上調(diào)ALP、BGP，Runx2，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)其下游基因Osterix的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組ALP、BGP，Runx2及Osterix mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照液組比較，淫羊藿次苷Ⅰ對(duì)各因子mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其活性較強(qiáng)。淫羊藿次苷Ⅱ?qū)LP、Osterix的mRNA表達(dá)與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異；相應(yīng)抑制劑組相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量明顯降低，即⑤組與④組、⑦組與⑥組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，對(duì)Osterix因子mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，后者明顯強(qiáng)于前者，對(duì)其他各因子mRNA的表達(dá)二者無(wú)顯著性差異。詳見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞ALP、BGP、Osterix、Runx2 mRNA表達(dá)水平比較Table 4 Gene expression of ALP, BGP, Osterix, and RUNX2 in each group n=5)

注：與空白對(duì)照組比較，★P<0.05；與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組比較，△P<0.05；淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，▲P<0.05；抑制劑組與相應(yīng)藥物組即⑤組與④、⑦組與⑥組相比，□P<0.05。

3 討論

3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞，在一定條件下可以成骨分化。BMSCs向成骨分化的重要表現(xiàn)如早期出現(xiàn)的標(biāo)志物成骨細(xì)胞早期分化程度的堿性磷酸酶及較晚出現(xiàn)的作為成骨細(xì)胞向新骨生成過(guò)程特異性指標(biāo)的骨鈣素等。

3.2 BMP/Runx2/Osx信號(hào)通路與成骨分化

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)超家族的一員，可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞功能。如BMP-2是促進(jìn)骨形成最重要的細(xì)胞外信號(hào)分子之一[11]。成骨細(xì)胞的分化受多種信號(hào)通路調(diào)控，而其中BMP/Smads/Runx2/Osx信號(hào)通路與骨形成密切相關(guān)。BMP-2通過(guò)激活Smads信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)成骨基因轉(zhuǎn)錄如BMP-2、Runx2、Osterix等，而發(fā)揮其成骨作用。該信號(hào)通路同時(shí)受到抑制性smads和細(xì)胞外BMPs拮抗劑(如Noggin)等的調(diào)控[12]。

Runx2作為BMP-2的靶基因，直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，包括骨鈣素、I型膠原和堿性磷酸酶等，在骨形成的多個(gè)階段起調(diào)控作用。Osterix是Runx2的下游靶基因，受到Runx2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Osterix是成骨細(xì)胞晚期分化所必需的特異性轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種重要的成骨基因的表達(dá)，如OC、骨粘素、骨橋素、骨鈣素和Ⅰ型膠原蛋白等，對(duì)骨細(xì)胞的分化成熟和骨質(zhì)形成有重要影響。Osterix與 Runx2調(diào)控成骨細(xì)胞不同的分化階段。

本實(shí)驗(yàn)茜素紅染色對(duì)細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響結(jié)果表明，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞增殖分化的趨勢(shì)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均能促進(jìn)ALP細(xì)胞活性，促進(jìn)BGP、COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表達(dá)量，且隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，至第12天達(dá)到最高。與陽(yáng)性對(duì)照液組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組仍存在顯著性差異，但其活性已達(dá)到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組的80%以上。淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，淫羊藿次苷Ⅰ對(duì)ALP活性、BGP蛋白表達(dá)均明顯強(qiáng)于淫羊藿次苷Ⅱ；對(duì) COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表達(dá)量，兩者無(wú)顯著性差異。

RT-PCR結(jié)果顯示，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均可顯著上調(diào)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ALP、BGP、Runx2，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)其下游基因Osterix的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，具有顯著性差異(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照液組比較，淫羊藿次苷Ⅰ對(duì)各因子蛋白表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.05)，但其活性較強(qiáng)。淫羊藿次苷Ⅱ?qū)LP、Osterix的mRNA表達(dá)與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異；淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，對(duì)Osterix因子mRNA的表達(dá)，二者具有顯著性差異(P<0.05)，后者明顯強(qiáng)于前者；對(duì)ALP、BGP、Runx2因子mRNA的表達(dá)二者無(wú)顯著性差異。

本研究表明，中藥淫羊藿中的主要有效成分淫羊藿苷的代謝產(chǎn)物淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ，在體外能通過(guò)激活BMP/Runx2/Osx信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)，提示可能通過(guò)促進(jìn) BMP-2蛋白，繼而調(diào)控靶基因Runx2、Osterix的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs的成骨轉(zhuǎn)化。BMP信號(hào)通路的阻滯劑(1 μg/mL Noggin重組蛋白)能明顯抑制1×10-5mol/L淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ?qū)MSCs定向成骨分化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與翟遠(yuǎn)坤等[9]研究的淫羊藿次苷Ⅱ促進(jìn)BMSCs成骨性分化的活性高于淫羊藿苷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。

但是，其促進(jìn)BMSCs定向成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能含有多條且交錯(cuò)成網(wǎng)，其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。賀龍剛[13]等研究結(jié)果證明，淫羊藿次苷Ⅰ及其代謝產(chǎn)物淫羊藿次苷Ⅱ在體外均能通過(guò)AP-1/NFATc1信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞生成，且淫羊藿次苷Ⅱ作用優(yōu)于淫羊藿次苷Ⅰ。翟遠(yuǎn)坤等[14]研究表明，淫羊藿次苷Ⅱ通過(guò)激活雌激素信號(hào)通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨性分化。但通過(guò)BMP/Runx2/Osx信號(hào)通路研究淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ?qū)Υ笫蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究本文尚屬首次。

同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿次苷Ⅰ對(duì)ALP活性、BGP蛋白表達(dá)促進(jìn)作用顯著強(qiáng)于淫羊藿次苷Ⅱ；淫羊藿次苷Ⅱ?qū)sterix mRNA的表達(dá)要明顯強(qiáng)于淫羊藿次苷Ⅰ。淫羊藿次苷Ⅰ雖然能夠促進(jìn)ALP活性、BGP蛋白表達(dá)，但對(duì)下游Osterix基因表達(dá)作用弱于淫羊藿次苷Ⅱ。該結(jié)果提示可能與兩者化學(xué)結(jié)構(gòu)上3位和7位取代基的不同有關(guān)。另外，淫羊藿次苷Ⅱ?yàn)橐蜣酱诬闸耋w內(nèi)代謝產(chǎn)物，提示淫羊藿次苷Ⅰ可能通過(guò)生物轉(zhuǎn)化成淫羊藿次苷Ⅱ，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)BMP/Runx2/Osx信號(hào)通路下游基因的調(diào)控，從而促進(jìn)BMSCs定向成骨分化。這些可能是兩者活性差異的主要原因，但具體機(jī)理還需做進(jìn)一步的研究。